医学基础免疫学实验指导解析

医学基础免疫学实验指导

主编金伯泉李恩善

免疫血清的制备

淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

免疫球蛋白纯化技术

盐析法纯化免疫球蛋白

DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白

SPA-Sepharose CL-4B 亲和层析纯化IgG及IgG亚类

高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

单克隆抗体亲和层析柱纯化重组人α2a干扰素(rHuIFN-α2a)免疫球蛋白标记技术

酶标记抗体

荧光素标记抗体技术

125I标记单克隆抗体技术

标记抗体的应用

ELISA

BA-ELISA

免疫斑点试验

化学发光免疫分析

125I标记单克隆抗体竞争结合试验

细胞分离纯化技术

Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞

溶血空斑形成试验

细胞表面标记的检测技术

碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)免疫组化染色技术检测淋巴细胞表面标记

活细胞免疫荧光技术──流式细胞仪标本的制备

淋巴细胞增殖功能的测定

人脐带静脉内皮细胞的分离培养与增殖试验

杀伤细胞功能的检测

自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的杀伤功能

混合淋巴细胞培养

细胞因子生物学活性的检测

白细胞介素-1生物学活性检测

Con A 刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性

应用EL-4、CTLL检测IL-1生物学活性

白细胞介素-2生物学活性检测

白细胞介素-6生物学活性检测

干扰素生物学活性检测

肿瘤坏死因子-α生物学活性检测

细胞因子及其受体的免疫学方法检测

夹心法ELISA检测人可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)

夹心法ELISA检测人白细胞介素8(IL-8)

夹心法ELISA检测人α2a、α2b干扰素(IFN-α2a、α2b)

免疫血清的制备

撰稿李恩善

免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂(如用于制备免疫标记抗体等)，也可供特异性免疫治疗用。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。

原理

免疫方法

放血

分离血清

结果鉴定

材料

注意事项

一、原理

具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物(即多克隆抗体)。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，牨m现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。

二、免疫方法

根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。

1. 用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；

2. 第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

3. 第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧窝及鼠蹊部皮下。

4. 间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。

5. 若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。

三、放血

(一) 心脏采用血法

1. 家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；

2. 剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；

3. 用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位；

4. 用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死；

5. 将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。

(二) 颈动脉放血法

1. 家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤；

2. 沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌；

3. 分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离；

4. 于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住；

5. 用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；

6. 松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。

四、分离血清

将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。

五、结果鉴定

以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。

六、材料

(一) 动物：健康成年家兔，雄性，体重2～3公斤。

(二) 器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。

(三) 试剂

1. 灭菌生理盐水；

2. 纯化人IgG(10mg／ml)；

3. 消毒酒精及碘酒；

4. 羊毛脂；

5. 石蜡油；

6. 活卡价苗(BCG)(75mg／ml)；

7. 弗氏不完全佐剂(FIA)制备：称羊毛脂10克，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高压灭菌(8磅20分钟)后保存备用。

8. 弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：将FIA予温(60℃30分钟)，吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG(75mg／ml)0.5ml及纯化人IgG2.5ml(2.4mg ／ml)牨_滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

七、注意事项

1. 免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。

2. 免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡(频率2900转／分，振幅6mm)；后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。

3. 佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物(0.005mgN)产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠其次是家兔，当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。

4. 抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以0.5mg／kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。

5. 免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6

点皮下注射，同时于两侧肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一处。每点注0.2ml，间隔2周后再于上述部位选不同点同上注射，也可产生高效价的免疫血清。

淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

撰写刘雪松

1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

细胞融合前准备

细胞融合，选择杂交瘤

抗体的检测

杂交瘤的克隆化和冻存

单克隆抗体的大量生产

单克隆抗体的鉴定

影响因素、失败原因分析

一、细胞融合前准备

(一) 免疫方案

选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)

↓2～3周后

第二次免疫1×10７／0.5ml ip

↓3周后

加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)

↓

取脾融合

2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)

↓3周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

│(ip剂量不宜超过0.5ml)

↓3周后

第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip

│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)

↓2～3周后

加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv

↓3天后

取脾融合

目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

(二) 饲养细胞

在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

小鼠腹腔巨噬细胞的制备

小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄

↓

拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟

↓

用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

↓

用无菌注射器注入6～8ml培养液

↓

反复冲洗，吸出冲洗液

↓

放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟

↓

用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml

↓

加入96孔板，100μl／孔

↓

放入37℃CO

孵箱培养

2

一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为

1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。

(三) 骨髓瘤细胞

骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。

常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。

骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。

一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT

的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。

保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。

(四) 免疫脾细胞

免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。

二、细胞融合，选择杂交瘤

(一) 细胞融合流程

(1) 取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

(2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

(3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml 塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

(6) 在室温下融合:

①30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。

②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

(7) 离心，800rpm，6分钟。

(8) 弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

(9) 根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

(10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO

孵箱培养。

2

一般一块96孔板含有1×107脾细胞。

(二) HAT选择杂交瘤

应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。

一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。

因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。

50×HAT

H: 5×10-3M

A: 2×10-5M

T: 8×10-4M

一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。

三、抗体的检测

筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有:

1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。

2. RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。

3. FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。

4. IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。

可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

四、杂交瘤的克隆化和冻存

克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)

分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

(一) 克隆化方案

用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

1. 有限稀释法的程序

①制备饲养细胞悬液(同融合前准备)

②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml

③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml

含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。

④培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。

⑤第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。

注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

2. 软琼脂法

①软琼脂的配制

含20％FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640

1％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

②用上述0.5％琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

③按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。