胎盘活性肽的研究进展

胎盘功能活性肽的研究进展

摘要：胎盘是哺乳动物妊娠期间由胚胎的胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间交换物质的过渡性器官。胎盘中含有丰富活性多肽和蛋白质。本文主要涉及对胎盘中活性肽的提取制备、结构及其特殊功能进行的综述。并对胎盘活性肽研究进行相关的展望和相关问题的分析。

关键词：胎盘；活性肽；制备；功能

Abstract: The placenta are mammals by embryonic germ membrane during pregnancy and maternal endometrial joint grow for the exchange of material between mother and son transitional organs.The placenta is rich in active peptides and proteins. This article mainly involves to the extraction of active peptide in placenta of preparation, structure and their special features are reviewed. And looks forward to related to the placental active peptide research and analysis of related issues.

Key words: placenta;bioactive peptide;preparation;function

随着科技的进步现代医药及医学的快速发展，原本自然界不存在或者很少存在的物质被大量合成出来被用于医学治疗，这样就造成了大量的抗药性人群和抗药性的菌株。源于自然又高于自然的理念被越来越为广大科学工作者所接受，胎盘的利用就是一个很好的例子。在胎盘的应用方面以瑞士的羊胎素和日本的莱乃康LAENNEC人胎素制剂在美容抗衰老上最为著名。

胎盘又叫胞衣是哺乳类动物妊娠期间由胚胎的胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间交换物质的过渡性器官。胎盘可合成和分泌多种多肽类激素，具有补气养血、增强机体免疫力及延缓皮肤衰老等功效[1,2]。自1985年刘月新报道采用“匀浆-透析法”提取胎盘肽(又称胎盘因子,胎盘免疫调节因子)以来,广大科研工作者对胎盘肽进行了大量的理化分析与生物活性测定,并就其在临床用于治疗病毒性肝炎、白细胞减少症、重症肌无力等免疫性疾病以及恶性肿瘤等作了大量的观察,取得了较为理想的疗效[3]。

生物活性肽是具有特殊生理功能的肽。以前，人们主要认为氨基酸是人体吸收蛋白质的主要途径，近年来，科学家经研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后，

主要以小肽形式吸收，比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用，这是肽研究理论实践重大突破[4]。在哺乳类动物胎盘中提取出来的多肽具有抗氧化、防衰老、增强机体免疫、抑菌和促进细胞繁殖上面具有很高的功效。

1 生物活性肽的生理功能

（1）类吗啡活性肽（神经活性肽）：可起到镇痛及调节人体情绪、呼吸、脉搏、体温作用；（2）具有激素或调节激素功能，这些肽通过自身作为激素或调节激素反应而产生多种生理作用；（3）具有免疫活性；（4）作为酶调节剂；（5）促进矿物质吸收利用：酪蛋白磷酸肽可作为无机离子载体促进肠膜对Ca、Fe、Se、Zn等，尤其是Ca的吸收和利用，提高动物受精能力，调节血压，还具有明显抗蛀牙、防止钙质流失等诸多生理功能；（6）具有抗氧化作用；谷胱甘肽在体内与过氧化物酶共轭使体内过氧化氢和过氧化脂质还原，具有保护生物体膜、守卫生物体的作用[5]。

2 胎盘功能活性肽的制备及其功能应用

生物活性肽生产制备方法和途径有三条:一是从自然界生物体中提取其本身固有各种天然性肽类；二是通过蛋白质降解途径可获得具有各种生理功能活性肽；三是合成方法制备生物活性肽，包括化学合成法、酶合成法和重组DNA技术合成法。从天然生物体提取生物活性肽，生物体含量很低，加工成本却很高，且大量提取会造成物种资源萎缩；另外，提取生物活性肽残存有机溶剂又会带来毒性问题。化学合成法常用于合成高营养价值、中等长度的医药用肽，但采用这种方法制取活性肽反应底物和反应剂价格高，反应中会产生有害物质[6]。

2.1 胎盘肽的水溶液提取及其功能应用

胎盘中存在大量的水溶性成分，包括水溶性蛋白、水溶性多肽等。古今中外胎盘都是作为一种很好的药用物质，在治疗某些疾病上面具有很好的功效。

在灵长动物体内尿酸是嘌呤代谢的产物，它不能通过肾小球进行再吸收，只有10%的尿酸能通过尿排出体外，尿酸的控制受到酶控和非酶控的调节控制[7]。少量的尿酸在人体内是一种高效的自由基清除剂，在正常人的血液中一般维持在0.3—0.5mM，尿酸能够作为一种类似于谷胱甘肽酶和过氧化氢酶的作用在体内清除内源性产生的过氧化氢的有害物质[8]。然而过量的尿酸就会是痛风、心脑血管疾病、肾脏疾病的主要诱发因素[9,10]。日本科学家Satoshi Watanabe[11]等发现

利用人胎盘提取物在治疗尿酸症状上面比以往传统仅仅利用别嘌呤醇作为唯一黄嘌呤氧化酶抑制剂具有无毒副作用，疗效好，但是并没有发现到底是什么物质的存在对尿酸症的产生起到了作用。

王善辉[12]等人利用山羊胎盘肽来喂食幼犬，发现幼犬血液白细胞总数、ANAE+淋巴细胞百分率、血清球蛋白含量、血清中溶菌酶活性与给药前相比均明显增加,并且中剂量组、高剂量组与给药前相比差异显著或极显著(P<0. 05,P<0.

01)。同时犬血清总抗氧化能力、血清谷胱甘肽过氧化物酶活性及超氧化物歧化酶活性均较给药前相比有所增强,血清丙二醛含量与给药前相比明显减少,并且中剂量组、高剂量组与给药前相比差异显著或极显著(P<0.05,P<0.01)。实验结果提示中剂量(2 mg/kg·bw)、高剂量(4 mg/kg·bw)羊胎盘肽可提高幼犬的免疫功能和抗氧化能力,从而提高幼犬的抗病防病能力。

周国华[13]等利用超滤法从羊和猪胎盘中提取出了胎盘肽,采用改良的加脲Tricine-SDS-PAGE电泳法测定羊胎盘肽的分子量为4386Da;利用紫外光扫描得其最大吸收峰分别为225.4 nm和209.6 nm;并通过建立体外抑制兔淋巴细胞模型,利用MTT比色法测定所提取胎盘肽的免疫调节作用，结果显示：羊和猪胎盘肽均可使顺铂抑制的兔外周血T淋巴细胞的转化率显著提高，其中羊胎盘肽以1:102、1:103和1:104三组效果最为明显(P<0.01)；而猪胎盘肽以1:102、1:103两组效果最为明显(P<0.01)。

免疫活性肽普遍存在于动物胎盘、胸腺等组织中，应用广泛，然而其成分复杂，且从中提取出单一有效成分的报道不多。目前分离纯化活性肽的方法有很多，吴开平等[14]采用凝胶层析法从羊胎盘提取液中分离出纯度为98.89% 的SPIF-I 组分，吴绵斌等[15]利用阴阳离子交换色谱纯化胸腺肽β4，纯度为90.1%。

刘隆兴[16]等利用常规方法制备羊胎盘超滤液用反相高效液相色谱（RP-HPLC）仪对羊胎盘提取液分离纯化及纯度分析，并利用 E-玫瑰花环实验对各组分进行免疫活性评价，Edman 降解法对其组分进行N端测序。结果：利用RP-HPLC 工艺成功分离出三种纯度较高的小分子肽，并确定其中两者具有免疫活性，对活性较强的肽进行测序、检索表明为未知组分。将峰2-3 用Edman降解法测序其N 端前10个氨基酸序列为：Trp-Glu-Pro-Asn-Val-Ser-Ala-His-Ala-Phe，将该氨基酸序列输入到蛋白质数据库

中查寻，未查询到与该肽同源性相似的蛋白质，故推测为一新肽。

房心平[17]等利用牛胎盘采用水溶性提取法，提取出来的水溶性多肽进行分离纯化对经过以上纯化操作得到的多肽采用基于不同分离机理的反相高效液相层析和分析电泳（CE）进行纯度鉴定。两种分离方法得到的牛胎盘水溶性免疫活性肽均只出现一个单峰，证明经多步分离纯化得到的牛胎盘水溶性免疫活性肽为纯品。也以此证明在牛胎盘中存在纯度很高的活性肽。

2.2 胎盘酶解生物活性肽的制备

酶解蛋白质制备生物活性肽需进行控制酶解，如筛选适宜的酶、确定适宜的水解时间、pH、水解温度、底物浓度、酶/底物及水解度（DH）等，这样可得到分子量大小适宜且包含特定氨基酸序列的肽段，一般说来小分子肽特别是二肽、三肽等往往可表现出较高的营养价值和生理效应，而大分子长肽则可改善“母体”蛋白质的功能特性[18]；如对酶解过程不加控制，则只能得到功能特性及生物活性均较低的小分子肽和游离氨基酸。大多数蛋白质的酶解过程为：原料蛋白→预处理→酶解→分离→精制→成品[19]。蛋白质的可控酶解制备具有特殊功能的活性肽已经越来越受到科研工作者的重视。一些动物、植物蛋白可在适宜的条件下经酶解产生具有抗氧化活性的肽。植物蛋白主要以大豆蛋白、玉米蛋白等研究较多[20]，也包括其它植物如昆清阿黎籽蛋白的酶解物具有清除自由基的效应[21]。而动物蛋白则以乳蛋白、海产蛋白及胶原蛋白研究较多，如Peňa-Ramos 将乳清蛋白和大豆蛋白的酶解物添加在猪肉饼中以达到抗氧化的效果[22]；韩国的Se-Kwon K 等人利用鱼类加工厂的废弃鱼皮经三步酶解制得了抗氧化肽；Suetsuna,K.及Hattori, M 等人则分别利用沙丁鱼、酪蛋白及不溶性弹性蛋白水解制得了抗氧化肽[23~25]。

对含蛋白质多的物质进行酶解得到功能活性肽已经多现于国内外的报道，对胎盘底物进行酶解获得具有特殊功能的活性肽已被很多人进行了尝试。宋晓燕[29]等选用胃蛋白酶为水解酶，采用响应面法(RSM)优化羊胎粉水解条件，制备抗氧化多肽。研究反应温度、pH、酶与底物浓度比(w/w)对水解度(DH)和产物还原能力的影响，水解条件不同对水解度和铁还原力都有显著性影响(p<0.05)。结果表明，水解产物还原力最强的工艺条件为：温度36.48 ℃，pH1.05，酶与底物浓度比(w/w)2.03%。朱蓓薇[30]等采用现代生物酶解技术制备羊胎盘生物活性肽,

以水解度(DH)和酸溶性肽得率(YASP)为指标,在单酶水解的基础上探索更加有效的新工艺——双酶水解工艺。实验确定了木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的等活力混合酶为水解羊胎盘的最佳双酶组合。

房心平[17]等利用牛胎盘水溶性物质提取后的底物作为下脚料，利用蛋白酶进行一系列的酶解工艺优化，最后发现混合酶水解牛胎盘下脚料优于中性蛋白酶，而且必需氨基酸-赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的含量分别高达13.28%、13.34%和8.70%。并对酶解产物依次进行纳滤、超滤的分离，反相高效液相层析、 酶解产物的液质联用(LC-MS)分析。牛胎盘下脚料经过中性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解作用后的相对分子质量分布范围主要集中在200-50000之间。再对牛胎盘进行双酶水解的优化工艺处理之后并对酶解液进行超滤和纳滤的分离将具有显著的促进淋巴细胞增殖活性的纳滤产物上样到Lichrospher C-18 反相层析柱上进行纯化。纯化收集反相层析得到的11 个组分并进行体外促进淋巴细胞增殖实验。对细胞增殖比较明显的进行RP-HPLC、液质联用分析可能的氨基酸序列为Gly-Gly-Ser-Thr 或Gly-Gly-Thr-Ser。通过紫外检测、基质辅助激光解吸附飞行时间质谱、毛细管等电聚焦电泳和蛋白质测序对牛胎盘水溶性免疫活性肽基本理化性质测定表明，多肽可能含有芳香族的Trp、Tyr、Phe 残基；相对分子质量为2134；等电点为 3.82；序列为Tyr-X-Phe-Leu-Gly-Leu-Pro-Gly-X-Thr(X-未确定的氨基酸)。

在酶解底物制备活性肽的条件上存在酶与底物溶液难分离的难题，酶作为一种蛋白质的存在对活性肽的功能到底有没有影响一直都没有得到确定。

3 胎盘肽功能与构效关系

肽类不仅在油溶体系中能发挥抗氧化效果，而且在水溶体系、乳化体系及干燥体系中均有较高的抗氧化活性[31~32]；同时肽具有良好的增效作用，如双肽对α,δ-生育酚就有显著的增效作用。肽的抗氧化机理至今尚不完全清晰，但已有证据表明，活性肽可以通过以下几个作用实现抗氧化和清除自由基：1）螯合金属离子，很多蛋白质来源的肽表现出鳌合金属离子的作用，从而抑制了以金属离子为辅酶或辅基的脂质过氧化反应[33]；2）作为供氢体或供电子体清除游离基或抑制脂肪氧化，酪蛋白来源的肽具有清除自由基的活性；而胶原蛋白及蛋黄多肽则可抑制脂肪酸的氧化[34]；3）促进过氧化物的分解。

尽管生物活性肽的结构和抗氧化之间的关系尚未完全明晰，但某些肽已表现出普遍的结构特点。酶解过程、分子量大小、氨基酸组成和氨基酸序列都会影响到肽类物质的抗氧化生物活性。

3.1 酶解过程对酶解物功能活性的影响

水解所用的酶对肽的抗氧化性有明显影响，沈蓓英选择酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解实验，将三种蛋白酶解产物加到模拟溶液体系和实物体系中进行抗氧化能力比较，发现抗氧化性能顺序为酸性蛋白酶水解物>胃蛋白酶水解物>中性蛋白酶水解物；刘大川等比较了中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶对大豆分离蛋白的水解，水解能力最强的是碱性蛋白酶2709，其平均水解度接近30%，水解后产生的大豆肽具有较强的抗氧化能力[35]。肽段长短也对肽的抗氧化活性有影响，如果肽段过长，具有抗氧化性的Val、Leu 未能呈现在肽段的C-端和N-端，则抗氧化性显示不出来；而肽段DH 较高时，游离氨基酸含量升高，导致抗氧化活性反而下降，因此控制酶解过程对制备具有抗氧化性的酶解物意义重大

在房心平[17]的实验中其通过不同的酶进行酶解牛胎盘时得到的不同的酶解底物时发现其不同的酶解底物抗氧化效果有不同的抗氧化；效果混合酶的酶解液即呈现显著的促进淋巴细胞增殖活性，并且水解时间越久，活性增殖能力越高。因此初步推断具有最高的促进淋巴细胞增殖活性的混合酶水解产物具有较低的相对分子质量分布，并且其随着酶解时间的延长，产量逐渐增多。

3.2 分子量与抗氧化活性

有研究表明肽的生物活性与分子量大小有关，能在体内起功能活性作用的肽往往是相对分子质量在1000 以下的小肽。具有抗氧化活性的肽类分子量一般都较小，易被肠道吸收而直接在机体中发生作用。一般说来，肽类的抗氧化能力大于氨基酸。Wu 等人认为分子量约为1400Da 的肽在体外具有比900Da和200Da 的肽更好的抗氧化活性[36]。有研究人员选用来自芽孢杆菌的蛋白酶，制备具有抗氧化性的大豆短肽。他们提出具有抗氧化性的多肽片段大多由5-16个氨基酸残基组成，分子量在600-1700范围内[37]。而任国谱则认为分子量在2500-3000 的肽类抗氧化效果最为理想[38]。Jeon etal 采用超滤分离鳕鱼骨架蛋白酶解物，发现截留分子量为10kDa~30kDa的超滤膜的透过液表现出较为优异的乳化性能；

截留分子量为10 kDa 的透过液表现出较高的抗氧化活性；截留分子量为3kDa 的透过液则表现出较强的ACE抑制活性[33]。

周国华等（2005）报道，山羊胎盘肽为微黄色的透明液体，具有可透析性，可超滤性，无热原的小分子多肽，pH 值为 6.7～7.0，紫外吸收集中在220nm～280nm 之间，其最大吸收峰为225.4nm，分子量为4.386KDa。刘宇等（2003）报道，通过低温透析和超虑到的羊胎提取液均为无色透明液体，具有可透析性，可超滤性，pH 值均在 6.8～7.5 之间，在251nm 波长处有一特征吸收，含17 种氨基酸，多肽、核酸、总氮含量和分子量依据不同工艺而定，蛋白质反应阴性，当分别加入同体积的20%磺基水杨酸时，都不出现浑浊或沉淀。刘士山等（2002）报道，羊胚胎盘肽的最高吸收峰在194nm 处，而高利臣（2004）报道，羊胎盘肽的最高吸收峰在253±2nm 处。杨秀芳等（2002）报道，所提取的活性羊胎素为无色、透明的液体，pH 为 6.8～7.6，分子量为3800～5000Da，紫外吸收峰在254～258nm 处。此上科研工作者们所得到的胎盘肽进行抗氧化实验时都具有良好的抗氧化效果。因此可以断定胎盘中的活性肽的大致分子量的范围在4000Da左右。

3.3 氨基酸种类、序列与功能活性

构成肽的氨基酸种类、肽链长度及氨基酸的排列顺序对肽的抗氧化能力有重要影响。氨基酸残基的存在对肽的抗氧化活性很重要如Glu、Leu 及His等对提高肽的自由基清除能力有作用。Riisom等人认为Try 和His 有较强的抗氧化活性，而Gly和Ala活性较弱[39]。芳香氨基酸残基也被认为是较强的自由基清除剂，因为它们可提供质子给含不成对电子的自由基达到淬灭自由基的效果，同时通过共振结构保持自身稳定。也有研究认为含His的肽具有强抗氧化性能，如强抗氧化剂肌肽（β-Ala-His）和从发酵贻贝调味料中提取出的七肽His-Phe-Gly-Asp-Pro-Phe-His都因为含有His而具有较强的抗氧化活性[40]。含His 的肽之所以具有抗氧化性，与它结构中的His关系密切，因为His上的咪唑环可以螯合金属离子，清除脂质自由基，同时His的疏水性也使肽与脂肪酸更好地结合[41]。研究还发现由支链氨基酸Phe、Leu、Ile 等组成的肽可表现出抗氧化活性；Kawashima等人的研究则认为含碱性氨基酸的活性肽可作为电子受体夺取不饱和脂肪酸氧化形成的自由基的电子从而阻断因自由基引发而造成的不饱和脂

肪酸氧化链的延长[42]。

除此之外，氨基酸的序列对抗氧化性也很重要。Chen等人分离到6个抗氧化肽，由5~16个氨基酸构成，N 末端为疏水氨基酸Val或Leu，多次重复Pro、His或Tyr 的顺序；将这几种单体氨基酸混合在一起后并不表现出抗氧化活性，说明氨基酸的序列才是真正让肽表现出抗氧化活性的原因[43]。Se-Kwon K酶解得到分子量在1500-4500Da 的抗氧化肽，经分离纯化后得到分别由16 个和13 个氨基酸组成的肽段，二者的 C 末端均为Gly。Suetsuna等人对酪蛋白的酶解产物氨基酸序列与对O2·-清除能力的关系进行了分析，发现EL>YFYPEL>FYPEL>PEL，由此可知，Glu-Leu 序列的存在对肽的抗氧化活性十分重要[33]。以Ala 为N-端的双肽中，Ala-Tyr、Ala-His 和Ala-Try 的抗氧化能力很强，其它双肽也都比构成它们的氨基酸的抗氧化能力强。唯一例外的情况是三肽Gly-Gly-Gly，其抗氧化能力比Gly 的双肽及Gly 本身都弱。实验还证明以Met和His 作为C-末端的双肽抗氧化能力大，相反Try 及Tyr 位于N-末端的抗氧化力强。所有的抗氧化肽基本都含有Pro 残基，但Pro 肽却极易氧化。Chen 等人确认大豆酶解物的抗氧化性基于活性肽Leu-Leu-Pro-His-His 序列的存在[44]。

经过检测胎盘中的氨基酸含量大致分布在羊胎盘活细胞素的水解产物中,共检出16种常见的氨基酸,其中Glu 含量最高，约占氨基酸总量的16.07%，16 种氨基酸中有8种是人体必需氨基酸,分别是Pro、Lys、Leu、Ile、Met、Val、His、Thr，约占氨基酸总量的33.5%。胎盘提取物中的Glu和Leu含量高这可能与其存在大量的Glu-Leu片段有关。房心平在牛胎盘中测定出一种较好免疫效果的活性肽，它的相对分子质量为2134；等电点为 3.82；结构序列为Tyr-X-Phe-Leu-Gly-Leu-Pro-Gly-X-Thr(X-未确定的氨基酸)。

除了氨基酸的组成和序列会影响肽的抗氧化性以外，蛋白质酶解后疏水性的增加据称也与抗氧化活性的提高有关[45]；如胶原蛋白中含有大量的疏水氨基酸，经酶解后，含疏水氨基酸的肽大量释放出来，参与到酶解物的抗氧化进程中，这些疏水氨基酸与油有较好的亲和力且具有较好的乳化性，可在亚油酸体系中发挥较好的抗氧化功能[28]。

4 胎盘活性肽的应用前景及存在的问题

蛋白活性肽已经得到越来越多的应用，抑菌肽、降压肽、免疫活性肽等许多具有功能活性的肽类物质已有了广发的开发。

选择适宜的蛋白酶来制备蛋白水解物成为了当前蛋白质制品的发展方向[46]，特别是海洋生物、食品废弃物或低价值食品原料成为了酶解制备生物活性肽的首选原料。目前日本、西欧和美国的市场上已有蛋白质酶解产品，日本以蛋白水解物为基料的医药品市场规模每年超过200亿日元，食品也在80 亿以上，日本的森水、明治、雪印等公司已开发出相对分子量在1000 以下的肽制品并应用于过敏和高血压等患者食用的保健食品中[47]。我国的蛋白酶解物和活性肽的研究相对落后，有关研究刚刚起步。过去主要以大豆蛋白、乳蛋白、蛋清蛋白等为原料开发提取蛋白水解物，近年来有关畜肉、动物血及水产品的研究和开发受到重视[48]。国外对鱼肉蛋白的酶解利用主要集中在对近海鱼类的水解如沙丁鱼、太平洋白鱼肉、牙鳕等[49-50]，国内对蛋白水解的研究较少，主要是利用一些低价值海鱼及鱼的下脚料（如鲢鱼内脏、皮骨等）进行酶解，研究特性也主要集中在风味强化、表面功能特性（如乳化稳定性、发泡性、水合性等）和营养改善方面，对大宗养殖淡水鱼的研究几乎没有，对鱼类蛋白质水解产物的生物活性如抗氧化活性、降血压、抗菌性及增强免疫力方面的研究也涉及较少。

在酶解胎盘制备活性肽的条件下存在酶与底物溶液难分离的难题，甚至也没有搞明白酶的存在到底对酶解底物存不存在影响，因此有人提出用固定化酶法来酶解底物，但这种方法在已有杂志上并没有刊载出来。

在用特定的酶来酶解的基础上，有些科研工作者开始寻求利用产蛋白酶的微生物来进行产酶分解和蛋白质的合成。杨秋明[51]等利用米曲霉来定向发酵鱼骨。李树明[52]等利用白酒丢槽来筛选较优菌株进行产酶分解和蛋白质的合成来生产饲料发现白地霉、黑曲霉、绿色木霉和热带假丝酵母效果最好，发酵后白酒丢糟的蛋白质质量分数提高了6.49%以上；对这4种菌进行组合筛选，发现由黑曲霉、绿色木霉和白地霉组合发酵，能将白酒丢糟的蛋白质质量分数提高9.96%。但是这些微生物发酵来产蛋白酶进行酶解获取蛋白肽和蛋白质仅限于动物饲料之类的东西，用微生物以此来获得供人类消费的东西还鲜有报道。对胎盘之类的东西进行发酵更是少之又少，一方面是由于微生物发酵之后很多成分难以分离、检测和控制：另一方面是发酵之后的产物很复杂安全性很难进行评估。尽管如此

用微生物来发酵制备活性肽的前景依然很是广阔。

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