第八章 高效液相色谱法及临界流体色谱法
第八章高效液相色谱法及临界流体色谱法
基本要求：
1. 了解高效液相色谱法的优点及适用范围
2. 理解常用检测器的原理、优缺点及适用范围
3. 理解各种分离方式的原理及适用的分析对象及选择原则
4. 理解超临界流体色谱法的原理、优缺点及适用范围
高效液相色谱法是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析方法。它是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论和技术而发展起来的，因此气相色谱的许多理论与技术同样适用于高效液相色谱。
高效液相色谱法与气相色谱法的主要差别在于流动相和操作条件。在气相色谱中，流动相是惰性的气体，分离主要取决于组分分子与固定相之间的作用力，而在高效液相色谱中，流动相与组分之间有一定亲和力，分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果，分离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关。高效液相色谱一般可在室温下进行。由于采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，加上流动相粘度高，必须采用高入口压，以维持一定的流动相线速。
高效液相色谱法与经典液相色谱法的主要差别在于固定相的性质和粒度等。高效液相色谱所用固定相颗粒细而规则，孔浅，能承受高压，加上使用高压输液设备和高灵敏度的检测器，其分离效率、分析速度和灵敏度都远远高于经典液相色谱法。
原则上，只要能溶解在流动相中的物质都可以用高效液相色谱分析，尤其适合那些不宜用气相色谱分析的难挥发性物质、热不稳定性物质、离子型物质和生物大分子等。在目前已知的有机化合物中，有80%的有机化合物能用高效液相色谱法分析。由于此法不破坏样品，因此可方便地制备纯样。
8．1 固定相和流动相
8.1.1 固定相
高效液相色谱固定相按承受的高压能力可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，它可以承受较高的压力，若在它的表面键合各种功能团，其应用更广泛。硬胶由聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成，承受压力较低，主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。
固定相按孔隙深度可分为表面多孔型和全多孔微粒型两大类，如图8—1所示。表面多孔型是在实心玻璃外面覆盖一层多孔活性物质，如硅胶、氧化铝、离子交换剂和聚酰胺等，其厚度为1-2μm，以形成无数向外开放的浅孔。全多孔微粒型由直径为10-3μm数量级的硅胶微粒凝聚而成。
图8-1 高效液相色谱固定相类型
(a) 表面多孔型; (b) 全多孔微粒型
表面多孔型固定相的多孔层厚度小、孔浅、相对死体积小，出峰快，柱效高。但因多孔层厚度小，最大允许进样量受限制。
全多孔微粒型固定相颗粒细，孔仍然浅，因此传质速率仍很快，柱效高，但需更高的操作压力。最大允许进样量比表面多孔型大5倍。因此，通常采用此类固定相。
根据分离模式的不同而采用不同性质的固定相，如活性吸附剂、键合有不同极性分子功能团的化学键合相、离子交换剂和具有一定孔径范围的多孔材料，从而分别用作吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱及尺寸排阻色谱固定相,见表6—1。
8.1.2 流动相
高效液相色谱中，流动相对分离起着极其重要的作用，在固定相选定之后，流动相的选择是最关键的。不论采用哪一种色谱分离方式，对用作流动相的溶剂的要求是：
(1) 纯度高溶剂的纯度极大地影响色谱系统的正常操作和色谱分离效果。溶剂中若存在杂质会污染柱子，存在固体颗粒会损害高压泵或输液通道，使压力升高，基线漂移。
(2) 粘度低高效液相色谱中为获得一定流速必须使用高压，若溶剂粘度较高，操作压力也更大。高的压力会使色谱柱性能降低，而且泵也容易损坏。
(3) 化学稳定性好流动相不能与固定相或组分发生任何化学反应。
(4) 溶剂沸点要高于55℃低沸点溶剂挥发度大，容易使流动相浓度或组成发生变化，也容易产生气泡。
(5) 溶剂要能完全浸润固定相溶剂对所测定的组分要有合适的极性，最好选择样品的溶剂作流动相，否则发生溶剂与流动相不相混溶的情况，使分离变坏。
(6) 溶剂要与检测器匹配溶剂要适合于检测器，例如采用示差折光率检测器，必须选择折光率与样品有较大差别的溶剂作流动相；若采用紫外吸收检测器，所选择的溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收。
8．2 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪主要由贮液器、脱气器、高压泵、进样器、色谱柱和检测器等组成。如果8-2所示。
图8-2 高效液相色谱仪示意图
8.2.1 贮液器
贮液器用于存放溶剂。溶剂必须很纯，贮液器材料要耐腐蚀，对溶剂呈惰性。通常采用1-2L的大容量玻璃瓶，也可用不锈钢制成。贮液器应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内。溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成，孔隙大小一般为2μm。
8.2.2 脱气装量
脱气的目的是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检测。通常用氦气鼓泡来驱除流动相中溶解的气体。因为氦气在各种液体中的溶解度极低。先用氦气快速清扫溶剂数分钟，然后以极小流量不断流过此溶剂。
8.2.3 高压泵
高压泵用于输送流动相，其压力一般为几MPa至数十Mpa。这是因为液体的粘度比气体大102倍，同时固定相的颗粒极细，柱内压降大，为保证一定的流速，必须借助高压迫使流动相通过柱子。
高压泵应无脉动或脉动极小，以保证输出的流动相具有恒定的流速。采用脉动阻尼装置可将产生的脉动除去，使流动相的流量变动范围不宜超过2-3%。
泵应耐压、耐腐蚀、密封性好。
泵有恒压泵和恒流泵两类。
恒压泵输出的压力恒定，如气动放大泵。具有一定压力的气体作用在一个大面积活塞上，大面积活塞又驱动一个小面积活塞，小面积活塞承受的压力是大面积活塞的几十倍，从而得到压力恒定的流出液。缺点是泵腔体积大，且流量随外界阻力而改变，不适于梯度洗脱。它正逐渐被恒流泵所取代。
恒流泵输出的流量恒定，如往复柱塞泵、螺旋传动注射泵等。它与恒压泵不同，通常
用电驱动活塞，当活塞迅速向上运动时，由于减压使入口止逆阀开启，出口止逆阀关闭，贮液器中的流动相被吸入泵内。当活塞反向运动时，入口止逆阀关闭，出口止逆阀开启，泵内流动相被压入柱内，然后再开始下一个循环。使用这种泵时一定要连接脉动阻尼器，将产生的脉动除去。若采用双活塞泵，使双活塞在相移1800下工作，可使脉动互相抵消，减速小噪声。往复柱塞泵的流量与外界阻力无关，体积小，非常适于梯度洗脱。
螺旋传动注射泵用电以很慢的恒定速率驱动活塞，使流动相连续输出。当活塞到达末端时，输出中止，然后由另一个吸入冲程使溶剂重新充满，再开始第二次输出。输出时间的长短决定于泵腔体积及输出流量。
8.2.4 梯度洗脱装置
对比较简单的分析问题，可以采用一种均匀的混合溶剂作流动相。如果此时分离不良，或分析时间过长，可以采用梯度洗脱的方法，它极类似于气相色谱中程序升温的作用。
梯度洗脱是在分离过程中通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力的一种方法。通过梯度装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。梯度洗脱一般采用低压梯度，低压梯度采用低压混合设计，只需一个高压泵。在常压下，将两种或两种以上溶剂按一定比例混合后，再由高压泵输出，梯度改变可呈线性、指数型或阶梯型。
图8-3表示用二元梯度来分离几种氨基甲酸酯类杀虫剂。采用4.6mm内径，长度为15cm 的C18柱（5μm颗粒直径），溶剂组成在15min内，从10%（V/V）CH3CN-H2O随时间改变至50% CH3CN-H2O。由于CH3CN量的增多，流动相极性减小，杀虫剂与非极性的固定相C18柱的作用力减弱，而在流动相中的溶解度增大，因而使分析时间缩短。
图8-3 杀虫剂分析
1．灭多虫 2. Aldicarb 3. 虫螨威 4. 西维因 5. Methiocab 总之，梯度洗脱具有以下优点：改善峰形；提高柱效；减少分析时间；使强烈滞留的组分不容易残留在柱上，因而可保持柱的性能良好。但是，在进行下次分析时，更换流动相达到平衡的时间长。
8.2.5 进样器
高效液相色谱进样普遍使用高压进样阀。用微量注射器将样品注入样品环管，样品环管有不同的尺寸（从10μL到2mL），可根据分析要求选用。图8-4为六通高压进样阀进样示意图。当进样阀手柄放在吸液位置时，流动相直接通过孔2和孔3之间的通路流向色谱柱。样品通过注射器从孔4进入样品环管，过量的样品从出口孔6排出。然后将手柄转到进样位置，此时流动相便将样品带入柱子。
图8-4 六通高压进样阀工作示意图
8.2.6 色谱柱
色谱柱是整个色谱系统的心脏，它的质量优劣直接影响分离效果。色谱柱通常采用优质不锈钢管制成。柱内壁要求光洁平滑，否则内壁的纵向沟痕和表面多孔性也会引起谱带的展宽，柱接头的死体积应尽可能小。柱长一般为10-25cm，内径4-5mm。若直径5-10μm固定相颗粒，理论塔板数的可达5×104/m。尺寸排阻色谱柱的内径通常大于5mm，制备色谱柱则更大。为了减少溶剂用量，可采用微径柱，内径约1mm，长度为30-75mm。若采用3μm颗粒，理论塔板数高达1×105/m。为了保护分析柱不被污染，有时需在分析柱前加一短柱，约数厘米长。此柱称为卫柱。为了防止由于卫柱而过分增加柱阻力，在卫柱中使用的颗粒大小约10-30μm。
8.2.7 检测器
高效液相色谱常用的检测器有吸收、示差折光率、荧光和安培检测器等。对它们的要求和性能指标与气相色谱检测器基本相同。
1．吸收检测器主要包括紫外吸收检测器（ultra-violet detector,UVD）和二极管阵列检测器（diod-array detector,DAD）。
紫外吸收检测器是一种选择性浓度型检测器，它仅对那些在紫外波长下有吸收的物质有响应。它具有灵敏度高、噪声低等优点，在高效液相色谱中应用最广，约占70%。其结构如图8-5所示。
图8-5 紫外吸收检测器
紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外—可见区范围的连续辐射,并安装一个光栅型单色器，通过扫描获得所需的工作波长。它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用。光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池通过纯的均匀溶剂，它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号的大小与组分浓度有关。
紫外流通池有Z型和H型，见图8-6。H型具有抵消流动相对光线的干扰，减少噪声和漂移的特点。为了减少峰的展宽，池体积约在1-10μL。
图8-6 Z型和H型流通池
紫外吸收检测器的灵敏度很高，许多功能团在紫外区有很高的摩尔吸光系数。若采用可调波长的氘灯作光源，在组分的最大吸收波长处进行检测，其检测灵敏度可达0.002AUFS （满刻度吸收单位），最小检测量为几个ng。
紫外吸收检测器适用于梯度洗脱，对流动相速度变化不敏感，流动相组成的变化对检测器响应几乎无影响。但是只有在检测器所提供的波长下有较大吸收的分子才能进行检测，而且流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能作流动相。每种溶剂都有紫外截止波长。当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下。因此检测器的工作波长不能小于溶剂的紫外截止波长。主要溶剂的截止波长见表8-3。
二极管阵列检测器是更为先进的检测器。二极管阵列检测器的光路图如8-7所示。
图8-7 二极管阵列检测器光路图
从氘灯发出的紫外可见辐射，穿过光闸。光闸是唯一可以移动的部件，它用于暗电流的测量和波长的校正。然后此辐射不经分光直接通过吸收池、狭缝至衍射光栅。经光栅分光的辐射分别投射约千个二极管阵列检测器上。约10毫秒可以给出一次信号。获得数据如此高速，可以保证保留时间极短的色谱组分的光谱图也不失真。固定光栅和二极管阵列，可能消除因机械传动的不确定性带来的误差。因此数据的重现性好，而且灵敏度高，适用于痕量分析。
这种检测器的最大优点是同时获得吸收值是保留时间和波长函数的类似于等高线的三维图（图8-8）。由于同时获得多种信息，使每个组分在整个波长范围内的光谱信息大大增加。而且可以及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。它可与色谱工作站联用，通过评估程序，可以从比较光谱图获得样品纯度的信息，而且可以对每一个峰从程序库中进行检索来确定该化合物。
图8-8 菲的三维图谱
2．荧光检测器
荧光检测器（fluorescent detector, FD）是最灵敏的高效液相色谱检测器，见图8-9。
图8-9 荧光检测器
它属于选择性浓度型检测器。光源发出的光束通过透镜和激发滤光片，分离出特定波长的紫外光，此波长称为激发波长，再经聚焦透镜聚集于吸收池上，此时荧光组分被紫外光激发，产生荧光。在与光源垂直的方向上经聚焦透镜将荧光聚焦，再通过发射滤光片，分离出发射波长，并投射到光电倍增管上。荧光强度与组分浓度成比例。
荧光检测器的灵敏度比紫外吸收检测器约高二个数量级，因此特别适合于痕量分析。非荧光物质可通过与荧光试剂反应变成荧光物质后检测，扩大了该检测器的应用范围。
1．示差折光率检测器（refractive index detector, RID）
示差折光率检测器是一种通用性检测器,只要组分折光率与流动相折光率不同,就能进行检测。
反射型示差折光率检测器根据Fresnel反射定律设计，其结构见图8-10。光源发出的光束分别投射到测量池和参比池上，其中有一部分入射光在液体和棱镜界面上就被反射出来，而另一部分则穿过液体后被棱镜底部的不锈钢板反射出来，投射到光电阻上。由于流经参比池和测量池的液体的折光率不等，因此反射出来的两束光强就有差别，导致光电阻阻值不等，产生信号。
图8-10 反射型示差折光率检测器
示差折光率检测器的通用性好，可以检测的化合物的范围广，特别在尺寸排阻色谱中用得较多。但它灵敏度低，折光率随环境温度的变化很大，不能用于梯度洗脱。
2．电化学检测器（electrochemical dector,ECD）
电导检导器、库仑检测器、伏安检测器及安培检测器一般说都可用作高效液相色谱的检测器，但安培检测器最常用。
安培检测器由一恒电位仪和一个薄层反应池构成。图8-11是薄层安培检测器的示意图。下部的薄层反应池由两块有机玻璃夹着一层中心挖空的聚四氟乙烯薄膜（厚度约为50-150μm）所组成。
图8-11 薄层安培检测器
通过三电级系统将它与恒电位仪相连接。工作电极一般为玻璃碳电极，或石墨电极；参比电极一般为Ag-AgC1电极，辅助电极一般为Pt丝。当柱后流出物进入反应池，在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极之间就有电流流过，此电流大小与被测物的浓度成比例。采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈电化学惰性。它最适合于与反相色谱匹配。但它只能检测电化学活性物质，即在工作电极的电位范围内，可以氧化或还原的物质。若采用衍生化技术，可扩大它的应用范围。
安培检测器的选择性好，灵敏度较高，例如对肾上腺素和去甲肾上腺素，检测限达10-12mol。但是电极表面容易被活性物质如蛋白质以及表面活性物质等毒化。
电导检测器主要用于离子色谱，伏安检测器只用于特殊研究中。库仑检测器很少用。
常用高效液相色谱检测器的性能比较见表8-1。
表8-1高效液相色谱检测器性能
8．3 液固色谱法
8.3.1原理
液固色谱法是利用各组分在固定相上的吸附能力的不同而将它们分离的，故又称液固吸附色谱法。
当组分随着流动相通过色谱柱中的吸附剂时，组分分子及流动相分子对吸附剂表面的活性中心发生吸附竞争。组分分子对活性中心的竞争能力的大小，决定了它们保留值的大小。被活性中心吸附越强的组分分子，越不容易被流动相洗脱，k'就大；反之，k'值小。组分之间的k'值相差越大，分离越容易。
吸附剂吸附能力的强弱与吸附剂的比表面积、物理化学性质、组分分子的结构和组成，以及流动相的性质等因素有关。若组分与吸附剂之间的作用力强，则易被吸附；组分分子的构型与吸附剂表面活性中心的刚性几何构型相适应，易被吸附。因此，液固色谱可分离几何异构体。
8.3.2 固定相
常用的液固色谱固定相是表面多孔和全多孔微粒型硅胶、氧化铝等。一般采用5-10μm 的全多孔型微粒。表8-2列出了常用吸附剂的性质。
表8-2 液固色谱常用吸附剂
8.3.3 流动相
通常液固色谱以硅胶和氧化铝为固定相，组分的保留和分离情况两者基本相似。实现最佳分离与流动相的选择有关。相对说，对极性较大的组分可选用较强极性的流动相，对极性小的则选用弱极性的流动相。
对于给定的吸附剂，溶剂的强度用溶剂强度参数εO表示。εO表示单位面积吸附剂表面的溶剂吸附能。εO越大，溶剂的极性也越大。表8-3列出不同溶剂在硅胶和氧化铝上的εO值，以εO增加的次序排列，该次序称为洗脱序列。若组分k'值太小，流出太快，应改用弱极性的溶剂；若k'值太大，组分流出过慢，则改用强极性的溶剂。
表8-3溶剂强度参数εO和溶剂物理性质
液固色谱特别适用于非离子的、水不溶的化合物以及几何异构体。例如非极性石油烃族的组成分析，马钱子类生物碱、止痛药、吩噻嗪类药物的分析，农药残留的分析，以及许多芳香族异构体分析都可用液固色谱进行。组分的保留值主要决定于官能团类型及数目。各类化合物的保留值按以下次序递增：饱和烃<烯烃<芳烃≈有卤化物<硫化物<醚<硝基化合物<腈<酯≈醛≈酮<醇≈胺<酰胺<羧酸<磺酸。
8.4 化学键合相色谱法
采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法。化学键合相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂。这种固定相的分离机理既不是单一的吸附作用，也不是单一的液液分配机理。一般认为吸附和分配两种机理兼有，键合相的表面覆盖度大小决定何种机理起主导作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。
8.4.1化学键合相
通常，化学键合相的载体是硅胶，硅胶表面有硅醇基，≡Si—OH，能与合适的有机化合物反应，使具有不同极性功能团的有机分子键合在表面而获得不同性能的化学键合相，它的制备方法主要有以下几种：
1. 硅酯化
使醇与硅醇基发生酯化反应
≡Si—OH+ROH →≡Si—O—R
生成Si-O-C键合相。这种固定相对热不稳定，遇水、醇等强极性溶剂会发生水解，使酯链断裂。因此仅适用以干燥的无水乙醇为流动相的体系。
2. 先氯化，再与有机锂或格氏试剂反应
生成Si-C 键，或与H 2NCH 2CH 2NH 2反应，生成Si-N 键合相。这种固定相热稳定性和抗水解能力都好。
3. 硅烷化
用有机氯硅烷与硅醇基发生反应
≡Si-OH + R 3SiCl → ≡Si-O-SiR 3 + HCl
生成Si-O-Si-C 键合相。这种固定相在pH2-8.5范围内对水稳定，应用广泛。由于有机分子与载体间的牢结合，固定相不易流失，稳定性好。常用化学键合相见表8-4。
表8-4 常用化学键合固定相
8.4.2 正相键合相色谱法
正相键合相色谱法的流动相极性小于固定相极性，它往往是一种混合溶剂，由非极性烃类溶剂如己烷、庚烷、异辛烷等及适量的极性溶剂如氯仿、醇、乙腈等配成。若溶剂极性增加，流动相的溶剂强度增加，则样品中组分的k'值减小。
正相键合相色谱法适用于分离中等极性化合物，如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药等。
8.4.3 反相键合相色谱法
反相键合相色谱法的流动相极性大于固定相极性。流动相为强极性的溶剂，如甲醇/水，乙腈/水等。固定相一般为C 18和C 8（表8-5）。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。
表8-5 C 18和C 8键合固定相
*ODS 为十八烷基硅烷的英文Octadecylsilane 的缩写。
R
Si RLi
Si Cl
Si OH Si SOCl --≡-≡??→?-≡2
在反相色谱中，影响组分保留值的因素有：
（1）碳链长度 保留值随着碳链长度增加而增加。除常用的C 8、C 18外，还有其他烷基，其保留值增加次序为：C 1 （2）碳的负载量和表面覆盖率保留值随碳负载量和载体上烷基覆盖率增加而增加。 （3）载体孔径尺寸和纯度 硅胶载体的孔径大，组分出入自由，受到排阻的几率小。硅胶中的杂质，如金属等，都有可能与组分发生选择性作用而影响保留值。 （4）残余硅醇基数目，由于位阻等各种原因，不是硅胶表面所有的硅醇基都能发生键合反应，残余的硅醇基将会与组分发生相互作用而影响保留值和发生峰拖尾现象等。 反相键合相色谱的流动相是以水为底溶剂，再加入一种与水相混溶的有机溶剂组成。根据分离需要，溶剂强度可通过改变有机溶剂的含量来调节。表8-6列出了反相键合相色谱的常用溶剂及相对强度。甲醇、乙腈和四氢呋喃为更常用。表中溶剂极性参数P'越大，溶剂的极性越强，在液固色谱中洗脱能力越强，而在反相色谱中的洗脱能力越弱。 表8-6 反相键合色谱的常用溶剂 * 以加10%溶剂到水中，k'减少的倍数。 反相键合相色谱法得到最广泛的应用，是由于它以水为底溶剂，在水中可以加入各种添加剂，以改变流动相的离子强度、pH 和极性等，以提高选择性，而且水的紫外截止波长低，有利痕量组分的检测。反相键合相稳定性好，不易被强极性组分污染。水廉价易得。还有一个很重要的原因就是可以利用二次化学平衡，使原来不易用反相色谱分析的样品也可以采用反相色谱进行。 反相键合相色谱分离弱酸或弱碱样品时会发生拖尾。如分离十二烷酸时，可在流动相乙腈/水中加入少量乙酸，以抑制十二烷酸的离解，使它以游离酸的形式在键合相上分离，以获得对称的色谱峰。这种对水溶液中可离解的弱酸或弱碱样品，通过调节流动相的pH 值来抑制它们的离解，从而使分离改进的方法称为离子抑制法。流动相的pH 值应调节至比组分的pKa 值大（对碱）或小（对酸）两个单位以上。pH 值变化较大时会影响组分的保留值。当弱酸的pKa 值在3.0≤pKa ≤7或弱碱的pKa 值在7.0≤pKa ≤8时可采用离子抑制法。 对于pKa<3的酸或pKa>8.0的碱可以采用离子对色谱法。离子对色谱法是分离离子，或可电离的分子的另一种色谱法。它是离子对提取技术与色谱结合的产物。若键合相为C 18，流动相为水溶液，组分离子为负离子，并在其中加入一种电性与组分离子相反的B +离子。 由于B +离子与带负电荷的组分离子A — 之间的静电作用力，使它们生成离子对： 通过选择合适的具有疏水性的平衡离子B +，从而使A —·B + 离子对具有较强疏水性，因而被C 18键合相提取。这种提取能力决定于组分离子的性质，与平衡离子形成离子对的能力，以及所生成离子对的疏水性的强弱。离子对疏水性越强，以上离子对形成反应的平衡常数越大，以及平衡离子浓度越高，因而其保留值越大。正由于以上影响保留值的参数的不同，导致各组分先后离开色谱柱。 由于反相离子对色谱法的固定相就是普通反相键合相色谱的固定相，所以只要改变流动相的成分就可转变为反相离子对色谱法。常用的流动相是加有平衡离子和某些改性剂的水/甲醇或水/乙腈缓冲溶液。流动相中的有机溶剂增加，溶剂强度也增加，k'值减小。分离酸 有机相 －水相水相－++?+B A B A 时，在流动相中加入季铵盐，如磷酸四丁基铵等来提供平衡离子；分离碱时，加入磺酸盐，如庚磺酸盐或高氯酸等来提供平衡离子。 当然离子对色谱法也可以采用正相模式，正相离子对色谱法的固定相是硅胶上吸着的含平衡离子的缓冲水溶液，如0.1mol·L-1·HC1O4溶液，或加有四丁基铵盐的HPO2-4/PO3-4缓冲溶液，前者的平衡离子为C1O-4，用于分离阳离子；后者的平衡离子为(C4H9)4N+，用于分离阴离子。流动相是有机相，如丁醇-正庚烷、丁醇/二氯乙烷/己烷等。 一般，反相键合相色谱法适用于极性较小的样品分离。它可以分离同系物、复杂的稠环芳烃以及其它亲脂化合物。也用于分析药物、激素、天然产物及农药残留量等测定。利用离子对色谱法，使它的应用面扩大到强酸和强碱。 8.4.4 手性选择剂 在高效液相色谱中，手性选择剂可直接键合于硅胶上用作固定相，也可以将手性选择剂加入至流动相中，从而形成一种立体选择性环境。不少手性选择剂可与组分生成两种不稳定的非对映体包络物，它们具有不相同的稳定常数，从而得到较满意的分离。较常见的手性选择剂有环糊精、冠醚衍生物，大环抗菌素以及多糖衍物等。 1.环糊精及其衍生物 环糊精结构已在7.3.2节中介绍。被分离组分的尺寸必须适合环糊精空腔，这可以是整个分子的匹配，也可以是组分的疏水部分的匹配。除了尺寸匹配外，还须视在两者之间能否形成弱化学键，如组分的不对称中心上的取代基能否与伯羟基之间生成弱化学键。为了改变环糊精的手性选择性，可以将其羟基改性，如改性成甲氧基，则使环糊精的空腔变深，且溶解度改变。不同环糊精具有不同空穴尺寸。通过衍生化，也可使环糊精转变成带负电荷的衍生物，如4-磺基丁基-β-CD。它具有四个磺酸基通过丁基链与环糊精母体相连，因此在任何pH下都带负电荷，大大扩展了应用面。 2.冠醚及其衍生物 冠醚能与数种无机、有机阳离子以及带有氨基的有机化合物形成主客体包络物。通过导入合适的基团可以使冠醚获得手性中心，如18-冠-6-2，3，11，12-四羧酸（图8-12）。它对对映体的分离机理是被分析物能否适合。空穴的疏水部份，并能与氧原子形成离子-偶极键，同时被分析物的不对称中心上的取代基与羟基之间形成弱化学键。这类冠醚特别适合胺类药物等分离。 图8- 12 18-冠-6-2，3，11，12-四羧酸 3.大环抗菌素 大环抗菌素分子量在700-2100之间，在不同pH的流动相中，它们可以是以带电形式或非带电形式存在。以万古霉素为例（图8-13），它除了有各种功能因之外，还有多个立体中心，分子中存在一个“刚性口袋”，因此可以提供疏水作用中心、极性中心以及可以伸缩及旋转的空间臂，因此有利于许多药物对映体分离。它的缺点是对250nm以下的紫外辐射有强烈吸收。 图8-13 万古霉素结构 4.多糖衍生物 由纤维素、淀粉等多糖衍生物制备的手性选择剂应用也十分广泛。如纤维素是由单一的D-（+）葡萄糖1，4缩合而成的链状分子，它的每一个链节的主体构型熟知，因此有利于揭示手性分离机理。纤维素的结构如图8-14。纤维素的不同类衍生物，其分离对象和分离能力也不相同，如纤维素三苯基氨基甲酸酯或纤维素三（3，5-二硝基）苯甲酸酯可以分离某些外消旋药物。 图8-14 纤维素结构 8.5 离子交换色谱法 8.5.1 原理 离子交换色谱的固定相是离子交换剂，根据交换剂性质，可分阳离子交换剂和阴离子交换剂。交换剂由固定的离子基团和可交换的平衡离子组成。当流动相带着组分离子通过离子交换柱时，组分离子与交换剂上可交换的平衡离子进行可逆交换，最后达到交换平衡。阴、阳离子的交换平衡可表示为： 阴离子交换：R+Y-+X-+X-+Y- 阳离子交换：R-Y++X+ R-X++Y+ X-和X+为组分离子，Y-和Y+-为交换剂上的固定离子基团，如RSO3-或RNH3+；Y+可以是H+或Na+,Y-可以是OH-或Cl-等。组分离子对固定离子基团的亲和力强，分配系数大，其保留时间长；反之，分配系数小，保留时间短。因此离子交换色谱是根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离的目的。 对阴离子交换剂，阴离子的选择性系数次序为： 柠檬酸根离子>SO>C2O>I->HSO>NO>CrO>Br->SCN->CI->HCOO->CH3COO->OH->F- 在阳离子交换剂上，阳离子的选择性系数次序为： Fe3+>Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Zn2+>Mg2+>UO>Tl+>Ag+>Cs+>Rb+>K+ >NH >Na+>H+>Li+ 8.5.2 固定相 离子交换色谱固定相为离子交换剂，其常用基质有合成树脂（聚苯乙烯-二乙烯基苯）、及硅胶等二种。 根据离子交换基团性质，离子交换剂又可分为阳离子交换或阴离子交换剂。阳离子交换剂又可分为强酸性和弱酸性两类，前者的可交换基团为—SO3H，后者的为—COOH。阴离子交换剂也可分为强碱性和弱碱性两类，前者的可交换基团为—N(CH3)3C1，后者的为—NH2。常用的离子交换剂为磺酸型(RSO3H)和季铵盐(RN(CH3)C1)。 若在全多孔微粒型硅胶的基质上化学键合各种离子交换基团，便形成了键合相离子交换剂。一般可采用5—10μm的全多孔微粒型键合相交换剂。对酸性化合物，可用阴离子交换剂；碱性化合物则用阳离子交换剂。对两性样品，如氨基酸、蛋白质等，可调节流动相的pH值，使氨基酸以阳离子或阴离子的形式存在，然后再用阳离子或阴离子交换剂分离。一般采用阳离子交换剂分离，选择性较好。 常用的离子交换色谱固定相见表8-7。由于强碱或强酸型离子交换剂比弱碱、弱酸型交换剂使用的pH 范围更广，可分离许多不同类型的化合物，若采用pH 梯度洗脱则更能改进分离。但是，强烈滞留的化合物，且又不能承受过酸或过碱的剧烈条件，则可在弱碱或弱酸型的离子交换剂上更易洗脱。 表8-7常用离子交换色谱固定相 8.5.3流动相 离子交换色谱的流动相是盐类的缓冲溶液。通过改变流动相的pH 、缓冲剂（平衡离子）的类型、离子强度以及加入有机溶剂、配位剂等都会改变交换剂的选择性，影响样品的分离。 流动相的pH 值会影响酸或碱的离解平衡，它能控制组分以离子形式存在的分数。若组分以分子形式存在，则不被固定相保留。离子形式所占的分数越大，保留值也越大；反之，保留值越小。流动相的pH 可用缓冲剂调节。常用的缓冲剂有磷酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乙酸盐、氨水等。 流动相离子强度的变化对保留值的影响比pH 更显著。组分的保留值受流动相中盐类的总浓度控制。增加外加阴离子或阳离子总数，会增强它们对R +或R -的竞争能力，使组分离子的保留值减小。通过加入不同性质的外加盐类，可以影响柱的选择性，因为不同外加离子对交换剂的固定基团的亲和力大小不同。 若在流动相中加入配位剂L ，它会与金属离子M 和离子交换剂形成的离子对中的金属离子形成配合物。当组分X 随流动相进入柱后，发生配位剂交换反应： RM —L + X —X + L RM —X 比RM —L 稳定，X 将L 氨基酸或碱类。例如使阳离子交换树脂与Cu 2+或Ni 2+作用，形成金属改性树脂。当氨基酸进入色谱柱后，在金属中心上发生各种氨基酸与流动相中配位剂的竞争作用，由于竞争能力不同，从而达到氨基酸分离目的。这种分离方法称作配体交换色谱。 8.5.4离子色谱法 从离子交换柱中流出的各种离子量可用电导检测器检测。但是，由于流动相几乎都是强电解质，这种强背景电导会完全掩盖被测组分离子的信号。1875年Small 等提出了离子色谱法，从而产生了一种新型的离子交换色谱技术。 图8-15 离子色谱流程图 离子色谱的流程装置如图8-15所示。离子色谱法与普通离子交换色谱法的差别通常在于分离柱之后增加一个抑制柱。这种具有抑制柱的离子色谱法称为抑制型离子色谱法，又称双柱离子色谱法。若样品为阳离子，用无机酸作为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当组分离子经填充阳离子交换剂的分离柱之后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应： R+—OH- + H+C1- →R+—C1-+H2O R+—OH-+ M+C1- →M+—OH-+R+—C1- R+—OH-为抑制柱中的阴离子交换剂，M+为样品中被测阳离子。由于抑制柱的作用，一方面使流动相中的酸生成H2O，使流动相电导率大大降低；另一方面使样品阳离子从原来的盐转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度比Cl-大，因此提高了组分电导检测的灵敏度。 若样品为阴离子，分离柱为阴离子交换剂，用NaOH溶液作为流动相。抑制柱为高容量的强酸性阳离子交换剂。当流动相进入抑制柱时，发生下列反应： R-—H++Na+OH-→R-—Na++H2O R-—H++Na+A-→R-—Na++H+A- 抑制柱使碱生成H2O，其背景电导率大大降低。样品中的阴离子生成了相应的酸，由于H+离子的淌度比Na+大得多，因此提高了组分电导检测的灵敏度。 由于离子交换反应，抑制柱逐渐失去了抑制能力，因此必须定期再生，但再生期较短。为了克服这一缺点，以膜离子抑制器来代替。这实际上是具有磺酸基团或季铵基团的聚苯乙烯多孔纤维制成的离子交换膜管，管内流过洗脱液，管外流过离子交换剂再生液。这与前面介绍的抑制柱的差别主要在于交换膜管始终处于动态再生状态下。图8-16说明了这一过程。NaHCO3洗脱液和再生液H2SO4分别从管内和管外流过，方面相反。Na+离子与膜上的H+离子交换生成H2CO3，使本底电导大大下降。H2SO4不断从下而上流过，其H+离子透过管壁，使已被交换的磺酸基团不断得到再生。 图8-16 阴离子色谱纤维抑制柱抑制反应示意图 管内的样品阴离子和再生液中的SO离子都不能穿过膜管。最终只使阴离子到达电导检 测器（图8-17）。 图8-17 双柱阴离子色谱图 该分离使用的色谱柱：HPIC-AS4A ， 洗脱液为7.5×10-4mol ·L -1 NaHCO 3 2.2×10-3mol ·L -1 Na 2CO 3 ；检测器为抑制型电导检测器 若分离阳离子，只是以含季铵基团的离子交换膜管代替而已，抑制原理雷同。 如果所采用的分离柱的离子交换容量很低,且洗脱液的浓度也很低,这时就不必采用离子抑制柱,例如在分离阴离子时,离子交换剂的交换容量约为普通交换剂的千分之一左右,洗脱液为10-4mol ·L -1 有机酸盐，如苯甲酸钠或邻苯二甲酸钠溶液，因此背景电导值都很小。当被分析的阴离子从柱后流出进入电导检测器时仍能被检测出来。这就是单柱离子色谱。 离子色谱法应用广泛。它可用于简单的无机阴离子和许多金属离子混合物的分离，也可用于有机酸、胺和碳水化合物、醇、表面活性剂、氨基酸等分离。 8.6 尺寸排阻色谱法 8.6.1 原理 尺寸排阻色谱法是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称凝胶色谱法。 以水溶液作流动相的尺寸排阻色谱称为凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography, GFC ），以有机溶剂作流动相的称为凝胶渗透色谱（gel permeation chromatogrphy, GPC ）。 尺寸排阻色谱用凝胶作为填充剂，凝胶是一种表面惰性，其孔径有一定分布范围的多孔材料。当被测组分随流动相通过凝胶色谱柱时，尺寸大于孔径的组分分子不能渗入凝胶孔穴而被全部排斥，则最先流出色谱柱；尺寸小于孔径的分子则全部渗入凝胶，最后流出；尺寸中等的分子部分渗入较大孔穴，而排斥于较小孔穴时，因此介于中间流出。 当组分X 进入色谱固定相达到扩散平衡时： 组分的分配系数为： 若组分分子尺寸大于固定相凝胶的孔径时，被全部排斥在外，则组分分子在凝胶中的浓度[Xs]=0，K=0；若组分分子直径小于凝胶的孔径，因两相间存在浓度梯度，组分分子将向凝胶孔穴扩散，当扩散达到平衡时，K=1.0。若组分分子的大小介于以上两种极限情况之间，则K 的范围为0—1。因此，在尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合：0≤K ≤1。 尺寸排阻色谱中组分的保留体积V R 也可用式（6.15）色谱基本保留方程表示： 重排得： 式中，V m 为凝胶颗粒间流动相体积；Vs 为凝胶孔穴内流动相体积。对于不能渗入凝胶孔穴的大的组分分子，K=0，V R =V m ；对于小的组分分子，因它能完全渗入凝胶，K=1，V R = V m + V S ；中间大小的组分分子，介于这两个极限之间，V R 值则为V m ≤V R ≤V m +Vs 。 以相对分子质量（或分子尺寸）对保留体积作图得一曲线，该曲线称为相对分子质量校准曲线，如图8-19（a ），曲线上有两个转折点A 和B 。若组分分子的相对分子质量比A s X X ] [] [m s X X K =s m R KV V V +=s m R V V V K -= 点所对应的相对分子质量大，则被全部排斥在凝胶孔穴之外，它们都以相同的保留体积流出。A点为排斥极限，K=0，即该固定相能够分离的组分的相对分子质量的上限。若组分分子的相对分子质量比B点所对应的小，则它们全部渗入凝胶孔穴内，也都以相同的保留体积流出，B点为全渗透极限，K=1，即能分离的组分的相对分子质量的下限。只有相对分子质量介于A、B两个极限之间的组分才有可能分离，它们按相对分子质量降低的次序先后洗脱，见图8-19（b）。A与B间的线性部分称为选择渗透部分。 图8-18 尺寸排阻色谱相对分子质量校准 曲线(a)和各组分的洗脱曲线(b) 8.6.2固定相 尺寸排阻色谱中常用的固定相有无机和有机两大类，前者如多孔玻璃或硅胶；后者如苯乙烯二乙烯基苯共聚物等。颗粒大小在5—10μm。 多孔玻璃和硅胶有以下优点。组分与溶剂分子扩散进入孔穴中能迅速达到平衡；稳定性好，耐较高温度；且制造相对容易，其孔径范围约在4—250nm。但它们会产生吸附效应，因此其表面常常通过硅烷化进行去活。 苯乙烯二乙烯基苯共聚物的孔径，在制造时，可通过加入的交联剂二乙烯基苯的含量来控制。二乙烯基苯的含量多少决定了交联度大小，也决定了孔径的大小。由于这种共聚物的疏水性，流动相必须是非水溶剂。如果在交联剂中引入亲水基团，如磺化二乙烯基苯等，就可得亲水性的共聚物。 表8-8 尺寸排阻色谱固定相性质 固定相对某一样品的分离情况。当样品分子的相对分子质量处在校准曲线中间部分时才有可能分离。校准曲线平坦，表明当使用该固定相分离两个相对分子质量相近的组分时，其保留体积相差大，选择性好；校正曲线陡，使用该固定相分离时的保留体积相差小，选择性差。 图8-19不同孔径固定相的分离范围 8.6.3流动相 流动相的选择决定于固定相类型。尺寸排阻色谱法应选用能溶解样品、沸点比柱温高25—50℃、粘度低、与样品的折光率相差大的物质作流动相，以提高柱效和灵敏度。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基甲酰胺和水等。以水溶液为流动相的凝胶过滤色谱适用于水溶性样品；以有机溶剂为流动相的凝胶渗透色谱适用于非水溶性样品。 尺寸排阻色谱法可用于分离相对分子质量大的分子，如蛋白质、核酸等，也可用于测定合成高聚物的相对分子质量的分布，研究聚合机理等。 8．7 分离方式的选择及应用 一般总是从相对分子质量出发，考虑样品的水溶性，以及样品分子的极性与分子结构来选择分离方式。 对于不同样品的分离方式的选择可参见图8-20。但对某一给定样品，不是只有唯一的一种分离方式可选择。采用何种方式更为合理，要综合考虑样品性质、方法特点及个人经验等因素。 离子型 离子交换色谱或离子色谱 水溶 分子量<2000 非离子型或可形成离子对腈基或氨基正相键合相色谱 溶于非极性或弱极性溶剂C4、C8、C18及苯基反相键合相色谱 非水溶（极性在CHCl3以下） 溶于CHCl3 硅胶吸附色谱 溶于中极性或极性溶剂 （极性在CHCl3以上）溶于醇、脂或乙酸乙酯腈基或氨基正相健合相色谱 样品 离子型 水溶离子交换色谱 分子尺寸<30nm C4、C8、C18反相健合相色谱 非离子或可形成离子对 分子量>2000 分子尺寸30-400nm 尺寸排阻色谱 分子尺寸<30nm C4、C8、C18反相键合相色谱 非水溶 分子尺寸30-400nm 尺寸排阻色谱 图8-20 分离方式的选择 高效液相色谱法的应用远远广于气相色谱法，它非常适合于挥发性差或不挥发以及具有某种生物活性的化合物的分析。它广泛用于合成化学、石油化工、生命科学、临床化学、药物研究、环境监测、商品检验及法学检验等领域。 液固色谱由于吸附剂数目有限及其固有的缺点，应用面不广，不少分析逐渐被反相键合相色谱所取代。但是，适合于异构体分离、族（如烷、烯和芳烃）分离。由于硅胶比较便宜，有利进行制备色谱分离。 离子交换色谱可用于分离许多无机与有机阳离子和阴离子，特别在分离氨基酸、蛋白质、核糖核酸、药物等方面得到较广泛应用。离子色谱特别适合于测定空气、环境水、工业废水、食品工业及临床化学中各种体液内的离子的测定。 尺寸排阻色谱在高分子领域研究中用途很广。它可用于高聚物材料的组成分析、多孔膜材料形态与结构的表征、研究高聚物分子量的分布以及它与加工、性能、老化等过程的关系。 在高效液相色谱中，应用最为广泛的是反相键合相色谱。它除了可以分离常见的化工产品及其中间产物外，它还可分离氨基酸、甾族类化合物、维生素、糖类、合成药物、天然药物、核糖核酸、多肽、蛋白质、酶等。至今，可以用反相键合相色谱法测定的蛋白质和酶（如各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素、酶等）已达100多种。图8-21为氨基酸分离结果。色谱柱为十八烷基键合相(Ultrasphere C18)，颗粒直径3μm，75×4.6mm,流动相为50mmol·L-1Na2HPO4(pH7.2)、CH3OH和四氢呋喃溶液，并进行梯度洗脱。为了提高灵敏度，通过衍生化使氨基酸与邻苯二醛反应，生成荧光衍生物后，用荧光检测器检测。 图8-21 氨基酸衍生物的分离 1.丙氨酸，4.天冬氨酸，5.谷氨酸，7.天冬酰胺， 9.丝氨酸，10.谷氨酰胺，11.组氨酸，14.甘氨酸， 15.苏氨酸，17.精氨酸，18.β-丙氨酸，19.丙氨酸， 21.酪氨酸，25.色氨酸，26.甲硫氨酸，27.缬氨酸， 28.苯丙氨酸，29.异亮氨酸，30.亮氨酸，31.羟赖氨酸， 33.赖氨酸 8.8 超临界流体色谱法 8.8.1 原理 以超临界流体作为流动相的色谱法称为超临界流体色谱法。此时的流动相处在该液体的临界点以上的压力和温度下，它既不是液体，也不是气体。 图8-22 纯组分的相图 由图8-22知，当增加温度或增加压力至临界点以上，液体或气体就变成超临界流体。图中的虚线表明从一种液体或一种气体转变成超临界流体时没有相变发生。正由于超临界流体色谱的流动相采用超临界流体，因此它将气相色谱与高效液相色谱的优点互相结合起来，从而弥补了它们的不足。从表8-9的数据，并结合色谱基本理论，就可以发现超临界流体色谱的优越性。CO2超临界流体的密度和扩散系数都介于气体和液体之间，粘度也有所不同，因此它的选择性与柱效与气相色谱和高效液相色谱都有明显差别。 表8-9 气体、液体与超临界流体某些相对性质的比较 流动相 He CO2*CO2 H2O 压力，MPa 0.15 8 20 温度, ℃200 100 35 20 状态气体超临界流体超临界流体液体 密度，g·cm-3 2×10-40.15 0.8 1 扩散系数，Cm2·S-1 1 10-3 10-4 10-5 粘度，cP 0.02 0.02 0.1 1 * CO2的临界压力为7.4MPa；临界温度31.3℃。 当压力增加，流动相密度增加，与组分的作用力增加，洗脱能力增强，K′值下降。 温度对保留值有明显影响。若在低温区，流动相仍是一般液体，流动相密度几乎与温度无关。此时相当于一般液相色谱的情况。若在恒定压力下，当温度增加时，发现K′增加，这是因为流动相密度减小，组分与流动相作用力减弱。这相当于处在超临界流体范围。若温度继续升高，到达高温区，此时流动相密度不再占优势，而组分的挥发性则占主导地位，导致温度增加，K′下降。此时相当于气相色谱的范围。 可见，超临界流体色谱可以视作当温度增加而导致K′增加的一种特殊色谱方法。 8.8.2 仪器 超临界流体色谱的仪器与气相色谱和液相色谱仪很类似。同样需要流动相源、净化系统、高压泵、进样系统、色谱柱和检测器及数据处理系统，关键的差别有以下几点。 (1)在高效液相色谱仪中，只有在柱入口加高压，而超临界流体色谱仪整个体系都处在足够高压下。只有高压，才能使流动相处于高密度状态，洗脱能力才强。因此必须有程序升压的精密控制设备。若以CO2为例，压力从7MPa升至9MPa，保留时间可以缩短5倍。 (2)色谱柱的控温系统类似气相色谱仪，但必须很精密。 (3)超临界流体在柱出口则以气体形式释放出来，一般进入氢火焰离子化检测器。因此在柱后必须装有毛细管限流器，以实现限流器两端的相的瞬时转变。毛细管限流器一般长约2-10cm，内径要比开管柱细得多，约5-10μm，由于限流器两端的相变过程属吸热过程，并防止高沸点组分冷凝，限流器应保持在约300-400℃。 8.8.3 固定相和流动相 超临界流体色谱可以使用填充柱，这与普通高效液相色谱柱相似，直径为数毫米，长度不超过25cm，固定相颗粒直径3-10μm。也可采用开管柱，如聚硅氧烷键合柱，10-20m 长，内径0.05-1.0μm，固定液膜厚约0.05-1μm。用作超临界流体色谱流动相的化合物见表8-10。由于CO2廉价易得，温度与压力可在较宽范围内调节，紫外截止波长小于190nm，且无毒，因此是常用流动相。为改进选择性，与高效液相色谱类似，在流动相中也可以加入某些改性剂。 表8-10 用于超临界流体色谱的流动相的临界性质 超临界流体温度℃压力，MPa 密度，g·cm-3 CO2 31.3 7.4 0.468 N2O 36.5 7.3 0.457 NH3 132.5 11.4 0.235 甲醇239.4 8.1 0.272 正丁烷152.0 3.8 0.228 二氯二氟甲烷111.8 4.1 0.558 离子色谱基础 离子色谱(Ion Chromatography)是高效液相色谱(HPLC)的一种，是分析阴离子和阳离子的一种液相色谱方法。 一、离子色谱的基本原理 离子色谱的分离机理主要是离子交换，有3种分离方式，它们是高效离子交换色谱(HPIC)、离子排斥色谱(HPIEC)和离子对色谱(MPIC)。用于3种分离方式的柱填料的树脂骨架基本都是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物，但树脂的离子交换功能基和容量各不相同。HPIC 用低容量的离子交换树脂，HPIEC用高容量的树脂，MPIC用不含离子交换基团的多孔树脂。3种分离方式各基于不同分离机理。HPIC的分离机理主要是离子交换，HPIEC主要为离子排斥，而MPIC则是主要基于吸附和离子对的形成。 1、高效离子交换色谱 应用离子交换的原理，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离子，这在离子色谱中应用最广泛，其主要填料类型为有机离子交换树脂，以苯乙烯二乙烯苯共聚体为骨架，在苯环上引入磺酸基，形成强酸型阳离子交换树脂，引入叔胺基而成季胺型强碱性阴离子交换树脂，此交换树脂具有大孔或薄壳型或多孔表面层型的物理结构，以便于快速达到交换平衡，离子交换树脂耐酸碱可在任何pH范围内使用，易再生处理、使用寿命长，缺点是机械强度差、易溶胀易、受有机物污染。 硅质键合离子交换剂以硅胶为载体，将有离子交换基的有机硅烷与基表面的硅醇基反应，形成化学键合型离子交换剂，其特点是柱效高、交换平衡快、机械强度高，缺点是不耐酸碱、只宜在pH28范围内使用。 离子交换色谱是最常用的离子色谱。 2、离子排斥色谱 它主要根据Donnon膜排斥效应，电离组分受排斥不被保留，而弱酸则有一定保留的原理，制成离子排斥色谱主要用于分离有机酸以及无机含氧酸根，如硼酸根碳酸根和硫酸根有机酸等。它主要采用高交换容量的磺化H型阳离子交换树脂为填料以稀盐酸为淋洗液。 3、离子对色谱 离子对色谱的固定相为疏水型的中性填料，可用苯乙烯二乙烯苯树脂或十八烷基硅胶(ODS)，也有用C8硅胶或CN，固定相流动相由含有所谓对离子试剂和含适量有机溶剂的水溶液组成，对离子是指其电荷与待测离子相反，并能与之生成疏水性离子，对化合物的表面活性剂离子，用于阴离子分离的对离子是烷基胺类如氢氧化四丁基铵氢氧化十六烷基三甲烷等，用于阳离子分离的对离子是烷基磺酸类，如己烷磺酸钠，庚烷磺酸钠等对离子的非极性端亲脂极性端亲水，其CH2键越长则离子对化合物在固定相的保留越强，在极性流动相中，往往加入一些有机溶剂，以加快淋洗速度，此法主要用于疏水性阴离子以及金属络合物的分 第十八章高效液相色谱法 15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为 Zirchrom C8柱（20cm X 4.6mn , 5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含0.5%三乙胺，磷酸调pH3.0）（28： 18： 54）;以黄芩苷 对 照品配成浓度范围为10.3?144.2ug/ml 的对照品溶液。进样，测得黄芩苷峰面积，以峰 面积和对照品浓度求得回归方程为： A=1.168 X 105C -1.574 X 103 , r=0.9998.精密称取黄芩 颗粒0.1255g ，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取 1ml 于 10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。平行测定供试品溶液和对照品溶 液 （61.8ug/ml ），得峰面积分别为 4250701，5997670. 16 .校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量： ODS 色谱柱；甲醇-水（60:40）流动相；检测器UV280nm 对硝基甲苯为内标物。 （1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物） 、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成 10ml 溶液，进 样10ul ，记录色谱图。重复三次。测得含 0.0733mg/ml 内标物、0.600mg/ml 炔诺酮和0.035mg/ml 炔雌醇的对照 品溶液平均峰面积列于表 18-6。 （2）试样测定：取本品 20片，精密称定，求出平均片重（60.3mg/片）。研细后称取732.8mg （约相当于炔 诺酮7.2mg ），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物 0.0733mg/ml ）。测得峰面积列于表 18-6。 表18-6复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（ u v ? s ） 炔诺酮 炔雌醇 内标物 对照品溶液 1.981 X 106 5 1.043 X 10 5 6.587 X 10 供试品溶液 6 2.442 X 10 1.387 X 10 6.841 X 10 m 醇 /A 醇 0.035 10/(1.043 105 ) 302 m s /A s 0.0733 10/(6.587 105 ) 试样含炔雌醇的量： r A 醇 c cc " 1.387 105 c 八 c/ \ m 醇 f 醇 m s 3.02 0.0733 10 0.449(mg) A s 6.841 105 每片含炔雌醇的量： 0 449 , 0.449 60.3 (0.0369mg/ 片) 17.测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品 解: c 样 /10 4250701 61.8 5997670 w% 50c 样 10 6 100% 17.4% 0.1255 A 样 第16章高效液相色谱法 【16-1】从分类原理、仪器构造及应用范围，简述气相色谱及液相色谱的异同点。 答：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行分离的。 从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与MS等联用。 二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。 【16-2】高效液相色谱仪由几大部分构成？各部分的主要功能是什么？ 答：高效液相色谱仪由高压输液系统，进样系统，分离系统，检测系统和记录系统五大部分组成。高压输液系统：主要是通过高压输液泵将溶剂储存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使试样在色谱柱中完成分离过程。 进样系统：把分析试样有效地送入色谱柱中进行分离。 分离系统：将试样各组分分离开来。 检测系统：对被分离组分的物理或物化特性有响应；对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应。记录系统：记录被分离组分随时间变化的信号。 【16-3】液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比其主要区别何在？ 答：液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以及柱外效应。在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。 【16-4】何谓化学键合相色谱、正相色谱和反相色谱？ 答：化学键合相色谱是指在化学键合固定相上进行物质分离的一种液相色谱法。 正相色谱是采用极性键和固定相流的相用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂。 反相色谱采用非极性键和固定相流的相为强极性的溶剂。 【16-5】何谓化学键合固定相？它的突出优点是什么？ 答：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面形成的固定相称为化学键合固定相。 优点: 固定相表面没有液坑,比一般液体固定相传质快的多；无固定相流失,增加了色谱柱的稳定性 离子色谱方法及应用 高迎新 离子色谱（简称IC-Ion Chromatography）是高效液相色谱（简称HPLC-High Performance Liquid Chromatography）的一种，是用于分离能在水中解离成有机和无机离子的一种液相色谱方法。从20世纪70年代中期问世以来，很快成为水溶液中阴、阳离子的重要分析手段。应用范围从分析水中常见的阴、阳离子和有机酸类，发展到分析极性有机化合物以及生物样品中的糖、氨基酸、肽、蛋白质等。 一、离子色谱方法的特点 对离子型化合物的测定是经典分析化学的主要内容。对阳离子的分析已有一些快速而灵敏的分析方法，如原子吸收、高频电感偶合等离子体发射光谱和X射线荧光分析等。而对于阴离子的分析长期以来缺乏快速灵敏的方法。一直沿用经典的容量法、重量法和光度法等。这些方法操作步骤冗长费时，灵敏低且易受干扰。而发展起来的离子色谱克服了以上缺点，具有快速、灵敏度高、选择性好、可同时测定多组分的优点。可以说，离子色谱对阴离子的分析是分析化学中的一项新突破。 1快速、方便对7种常见阴离子（F-、Cl-、Br-、NO3-、NO2-、SO42-、PO43-）和六种常见阳离子（Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+）的分析时间小于10min。如采用高效分离柱对上述七种常见阴离子的分离时间只需3min。 2 灵敏度高离子色谱分析的浓度范围为μg/L~ mg/L。当进样量为50μl时，常见阴离子的检出限小于是10μg/L。如增加进样量并采用小孔径柱（2mm直径）或在线浓缩时，检出限可达10-12g/L。 3 选择性好IC法分析无机和有机阴、阳离子的选择性主要由选择适当的分离和检测系统来达到的。由于IC的选择性，对样品的前处理要求简单、一般只需做稀释和过滤。 4 可同时测定多种离子化合物与光度法、原子吸收法相比，IC的主要优点是只需很短的时间就可同时检测样品中的多种成分。 5 分离柱的稳定性好、容量高 IC中苯乙烯/二乙烯苯聚合物是应用最广的填料。这种树脂的高pH稳定性允许用强酸或强碱作淋洗液，有利于扩大应用范围。样品分析时，溶解、稀释和过滤是前处理的主要工作。 超临界流体色谱 超临界流体色谱 基础导论 Terry A. Berger 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。? 安捷伦科技公司，2015 2015 年 7 月 1 日，中国印刷 5991-5509CHCN 目录 目录 III 前言 VI 作者简介 XI 引言 XIII 符号 XIV 缩写 XIV 1 超临界流体色谱简介 1 1.1 什么是 SFC 1 1.2 为什么采用 SFC 2 1.3 SFC 能够分离哪些化合物 12 1.4 这一名称的含义 16 2 流动相 19 2.1 为什么使用 CO2？ 19 2.2 使用 100% CO2 21 2.3 改性剂或共溶剂 23 2.4 添加剂 31 2.5 添加水以扩展溶质极性 34 3 固定相 35 3.1 材料 35 3.2 非手性键合相 35 3.3 固定相比较 40 3.4 填料粒径与色谱柱尺寸之间的关系 41 3.5 推荐的色谱柱尺寸 45 3.6 用于手性分离的色谱柱 48 III 4 流动相变量对保留值和选择性的影响 49 4.1 改性剂浓度 49 4.2 温度 50 4.3 压力 53 4.4 流速 55 4.5 可控变量对保留时间和选择性的影响概述 57 5 方法开发 58 5.1 溶质与固定相极性的匹配 58 5.2 极性窗口 60 5.3 入门指南 60 5.4 极性溶质 61 5.5 低极性溶质 64 5.6 多变量方法 65 6 非手性分离 66 6.1 案例研究 1 —典型的低极性样品 66 6.2 案例研究 2 —中等极性样品 71 6.3 案例研究 3 —磺胺类药物 83 6.4 其他结果 89 7 手性分离 90 7.1 背景 90 7.2 对映体过量率测定 91 7.3 用于手性分离的正相技术 91 7.4 可控变量对手性分离的影响 93 7.5 开发手性方法 98 IV 离子色谱法及液相色谱法（附答案） 一、填空题 1. 离子交换色谱主要用于有机和无机_____、_____离子的分离。答案：阴阳 2. 离子排斥色谱主要用于_____酸、_____酸和_____的分离。答案：有机无机弱醇类 3. 离子对色谱主要用于表面活性的_____离子、_____离子和_____络合物的分离。答案：阴阳金属 4. 离子色谱分析样品时，样品中离子价数越高，保留时间_____，离子半径越大，保留时间_____。 答案：越长越长 5. 在离子色谱分析中，为了缩短分析时间，可通过改变分离柱的容量、淋洗液强度和_____，以及在淋洗液中加入有机改进剂和用梯度淋洗技术来实现。答案：流速 6. 高效液相色谱紫外检测器属于_____型检测器，只适用于检测那些_____的物质。答案：选择能吸收紫外光二、判断题 1. 离子色谱(IC)是高效液相色谱(HPLC)的一种。( )答案：正确 2．离子色谱的分离方式有3种，即高效离子交换色谱(HPIC)、离子排斥色谱(HPIEC)和离子对色谱(MPIC)。它们的分离机理是相同的。( )答案：错误正确答案为：它们的分离机理是不同的。 3. 离子色谱分析中，其淋洗液的流速和被测离子的保留时间之间存在一种反比的关系。( 答案：正确4．当改变离子色谱淋洗液的流速时，待测离子的洗脱顺序将会发生改变。( 答案：错误 正确答案为：待测离子的洗脱顺序不会改变。 5. 离子色谱分析阳离子和阴离子的分离机理、抑制原理是相似的。( 答案：正确 6. 离子色谱分析中，水负峰的位置由分离柱的性质和淋洗液的流速决定，流速的改变可改变水负峰的位置和被测离子的保留时间。( 答案：正确 7. 离子色谱分析中，水负峰的位置由分离柱的性质和淋洗液的流速决定，流速的改变可改变水负峰的位置和被测离子的保留时间。（答案：正确 8. 离子色谱分析中，淋洗液浓度的改变只影响被测离子的保留时间，而不影响水负峰的位置。(答案：正确 9. 离子色谱中的梯度淋洗与气相色谱中的程序升温相似，梯度淋洗一般只在含氢氧根离子或甲基磺酸根的淋洗液中采用抑制电导检测时才能实现。( 答案：正确 10. 高效离子色谱用低容量的离子交换树脂。( 答案：正确 11. 离子排斥色谱(HPICE)用高容量的离子交换树脂。( 答案：正确 12. 色谱柱的分离度表示在一定的分离条件下两个组分在某个色谱柱上分离的好坏。( 答案：正确 13. 高效液相色谱梯度洗脱中的低压梯度又称内梯度，高压梯度又称外梯度。( 答案：错误 正确答案为：低压梯度又称外梯度，高压梯度又称内梯度。 14. 在正相键合液相色谱法中，固定相是极性的，流动相是非极性溶剂。( 答案：正确 15. 在正相键合液相色谱法中，流动相极性变小，色谱保留时间延长。( 答案：正确 第十八章高效液相色谱 法 Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】 第十八章 高效液相色谱法 15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为Zirchrom C8柱（20cm ×，5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含%三乙胺，磷酸调）（28：18：54）；以黄芩苷对照品配成浓度范围为～ml 的对照品溶液。进样，测得黄芩苷峰面积，以峰面积和对照品浓度求得回归方程为：A=××103，r=.精密称取黄芩颗粒，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml 于10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。平行测定供试品溶液和对照品溶液（ml ），得峰面积分别为4250701，5997670. 解：标样标样 A A c =c 599767042507018.6110 /=样c %4.17%1001255.01050%6=??=-样c w 16．校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量：ODS 色谱柱；甲醇-水（60：40）流动相；检测器UV280nm ；对硝基甲苯为内标物。 （1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml 溶液，进样10ul ，记录色谱图。重复三次。测得含ml 内标物、ml 炔诺酮和ml 炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表18-6。 （2）试样测定：取本品20片，精密称定，求出平均片重（片）。研细后称取（约相当于炔诺酮），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物ml ）。测得峰面积列于表18-6。 表18-6 复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（u v ·s ） 解：02.3) 10587.6/(100733.0)10043.1/(10035.0A /m A /m f 55s s =????==醇 醇醇 试样含炔雌醇的量：)mg (449.010841.610387.1100733.002.3A A m f m 55s s =?????=? ?=醇 醇醇 每片含炔雌醇的量：)/mg 0369.0(3.608 .732449.0片=? 17．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各 0.2000g 配成混合溶液。测得峰面积分别为, 和4.04cm 2。称取0.2400g 内标物和试样0.8560g 同法配制成溶液后，在相同色谱条件下测得峰面积为, 和4.54cm 2。计算试样中黄连碱和小檗碱的含量。 一、离子色谱（IC）基本原理 离子色谱是高效液相色谱（HPLC）的一种，其分离原理也是通过流动相和固定相之间的相互作用，使流动相中的不同组分在两相中重新分配，使各组分在分离柱中的滞留时间有所区别，从而达到分离的目的。 二、离子色谱仪的结构 离子色谱仪一般由四部分组成，即输送系统、分离系统、检测系统、和数据处理系统。输送系统由淋洗液槽、输液泵、进样阀等组成；分离系统主要是指色谱柱；检测系统（如果是电导检测器）由抑制柱和电导检测器组成。 离子色谱的检测器主要有两种：一种是电化学检测器，一种是光化学检测器。电化学检测器包括电导、直流安培、脉冲安培、和积分安培；光化学检测器包括紫外－可见和荧光。电导检测器是IC的主要检测器，主要分为抑制型和非抑制型（也称为单柱型）两种。抑制器能够显著提高电导检测器的灵敏度和选择性，其发展经历了四个阶段，从最早的树脂填充的抑制器到纤维膜抑制器，平板微膜抑制器和先进的只加水的高抑制容量的电解和微膜结合的自动连续工作的抑制器。 三、离子色谱基本理论 离子色谱主要有三种分离方式：离子交换离子排斥和反相离子对。这三种分离方式的柱填料树脂骨架基本上都是苯乙烯/二乙烯苯的共聚物，但是树脂的离子交换容量各不相同，以下就主要介绍离子交换色谱的分离机理。 在离子色谱中应用最广的柱填料是由苯乙烯-二乙烯基苯共聚物制得的离子交换树脂。这类树脂的基球是用一定比例的苯乙烯和二乙烯基苯在过氧化苯酰等引发剂存在下，通过悬浮物聚合制成共聚物小珠粒。其中二乙烯基苯是交联剂，使共聚物称为体型高分子。 典型的离子交换剂由三个重要部分组成：不溶性的基质，它可以是有机的，也可以是无机的；固定的离子部位，它或者附着在基质上，或者就是基质的整体部分；与这些固定部位相结合的等量的带相反电荷离子。附着上去的集团常被称作官能团。结合上去的离子被称作对离子，当对离子与溶液中含有相同电荷的离子接触时，能够发生交换。正是后者这一性质，才给这些材料起了“离子交换剂”这个名字。 离子交换法的分离基理是离子交换，用于亲水性阴、阳离子的分离。阳离子分离柱使用薄壳型树脂，树脂基核为苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物，核的表面是磺化层，磺酸基以共价键与树脂基核共聚物相连；阴离子分离柱使用的填料也是苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物，核外是磺化层，它提供了一个与外界阴离子交换层以离子离子键结合的表面，磺化层外是流动均匀的单层季铵化阴离子胶乳微粒，这些胶乳微粒提供了树脂分离阴离子的能力，其分离基理基于流动相和固定相（树脂）阳离子位置之间的离子交换。 淋洗液中阴离子和样品中的阴离子争夺树脂上的交换位置，淋洗液中含有一定量的与树脂的离子电荷相反的平衡离子。在标准的阴离子色谱中，这种平衡离子是CO 32-和HCO 3-；在标准的阴离子色谱中，这种平衡离子是H +。离子交换进行的过程中，由于流动相可以连续地提供与固定相表面电荷相反的平衡离子，这种平衡离子与树脂以离子对的形式处于平衡状态，保持体系的离子电荷平衡。随着样品离子与连续离子（即淋洗离子）的交换，当样品离子与树脂上的离子成对时，样品离子由于库仑力的作用会有一个短暂的停留。不同的样品离子与树脂固定相电荷之间的库仑力（即亲和力）不同，因此，样品离子在分离柱中从上向下移动的速度也不同。样品阴离子A -与树脂的离子交换平衡可以用下式表示： 阴离子交换 A - ＋（淋洗离子）－＋NR 4-R ＝ A -+NR 4-R ＋ （淋洗离子） 对于样品中的阳离子，树脂交换平衡如下（H +为淋洗离子）： 阳离子交换 C + ＋ H +－O 3S-R ＝ C +－O 3S-R ＋ H + 在阴离子交换平衡中，如果淋洗离子是HCO 3-，可以用下式表示阴离子交换平衡： [][][][]4 33 4NH CO H A HCO NR A K + ---+-= K 是选择性系数。K 值越大，说明样品离子的保留时间越常。选择性系数是电荷、离子半径、系统淋洗液种类和树脂种类的函数。 离子半径 样品离子的价数越高，对离子交换树脂的亲和力越大。因此，在一般的情况下，保留时间随离子电荷数的增加而增加。也就是说，淋洗三价离子需要采用高离子强度的淋洗液，二价离子可以用较低浓度的淋洗液，而低于一价离子，所需淋洗液浓度更低。 离子半径 第二十章高效液相色谱法 思考题和习题 1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测 不同点： 2．何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？ 采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。 目前常用的Si-O-Si-C型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。 3．什么叫正相色谱？什么叫反相色谱？各适用于分离哪些化合物？ 正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。 反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。 4．简述反相键合相色谱法的分离机制。 典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。 反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。对于反相色谱的分离机制 目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制可用疏溶剂理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的"分子毛"，这种"分子毛'有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂作用，将会从水中被＂挤＂出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用，其结果使组分分子在固定相得到保留。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减小保留值，此即解缔过程，显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般说来，固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越 离子色谱法测核电站各成分 关键词：离子色谱氟离子氯离子硫酸根离子镍基合金低合金钢标准物质北京标准物质网 1结果与讨论 1.1仪器工作条件的选择 在离子色谱分析中，淋洗液流速和浓度、分离系统温度均会对待测离子的保留时间和分离度产生影响，结合待测离子和干扰离子的保留特性及特点，经过调试选择淋洗液流速为 1.2 mL／min，选择 80 mmol／L 硼酸溶液与表 1 中梯度变化的氢氧化钾浓度在线生成梯度变化的四硼酸钾淋洗液，选择柱箱温度和色谱柱温度分别为25℃和 30℃。待测离子的定量是基于其峰面积的大小，在选定的淋洗液流速和浓度条件下，进样量和电导池温度均会对色谱峰的峰面积产生影响，经调试选择进样量为1 mL，电导池温度为 35℃。 根据硼酸和氢氧化钾发生化学反应的比例关系， 4 mmol／L 硼酸与 2 mmol／L 氢氧化钾生成 1 mmol／L 的四硼酸钾，在整个分析过程中四硼酸钾的浓度是依据氢氧化钾的变化而变化的。当氢氧化钾浓度为 6 mmol／L 时淋洗液组分为 3 mmol／L的四硼酸钾和过剩的硼酸溶液；当氢氧化钾为 40 mmol／L 时淋洗液组分为 20 mmol ／L 的四硼酸钾溶液，硼酸溶液全部参与反应，没有过剩的硼酸溶 液；当氢氧化钾浓度在 6～40 mmol／L 之间梯度变化时，四硼酸钾和过剩硼酸的浓度也在梯度变化。 结合淋洗液的浓度及梯度变化过程，选择抑制器电流为 120 mA，抑制器采用外加水模式，以纯水作为阴极侧和阳极侧的电解液，而不是将经电导池测量后流出的废液作为抑制器的电解液。 在选定的实验条件下，仪器的背景电导稳定在3.235～3.658 μS 之间，系统压力稳定在 14.4～14.7MPa (2 094～2 128 psi) 之间。 1.2方法的干扰及消除 在待测的 F–， Cl–, SO42-标准溶液中加入 NO2–， NO3–， PO43-干扰离子，进样分析，色谱图如图 1 所示。在选定的仪器配置及实验条件下，该方法对 F–， Cl–, SO42-，NO2–和PO43-有很好的分离和选择性。虽然进样体积较大 (1 mL)，导致出现一个较大的水负峰，但在对 F –进行积分时并不受水负峰干扰，并且与弱保留的有机酸离子可以很好地分离。虽然 NO3–和 CO32-的色谱峰重合，但由于 NO3–和 CO32-不是检测目标，不干扰 F–， Cl–, SO42-的测量，因此不予考虑。 在核电站正常运行过程中一回路冷却剂中添加了硼酸和氢氧化锂，并且硼酸浓度和氢氧化锂浓度不断变化。为验证加入硼酸和氢氧化锂是否对待测离子积分有影响，分别配制 10 μg／L F–， Cl–, SO42-标准溶液，硼含量为 1 000 mg／L 的 10 μg／L F–， Cl–, SO42- ICS-1100离子色谱仪简介 型号：ICS-1100 厂商：戴安(Dionex)公司 产地：美国 购置日期：2015.04 价格：25万元RMB 主要性能参数： 分析泵和输送装置：串联式双活塞往复泵，微处理器控制定冲程，最大操作压力35MPa(5000 psi)(PEEK材质)；流速范围0.00-5.00mL/min，压力范围0-5000 psi(PEEK泵头)，通过变色龙软件全程控制。 AS-DV技术指标：可放置50个样品瓶，使用5、0.5mL两种，传输体积：0.1~5.0mL，速度控制：0.1~5.0mL/min。 电导检测器：微处理-数字信号控制处理器，分辨率0.00238ns，满刻度输出范围0~15000μS。 抑制器：阴、阳离子抑制器容量分别为110、200微当量/min。 功能与应用： 可对样品中无机及部分有机阴、阳离子（包括氟离子、氯离子、溴离子、亚硝酸根离子、硝酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子、氨根离子、锂离子、钠离子、钾离子、镁离子、钙离子等）进行定性和定量分析。广泛应用于环境、电力、卫生、能源、农业、食品饮料、医药、检验、化学、工业、科研等领域。 ICS-1100离子色谱仪操作规程 一、开机 1、打开钢瓶气源开关，分压表调到0.2~0.3MPa。 2、调节淋洗液瓶上的减压阀到3~6Psi左右。 3、依次打开总电源开关、ICS-1100离子色谱仪开关、计算机电源开关。 4、计算机开启之后，待右下角变色龙服务器图标变灰色后，双击桌面的变色龙，打开控制面板。 二、平衡、运行样品 5、开泵，根据连接的柱子设定泵流速（常规色谱柱流速1.0或1.2mL/min)；设定柱箱温度(一般为30度)。 6、如仪器长时间不使用或更换淋洗液后，要先打开平衡泵头上的废液阀排气泡1~2min。 7、待控制面板上显示的系统压力上升至正常水平后，打开抑制器的开关，根据条件设置电流。 8、控制面板界面中点击蓝钮开始采集基线，系统平衡30分钟左右(具体情况需根据基 超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体即不是气体，也不是液体，而且一种介于二者之间的一种对分离很有利的流体。图：纯物质的相图 幻灯片6 6.1 超临界流体色谱法概述 超临界流体（Supercritical fluid, SF）： 性质介于液体和气体之间 §气体的低粘度，传质阻力小，可以快速高效的分离； §液体的高密度，适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质 SFC的扩散系数、粘度和溶解力都是密度的函数，可通过改变 SFC的密度调节组分分离。超临界流体的密度和压力有关。 幻灯片7 6.1 超临界流体色谱法概述 超临界流体色谱（s u p e r c r i t i c a l f l u i d c h r o m a t o g r a p h y）： 以超临界流体做流动相依靠流动相的溶剂化能力来进行分 离、分析的色谱过程。 1869年，Andrews首先发现临界现象以来，各种研究工作陆续展开： 1958年，James Lovelock首次提出设想。 1962年，Klesper第一篇关于用超临界流体二氯二氟甲烷和二氯二氟 甲烷作的流动相，分离镍卟啉异构体。 1966年，正戊烷为流动相，分析多环芳烃、染料和环氧树脂。 1968年，Gidding等以CO2和氨为流动相，分析核苷、糖、氨基酸、甾 醇、类固醇、类胡萝卜素等。 1981年，Novotay &Lee利用了毛细管柱超临界流体色谱才完善技术。 幻灯片8 6.2 超临界流体色谱的分类 超临界流体色谱分类 根据所用色谱柱不同 填充柱超临界流体色谱 packed column supercritical fluid chromatography, pcSFC 毛细管超临界流体色谱 capillary supercritical fluid chromatography 根据色谱过程的用途 分析型SFC 制备型SFC(超临界二氧化碳作为流动相) 幻灯片9 6.3 超临界流体色谱法的特点 超临界流体（Supercritical fluid, SF） 传质阻力小，可得到快速高效的分离；在较低温度下，可分析热不稳定性和分子量大的物质，同时还能增加柱子的选择性；流体的密度可改变流体的性质。 幻灯片10 6.3 超临界流体色谱法的特点 离子色谱法（IC） 一、离子色谱（IC）基本原理 离子色谱是高效液相色谱（HPLC）的一种，其分离原理也是通过流动相和固定相之间的相互作用，使流动相中的不同组分在两相中重新分配，使各组分在分离柱中的滞留时间有所区别，从而达到分离的目的。 二、离子色谱仪的结构 离子色谱仪一般由四部分组成，即输送系统、分离系统、检测系统、和数据处理系统。输送系统由淋洗液槽、输液泵、进样阀等组成；分离系统主要是指色谱柱；检测系统（如果是电导检测器）由抑制柱和电导检测器组成。 离子色谱的检测器主要有两种：一种是电化学检测器，一种是光化学检测器。电化学检测器包括电导、直流安培、脉冲安培、和积分安培；光化学检测器包括紫外－可见和荧光。电导检测器是IC的主要检测器，主要分为抑制型和非抑制型（也称为单柱型）两种。抑制器能够显著提高电导检测器的灵敏度和选择性，其发展经历了四个阶段，从最早的树脂填充的抑制器到纤维膜抑制器，平板微膜抑制器和先进的只加水的高抑制容量的电解和微膜结合的自动连续工作的抑制器。 三、离子色谱基本理论 离子色谱主要有三种分离方式：离子交换离子排斥和反相离子对。这三种分离方式的柱填料树脂骨架基本上都是苯乙烯/二乙烯苯的共聚物，但是树脂的离子交换容量各不相同，以下就主要介绍离子交换色谱的分离机理。 在离子色谱中应用最广的柱填料是由苯乙烯-二乙烯基苯共聚物制得的离子交换树脂。这类树脂的基球是用一定比例的苯乙烯和二乙烯基苯在过氧化苯酰等引发剂存在下，通过悬 浮物聚合制成共聚物小珠粒。其中二乙烯基苯是交联剂，使共聚物称为体型高分子。 典型的离子交换剂由三个重要部分组成：不溶性的基质，它可以是有机的，也可以是无机的；固定的离子部位，它或者附着在基质上，或者就是基质的整体部分；与这些固定部位相结合的等量的带相反电荷离子。附着上去的集团常被称作官能团。结合上去的离子被称作对离子，当对离子与溶液中含有相同电荷的离子接触时，能够发生交换。正是后者这一性质，才给这些材料起了“离子交换剂”这个名字。 离子交换法的分离基理是离子交换，用于亲水性阴、阳离子的分离。阳离子分离柱使用薄壳型树脂，树脂基核为苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物，核的表面是磺化层，磺酸基以共价键与树脂基核共聚物相连；阴离子分离柱使用的填料也是苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物，核外是磺化层，它提供了一个与外界阴离子交换层以离子离子键结合的表面，磺化层外是流动均匀的单层季铵化阴离子胶乳微粒，这些胶乳微粒提供了树脂分离阴离子的能力，其分离基理基于流动相和固定相（树脂）阳离子位置之间的离子交换。 淋洗液中阴离子和样品中的阴离子争夺树脂上的交换位置，淋洗液中含有一定量的与树脂的离子电荷相反的平衡离子。在标准的阴离子色谱中，这种平衡离子是CO 32-和HCO 3-；在标准的阴离子色谱中，这种平衡离子是H +。离子交换进行的过程中，由于流动相可以连续地提供与固定相表面电荷相反的平衡离子，这种平衡离子与树脂以离子对的形式处于平衡状态，保持体系的离子电荷平衡。随着样品离子与连续离子（即淋洗离子）的交换，当样品离子与树脂上的离子成对时，样品离子由于库仑力的作用会有一个短暂的停留。不同的样品离子与树脂固定相电荷之间的库仑力（即亲和力）不同，因此，样品离子在分离柱中从上向下移动的速度也不同。样品阴离子A -与树脂的离子交换平衡可以用下式表示： 阴离子交换 A - ＋（淋洗离子）－＋NR 4-R ＝ A -+NR 4-R ＋ （淋洗离子） 对于样品中的阳离子，树脂交换平衡如下（H +为淋洗离子）： 阳离子交换 C + ＋ H +－O 3S-R ＝ C +－ O 3S-R ＋ H + 在阴离子交换平衡中，如果淋洗离子是HCO 3-，可以用下式表示阴离子交换平衡： [][][][]4 33 4NH CO H A HCO NR A K + ---+-= K 是选择性系数。K 值越大，说明样品离子的保留时间越常。选择性系数是电荷、离子半径、系统淋洗液种类和树脂种类的函数。 离子半径 样品离子的价数越高，对离子交换树脂的亲和力越大。因此，在一般的情况下，保留时间随离子电荷数的增加而增加。也就是说，淋洗三价离子需要采用高离子强度的淋洗液，二价离子可以用较低浓度的淋洗液，而低于一价离子，所需淋洗液浓度更低。 气相色谱法8 ●8.1气相色谱法简介 ●8.2气相色谱仪 ●8.3气相色谱的实验技术 ●8.4毛细管气相色谱 ●8.5顶空气相色谱 ●8.6裂解气相色谱 ●8.7气相色谱法应用 8.1气相色谱法简介 1.定义：以气体作为流动相的色谱法。 2.原理及适用范围：利用物质的沸点、极性及吸附性的差异来实现混合物的分离，广泛应用于气体和易挥发物质的分析。 3.特点 ●高选择性 ●高分离效能 ●高灵敏度 4.发展 ●1941年Martin和Synge 发明液-液（分配）色谱法，阐述了气-固吸附色谱原理，提 出气-液色谱法设想； (1952 年诺贝尔化学奖) ●色谱学成为分析化学的重要分支学科，是以气相色谱的产生、发展为标志。 ●1952年Martin成功研究出气-液色谱法，解决了脂肪酸、脂肪胺的分析，并对其理论 和实践作出论述；（起点） ●1954年，Ray把热导池检测器用于气相色谱仪，并对仪器作了重大改进，扩大应用范 围； ●1956年，荷兰学者Van Deemter 提出气相色谱速率理论，奠定了理论基础； ●1957年美国工程师Golay发明效能极高的毛细管色谱柱； ●1958年澳大利亚学者Mcwilliam发明氢焰离子化检测器，使分离效能和检测器的灵敏 度大大提高。 5.气相色谱法分类 ●分类方式很多 气相色谱:（1）按固定相的状态分--气固色谱和气液色谱 （2）按使用的色谱柱分--填充柱气相色谱和毛细管柱气相色谱 如按进样方式不同分类：顶空气相色谱和裂解气相色谱等，其体系及仪器构成类似。 8.2 气相色谱仪 8.2.1结构框图 放空 8.2.2载气系统 1.作用：提供流量稳定的、持续的、纯净的载气。 2.组成： （1）载气：常用有氮气、氢气、氦气载气钢瓶： （2）净化器：除载气中水和有机杂质等（依次通过活性炭、分子筛、氧化铝、硅胶等) （3）载气流速、压力控制：控制载气流速恒定。（包括压力表、流量计、稳压阀等） 3.流量计： （1）转子流量计 （2）电子压力流量计 4.钢瓶与减压阀 钢瓶样色对应气体种类：H2绿色，He 暗灰色，O2蓝色，N2黑色、CO2银灰色 8.2.3进样系统 1.要求气密性好 2.气化室：将液体试样瞬间气化的装置 3.进样方式：（1）液体直接进样（2）顶空进样 利用被测样品（气-液和气-固）加热平衡后，取其挥发气体部分进入气相色谱仪分析。 固相微萃取进样 固相微萃取技术是20世纪90年代兴起的一项新颖的样品前处理与富集技术。 8.2.4分离系统 Detector W 载气系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理及控制系统 温度控制系统 离子色谱复习题 -、填空题（20题） 1．离子色谱是色谱的一种,是色谱。 答案：高效液相分析离子的液相 2．离子色谱按不同的分离机理可分为、和。 答案：高效离子色谱离子排斥色谱离子对色谱 《离子色谱方法及应用》P3 3．离子色谱系统由、、、、、和等部分组成。 答案：淋洗液存贮器输液泵进样阀分离柱抑制柱检测器数据处理机（或记录仪）4．离子交换色谱主要用于和离子的分离。 答案：有机无机阴、阳《离子色谱方法及应用》P4 离子排斥色谱主要用于、和的分离。 答案：有机酸无机酸醇类《离子色谱方法及应用》P4 离子对色谱主要用于活性的、和的分离。 答案：阴离子阳离子金属络合物《离子色谱方法及应用》P4 5．各种类型的离子交换剂都是通过其功能基所络合的离子与外界的其它离子间发生或作用达到物质的目的。 答案：同电荷、置换、络合、分离。 6．1975年Small等人用型阳离子交换树脂作为离子色谱的分离柱。 答案：低容量薄壳 7．Small等人巧妙地在离子色谱分析流程中引入了柱,成功地解决了待测离子在电导检测器上信号被的问题。 答案：抑制掩盖 8·抑制器主要起和的作用。 答案：降低淋洗液的背景电导增加被测离子的电导值，改善信噪比 《离子色谱方法及应用》P35 9·离子色谱对阴离子分离时,抑制柱填充交换树脂。 答案：强酸性(H+)阳离子 10·离子色谱对阳离子分离时,抑制柱填充交换树脂。 答案：强碱性(OH-)阴离子 11．用于碱金属和铵离子分离用的离子色谱淋洗液主要有 答案：硝酸、盐酸和高氯酸溶液。 12．离子色谱分析阴离子时，通常使用、做为淋洗液。 答案：Na2B4O7-H3BO3、NaHCO3-Na2CO3、、稀硝酸、稀稀盐酸。 离子色谱法原理、优点和应用领域 从一九七五年离子色谱法(Ion Chromatography)产生到现在，快速的历经了四十多年发展，离子色谱法凭借其独特的优势逐渐成为离子型物质、有机酸与糖类分析的常用方法。随着国家对环境的日益重视以及离子色谱相关技术的不断改进，以后离子色谱在环境、食品、制药、生物医学等领域的应用前景可期。现在从离子色谱法的原理、优点和应用领域开始，给大家介绍离子色谱法的炫彩。 离子色谱的原理 各位深知的色谱技术是利用待分离混合物中物理化学性质的差别，使得各组分以不同程度分配在固定相和流动相中，因各组分随流动相前进速度不同，从而有效分离各组分（即俗称的过柱子）。而离子色谱作为一种特殊的高效液相色谱，也是基于物理分离方法。 离子色谱可以分为三种类型：离子交换色谱、离子排斥色谱和离子对色谱，其中应用非常广泛的就是离子交换色谱（即高效离子交换色谱）。离子交换色谱柱主要填料类型为有机离子交换树脂。填料以苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚体为骨架，在苯环上引入磺酸基，形成强酸型阳离子交换树脂，或引入叔胺基而成季胺型强碱性阴离子交换树脂。此交换树脂具有大孔、薄壳型或多孔表面层型的物理结构，以便于快速达到交换平衡。离子交换树脂的优点是耐酸碱，可在任何pH范围内使用，易再生处理、使用寿命长，缺点是机械强度差、易溶易胀、受有机物污染。 以离子交换树脂为固定相的离子色谱通常以酸性或碱性水溶液为流动相，依据不同待测离子与固定相的离子交换能力的差异最终实现分离。各待测组分与离子交换剂之间的亲和力与离子半径，电荷，离子的存在形式等相关。亲和力越大，待测物在固定相中的保留时间越长。 随着技术的不断进步，不可溶不可电离的物质也可通过前处理（诸如燃烧、高温水解、化学转化溶解等）转化成可检测的形态（离子态）。 离子色谱的优点 ①同时分析多种离子 高效液相色谱法Newly compiled on November 23, 2020 第十八章 高效液相色谱法 15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为Zirchrom C8柱（20c m ×， 5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含%三乙胺，磷酸调）（28：18：54）；以黄芩苷对照品配成浓度范围为～ml 的对照品溶液。进样，测得黄芩苷峰面积，以峰面积和对照品浓度求得回归方程为：A=××103，r=.精密称取黄芩颗粒，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml 于10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。平行测定供试品溶液和对照品溶液（ml ），得峰面积分别为4250701，5997670. 解：标样标样 A A c =c 599767042507018.6110 /=样c %4.17%1001255.01050%6=??=-样c w 16．校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量：ODS 色谱柱；甲醇-水（60：40）流动相；检测器UV280nm ；对硝基甲苯为内标物。 （1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml 溶液，进样10ul ，记录色谱图。重复三次。测得含ml 内标物、ml 炔诺酮和ml 炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表18-6。 （2）试样测定：取本品20片，精密称定，求出平均片重（片）。研细后称取（约相当于炔诺酮），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物ml ）。测得峰面积列于表18-6。 表18-6 复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（u v ·s ） 解：02.3)10587.6/(100733.0)10043.1/(10035.0A /m A /m f 55s s =????==醇 醇醇 试样含炔雌醇的量： )mg (449.010841.610387.1100733.002.3A A m f m 55s s =?????=??=醇 醇醇离子色谱原理
第十八章高效液相色谱法
第16章高效液相色谱法
离子色谱方法及应用
超临界流体色谱-Agilent
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