肿瘤血管生成抑制剂筛选模型的研究进展
肿瘤血管生成抑制剂筛选模型的研究进展葛慧，张洪泉（扬州大学医药研究所药理研究室，扬州225001）
[摘要] 目的：介绍肿瘤血管生成抑制剂（tumor angiogenesis inhibitor，TAl）筛选模型的研究进展。方法：查阅国内外相关文献进行分析和归纳。结果：TAI的筛选主要依赖于采用形态学检测法测定血管的生成活性。TAI筛选的程序为：体外筛选→体内筛选→应用肿瘤模型进行全面最终的评价。结论：TAI对于肿瘤治疗有重要作用，其筛选模型的研究取得突破性进展。
[关键词] 血管生成抑制剂；药物筛选试验，抗肿瘤；综述
[中图分类号] R 965.1 [文献标识码] A [文章编号] 1671-2838（2005）04-0381-04
Advances in research on screening modelS OftUmot angiOgenesiS inhibitors
GE Hui，ZHANG Hong-Quan（Department OfPharmacology，Institute OfMedlclne and Pharmacy，Yangzhou University，Yangzhou 225001，China）[ABSTRACT] Objective：TO review advances in research on tumor angiogenesis inhibitors（TAl）．Methods：The domestic and foreign relevant literature was sunnnarized and analysed．Results：The methods fOr screening TAl were mainly deterlnining the angio-genesis activity．The morphology assay was adopted tO measure the angiogenesis activity．The procedures were screening in vitro→screening in vivo→using tumormodels tO carry out overall and final appraisal.Conclusion：TAI has important effects On cancerthera-py．The studies Ofscreening mOdels OfTAI have already got breakthrough．
[KEYWORDS] angiogenesis inhibltors；drugscreeningassay，antitunior；review
[Pharm Care & Res，2005，5（4）：381-384] 肿瘤血管生成抑制剂（tumor angiogenesis inhibi-tor，TAl）能抑制血管生成，阻止肿瘤生长和转移。TAT治疗肿瘤具有副作用小、不易产生耐药性等优点。
近年来这类药物的研究已取得突破性进展，可望进入临床成为一类崭新的、有希望的抗肿瘤药物]1[。本文就目前常用的TAI筛选模型作一简要介绍。
1、肿瘤发展依赖血管生成的机制
1971年Folkman在《新英格兰医学杂志》（N Engl J Med）上首次提出肿瘤生长依赖血管形成的概念：当肿瘤直径超过2mm时，直接由微环境提供的营养就不能满足其生长需要，此时肿瘤的生长依赖于新生血管运送营养物质。新血管的生成是一个多步骤的、受多因素调控的复杂过程]2[，这一过程包括：促血管生成因子的分泌、血管内皮基底膜的降解、内皮细胞的迁移与增殖
新的血管环与基
、
底膜的形成。目前专家认为血管生成是正性和负性调节因子共同作用的结果]3[，已发现的正负调节因子有60余种。正性调节因子有：碱性成纤维细胞生长因子（bFG F）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血管生成素等。它们可以直接刺激血管内皮细胞的生长，或通过促使宿主细胞释放有关生长因子来刺激血管内皮细胞的增生。血管内皮细胞受刺激后基底膜降解，内皮细胞数增多，浸润到血管周围基质，降解细胞外间质并向血管生成因子产生的方向移动，在肿瘤组织内形成新的血管。负性调节因子包括天然的和合成的两大类，宿主细胞产生的天然因子有：血管抑制素、内皮抑制素、生长抑素等。化学合成的有：基质金属蛋白酶抑制剂、黏附分子的拮抗剂、烟曲霉素及其衍生物TNP-470等。它们的功能是抑制内皮细胞的增殖、游走、基底膜的降解以及基底膜与生长因子结合等]5,4[。正常情况下正负因子的调节保持动态平衡关系，一旦失衡
成的开关平衡假说]6[。
则导致新血管的生成，此即血管
形
2、肿瘤血管生成活性的检测
TAI的筛选主要依赖于血管生成活性的检测。为了对大量TAI进行快速、高效、低成本、微量化的筛选，必须采用高灵敏的检测系统和数据采集处理系统。在此简单介绍几种常用的检测方法。
2.1 形态学检测法将肿瘤组织移植到鸡胚绒毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane）、仓鼠颊窝、兔耳等部位，在显微镜下观察肿瘤组织诱导血管生成的
情况，计数微血管密度最高的区域即“热点”区的血管数，也可用电镜观察肿瘤结节内及邻近组织中的微血管结构和毛细血管超微结构。
2.2 免疫学检测用凝血因子Ⅷ、CD31等来标记内皮细胞，通过检测标记物浓度可检测血管生成活性。新近采用一种近红外（near infrare，NIR）荧光探针（Cv5.5）标记内皮细胞，选择“热点”区域，计数或采用计算机图像分析系统，对血管生成进行定量分析，并能选择性地定位肿瘤组织]7[。
2.3 影像学检测彩色多普勒超声可全面反映肿瘤血流情况，包括血流速度、方向，是否为层流或湍流等特征，但此法对血管生成的定量分析效果较差。
3、血管生成抑制剂的筛选
筛选的程序一般先经分子、细胞水平的体外筛选，再经组织、器官水平的体内筛选，最后应用肿瘤模型进行全面最终的评价。体外筛选操作较简单，容易控制。体内筛选的优点是实验条件比较接近药物在人体内使用的环境。
3.1 体外筛选
3.1.1 血管内皮细胞模型血管内皮细胞是进行TAI筛选的主要的细胞模型，国际上现在采用较多。如人脐静脉血管内皮细胞ECV304。该模型的主要检测指标有：细胞增殖率（可通过2.1所述的形态学方法检测）与药物促进内皮细胞形成管腔的能力。血管生成过程中内皮细胞会形成细胞条索，然后形成管状，体外培养的血管内皮细胞在特定条件下也可以形成细胞条索状。在含有TAI药物和不含有TAI 药物的胶原凝胶中分别培养内皮细胞4d后，在显微镜下比较它们形成的管腔数目]8[，可用来评定TAI对新生血管的抑制作用。最近国外有学者将人类的端粒酶催化蛋白（h T ERT）的基因导入内皮细胞，使其永生化，形成的新细胞株被命名为HMVEC，它不仅保留了原代内皮细胞（HMEC-1）的固有特征，且避免了用HMEC-1作为体外筛选模型时可能出现的原有血管的干扰现象]9[，并且对VEGF的抑制作用特异性很高，有希望成为理想的体外模型。
3.1.2 血管生成因子模型血管生成因子的检测研究较多的是VEGF和bFGF。选择血管生成因子高表达的实体瘤细胞株体外培养，加入待检物质作用?4h后，应用免疫酶标法、同位素标记法等检测血管生成因子含数。通过待检物质是否影响肿
瘤细血管生成。
3.1.3 高通量筛选模型（high throughput screening，HTS）近年来肿瘤新生血管相关基因组的研究为TAI的筛选提供了新靶点，从而有条件进行针对特定基因型药物的研发]10[。基因重组是近年来发展起来的一项新技术，可使用基因重组技术制备与肿瘤血管生成密切相关的受体，如VEGF受体、bFGF受体等，建立TAI的HTS模型。重组受体具有纯度高、制备量大、成本低等优点，因此使用基因重组进行药物筛选具有广阔的前景]11[。
3. 2 体内筛选
TAI的筛选，必须建立组织、器官水平的体内模型，经这些模型评价有效后，才能进入下一阶段的研究。近年来常采用的体内模型有：鸡胚绒毛尿囊膜模型、鼠耳模型、基质胶塞模型（matri-gel plug）、啮齿动物的角膜微囊（microdocket corne-。）模型等。建立这些模型都是为了寻找无血管区域或原血管能明显与新生血管相区别的区域进行TAI的筛选。
3.2.1 鸡胚绒毛尿囊膜模型鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成早期，机体免疫系统尚未完全建立，因此鸡胚绒毛尿囊膜对各种异物几乎不发生排斥反应，便于将含有TAI的载体置于其表面，观察TAI对血管生成的影响。Bernardini等]12[建立了一种鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的定量分析法：将鸡胚胎放在直径100mm无菌的玻璃平皿内，加入5mL培养液，在无菌恒温箱中孵育到第9天的生长高峰时，将浸泡过TAI的明胶海绵置于鸡胚绒毛尿囊膜表面。由两个实验人员同时在250倍显微镜下随机取6个视野，记数“热点”区的新生血管数，计算平均值。
3.2.2 鼠耳模型李凌等]13[利用绿色荧光蛋白（GFP）基因标记膀胱癌细胞BTT739株，把含有1×103～1
104个标记后的癌细胞悬液接种于半透明的鼠耳皮下，借
×
助荧光显微镜及血管造影观察肿瘤生长所造成的局部血管改变和新血管的生成情况。通常于接种后立即观察并摄像记录肿瘤细胞的数量和分布，此后每天或隔天麻醉小鼠后用荧光显微镜观察耳部血管改变，发现接种3-4d时肿瘤细胞附近的小血管和毛细血管管腔扩张和弯曲最为明显，5-10d后可见血管出芽及新生血管形
成。连续血管造影可显示血管生成的动态变化过程，此时注射TAT于鼠耳下，观察其对血管新生的抑制作用。此模型操作简便，且对动物损伤较小，并能反映TAI 抑制肿瘤新血管生成的实际过程。
3.2.3 基质胶塞模型此模型]14[被广泛用于评价生长因子的促血管新生能力，如VEGF。基质胶在4℃的时候是液态，37℃时能够形成固体凝胶。把0.5ml的基质胶与生长因子混合后注射到荷瘤小鼠腹部皮下组织，在小鼠体温的条件下基质胶很快形成固体凝胶。4-5d后相邻组织新生血管出芽，生长因子缓慢释放渗入组织中；7-10d后处死小鼠，取出基质胶塞进行10%甲醛固定、石蜡包埋、切片染色、组织学检查，图像分析塞内的总血管面积，可以对血管生成进行定量分析，以评价TAT 疗效。
3.2.4 角膜微囊模型此模型多采用啮齿动物如兔、鼠的角膜，与TAT的其他体内模型相比，用角膜微囊时对动物的操作更简便，由于角膜本身无血管，因此只要观察到血管进入角膜即可认为是新血管生成，可以避免其他模型中原有血管干扰的影响。尤其是用兔角膜可直观监测肿瘤血管生成和炎性反应的过程。重组生长因子、细胞悬液或组织标本加入TAI后制成可缓慢释放的小丸置入微囊，Bernardini等]12[将体重为2-3kg的健康新西兰白兔麻醉后，在离角膜边缘2.5-3mm 处用虹膜刀植入3mm×1.5mm×3mm微囊，3-4d后血管丛边缘出芽，7-10d内新生毛细血管进入微囊。通过计数囊内新生毛细血管数和生长率可评价TAT对血管新生的抑制作用。
3.3 肿瘤模型
肿瘤模型是用来检测药物的抗血管生成和抗肿瘤作用的最终模型，前者以小鼠Lewis肺癌、黑素瘤B16为主，后者最常用的是裸小鼠异种移植模型]15[：把肿瘤细胞接种到裸小鼠皮下，给药期间测量肿瘤的三维直径，同时还可测定肿瘤组织中的血管密度，电镜观察血管内皮细胞的状态，检测体液中血管生成因子及其受体的表达量来判定该物质抑制体内血管生成的能力。
4、讨论
抑制肿瘤血管生成已被公认为一种崭新的抗癌手段。随着TAI研究开发的深
入，新的药物将不断涌现并逐步从实验室走向临床，为抑制肿瘤的增殖、预防肿瘤的转移和复发，提高患者的生存质量起到重要的作用。目前，TAI的研究中仍有许多值得关注、亟待解决的问题]16[，如：TAI作用的具体的分子机制还不十分清楚；TAI不仅抑制肿瘤血管生成，长期使用有可能会影响正常情况下如伤口愈合期、女性月经期和妊娠期的血管生成；且TAI只是抑制肿瘤的生长，不能彻底杀死肿瘤细胞，停药后肿瘤即可恢复生长。因此，必须将它与放疗、化疗及介入疗法等相结合，以达到最佳的治疗效果。
近年来，发现许多中药的有效成分能抑制肿瘤血管生成，促进肿瘤细胞凋亡，如：姜黄素、雷公藤红素、人参皂苷等]18,17[。随着研究的深入，通过建立更理想的筛选模型，将会发现来自中药和海洋生物中的、具有独特立体化学结构、药理学和药动学特性的成分。
[参考文献]
（1）：3,16-二羧基-羊毛甾烷-7,9（11） [4]许先栋，许 津，顾慧儿，等。茯苓环酮 24（31）-三烯-21-羧酸：（II ）：3-羰基-6, 双烯三萜酸的晶体结构和分子结构研究[J]. 16-二烃基-羊毛甾烷-7,9,26-三烯-23- 中国药物化学杂志，1994,4（1）：23.
羧酸 [收稿日期]2004-12-10 [修回日期]2005-05-10
[本文编辑] 张莉 姚春芳
参考文献(18条)
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肿瘤血管生成抑制剂筛选模型的研究进展葛慧，张洪泉（扬州大学医药研究所药理研究室，扬州225001） [摘要] 目的：介绍肿瘤血管生成抑制剂（tumor angiogenesis inhibitor，TAl）筛选模型的研究进展。方法：查阅国内外相关文献进行分析和归纳。结果：TAI的筛选主要依赖于采用形态学检测法测定血管的生成活性。TAI筛选的程序为：体外筛选→体内筛选→应用肿瘤模型进行全面最终的评价。结论：TAI对于肿瘤治疗有重要作用，其筛选模型的研究取得突破性进展。 [关键词] 血管生成抑制剂；药物筛选试验，抗肿瘤；综述 [中图分类号] R 965.1 [文献标识码] A [文章编号] 1671-2838（2005）04-0381-04 Advances in research on screening modelS OftUmot angiOgenesiS inhibitors GE Hui，ZHANG Hong-Quan（Department OfPharmacology，Institute OfMedlclne and Pharmacy，Yangzhou University，Yangzhou 225001，China）[ABSTRACT] Objective：TO review advances in research on tumor angiogenesis inhibitors（TAl）．Methods：The domestic and foreign relevant literature was sunnnarized and analysed．Results：The methods fOr screening TAl were mainly deterlnining the angio-genesis activity．The morphology assay was adopted tO measure the angiogenesis activity．The procedures were screening in vitro→screening in vivo→using tumormodels tO carry out overall and final appraisal.Conclusion：TAI has important effects On cancerthera-py．The studies Ofscreening mOdels OfTAI have already got breakthrough． [KEYWORDS] angiogenesis inhibltors；drugscreeningassay，antitunior；review [Pharm Care & Res，2005，5（4）：381-384] 肿瘤血管生成抑制剂（tumor angiogenesis inhibi-tor，TAl）能抑制血管生成，阻止肿瘤生长和转移。TAT治疗肿瘤具有副作用小、不易产生耐药性等优点。
酶抑制剂筛选模型研究进展
酶抑制剂筛选模型研究进展 通过查阅文献，综述目前酶抑制剂筛选的主要模型，包括动物模型、高通量筛选模型及固定化酶反应器。并对其应用原理、应用情况及优缺点进行了阐述。 标签：酶抑制剂；筛选模型；靶点；验证 20世纪60年代，日本科学家梅译滨夫提出了酶抑制剂的概念，从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。随着酶学研究的深入，对酶结构的认识，已能在分子水平上认识酶的作用机制，并根据酶的作用原理来设计各种酶的专一抑制剂作为药物，来调节体内的异常代谢。 酶抑制剂作为药物的治疗基础是通过限制酶催化底物的反应能力，使底物浓度增高或代谢产物浓度降低，以达到改善症状的目的。在一系列酶促反应中，以抑制限速酶或关键酶的效果最好。在目前上市的药物中，以受体为靶点的药物占52%，以酶为靶点的药物占22%，以离子通道为靶点的药物占6%，以核酸为靶点的药物占3%。酶抑制剂的开发是新药的重要来源。随着现代生物科学技术的发展，酶抑制剂作为药物越来越受到医药界的重视。 药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性（生物活性、治疗作用）的实验方法，是寻找和发现药物的重要途径之一。在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，在新药发现和研究中发挥了积极的作用。随着生命科学的发展，新的药物筛选模型不断出现，不仅促进了药物的发现，而且对药物筛选的方法、理论、技术都产生了巨大影响[1]。 酶抑制剂的筛选模型主要为动物模型和细胞分子水平筛选模型。动物模型由于规模小、效率低、样品量大、成本高等缺点，不适合作为药物初筛的模型。细胞和分子水平的筛选模型，具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模筛选和一药多筛等特点[1]，已成为目前酶抑制剂筛选的主要方法。本文就近几年来酶抑制筛选的主要模型进行综述。 1 高通量筛选模型 高通量筛选是以分子细胞水平的实验方法为基础，以微型板为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，同时对数以万计的样品进行检测。高通量筛选以其高效、快速的优点，已成为酶抑制剂新药发现的主要手段。酶抑制剂的高通量筛选模型，主要为分子水平的筛选模型，也有少量细胞水平的筛选模型。筛选以酶为作用靶点的药物，不仅要观察酶与药物的结合，更要观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点，酶的反应底物和产物都可作为检测指标[2]。以酶为作用靶点的高通量检测方法，绝大多数是直接检测酶的活性，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类[3]。
最新抗肿瘤血管生成药品
目前，威胁人们生命的恶性肿瘤发病率逐年上升，医学专家们一直在寻找能遏制癌细胞的新药，最新研究结果显示：Avastin(贝伐单抗)能抑制多种恶性肿瘤的生长和转移，并很少产生化疗常见的副作用。 血管生成对正常成人的作用有限，只出现在伤口愈合和胚胎发育的过程中。在血管生成过程中，VEGF（表皮生长因子)蛋白刺激血管的生长、存活和修复。为了获取维持生长所必需的营养和氧气，肿瘤形成自己的血管。这种肿瘤形成新生血管的过程称肿瘤血管生成，而肿瘤血管生成对于肿瘤生长和扩散（转移）到机体其他部位是一个必不可少的过程。Avastin是一种抗体，能特异性结合并抑制VEGF（促进肿瘤血管生成的关键因素），从而有利于控制肿瘤的生长和转移。 Avastin使肿瘤周围的小血管收缩，有利于阻断肿瘤生长所需的氧气和营养供应。肿瘤形成的新生血管还不成熟，易渗漏。因新生血管具有这种异常通透性，可妨碍抗癌药物的治疗，如化疗。而Avastin能促使已有的成熟血管改变形状，使总体治疗策略的疗效得到最大限度的发挥。另外，Avastin抑制新生血管的生长，进一步限制了肿瘤的血液供应。 目前为止，超过500000名患者接受过Avastin治疗。针对Avastin治疗不同阶段（晚期或早期）的各种肿瘤(包括结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、脑癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌等)，全球正开展一个综合性的临床研究项目，含450多项临床试验。 在欧洲，Avastin已获准用于四种常见癌症晚期阶段的治疗，包括结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌和肾癌。这几种癌症每年导致近300万人死亡。在美国，Ava stin是获得FDA批准的首个抗血管生成药物，用于乳腺癌、结肠直肠瘤、恶性胶质瘤的治疗。 最新抗肿瘤血管生成药品 公司名称：陕西西安盛合治公司 联系人：袁媛女士 ( 业务员 )
抑制血管生成与肿瘤治疗
抑制血管生成与肿瘤治疗 肿瘤的生长是血管生成依赖性的，通过抑制肿瘤血管的生成应该可以达到抑制肿瘤生长和转移的目的。肿瘤血管的生成是一个多步骤的过程，阻断其中任何一步，都将可能阻止肿瘤血管生成，因此肿瘤的血管系统己成为一个崭新的抗肿瘤治疗靶点。如抑制促血管生成因子与相应受体结合，阻断信号传导通路，抑制内皮细胞的生长;抑制降解基底膜的酶的活性，组织内皮细胞向外移动形成细胞索，抑制血管形成;抑制破坏茹附分子，使内皮细胞无法与基底膜乳附，抑制形成管腔等，这些手段均可有效阻断血管的生成。肿瘤血管生成抑制剂作用于肿瘤内皮细胞，阻止其增殖、迁移、出芽及形成新生血管，并诱导不成熟内皮细胞趋向凋亡，抑制肿瘤生成和转移，具有良好的特异性和针对性。近年来，这类抑制剂的研究已取得新的进展，有望成为抗肿瘤治疗的新方法。虽然到目前为止，还没有一种抗血管生成的药物能够单独消退肿瘤，但这些药物能够延缓肿瘤生长进程，使其更加稳定，而且和别的抗肿瘤药物合用，有明显的协同作用。 一、血管内皮生长因子与肿瘤治疗 由于VEGF是目前发现的诱导肿瘤血管形成作用最强和最具特异性的生长因子，故VEGF/VEGFR信号转导通路被认为是最有前途
的靶点。而大量的研究结果也表明，抑制VEGF的表达或者活性在动物以及人类肿瘤中均能取得直接迅速的抗血管生成的作用。 对目前正在进行临床前期研究以及临床试验的VEGF药物，根据其作用靶点的部位不同分为以下几类:①针对内源性VEGF的抗体，如bevacizumab ( BV ).BV 是一种人工合成的VEGF单抗，2004年被美国食品药物管理局批准与5-氟尿啼陡合用作为转移性结直肠癌的一线用药。除了结直肠癌，BV在治疗转移性乳腺癌、进展型或转移性非小细胞型肺癌等应用中也取得了一定的疗效。研究者认为，BV 主要是通过抑制新生血管生成，阻断肿瘤血供，进而诱导肿瘤细胞凋亡，并认为这样的治疗效果更加符合生理性细胞的死亡过程，减少了传统化疗药物的毒副作用。②针对血管内皮生长因子受体(VEGFR)并与之相结合的小分子VEGF抑制物，这类药物能竞争性地与VEGFR相结合，并阻断VEGF信号转导。如BA Y43一9006，SU541fi, SLi11248, PTK787/K222;i84等。BAY43一9006已干2005年被美国食品药物管理局批准应用于进展型肾癌等。SU5416是一种新合成的VEGF受体VEGFR一2酩氨酸激酶抑制物，可明显抑制肿瘤血管生成，阻断其血供，进而诱导肿瘤细胞凋亡，使肿瘤从大到小处于休眠状态，目前川期临床试验正在进行中。③可溶性VEGF受体类似物，如VEGF Trapo VEGF Trap,是由VEGFRI,VEGFR2的胞外段与人Y 免疫球蛋白Fc段融合产生的蛋白，其与VEGF有极强的结合能力，并抑制其活性，目前已经应用于多种实体癌和淋巴瘤的I期实验研究。
微量α﹣葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型及抑制类型的判断方法
164 微量α﹣葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型及抑制类型 的判断方法 朱娟娟，尹忠平，陈继光，上官新晨，彭大勇，蒋艳 （江西农业大学食品科学与工程学院，天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌 330045） 摘要：α-葡萄糖苷酶抑制剂能抑制碳水化合物水解，是高血糖人群降低餐后血糖的常用物质。本文基于α-葡萄糖苷酶-PNPG 体外反应体系，建立了微量、快速的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型，该模型的主要参数如下：酶浓度为0.05 U/mL ；底物浓度范围为0.05~1 mM ；反应温度为37 ℃；反应时间为6 min 。以该模型检测了阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并采用Lineweaver-Burk Plots 、Eadie-Hofstee Plots 、Hanes-Wolff Plots 、Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots 、Non-linear Regression Analysis 五种方法对该酶促反应的动力学数据进行了详细的分析。通过对数据处理的过程和结果的比较发现，该五种方法各有特点，各法所获得的V max 、K m 和K i 存在一定的差异，Non-linear-Regression Analysis 法更加简便、合理及可靠，是酶动力学数据处理的首选方法。采用Non-linear-Regression Analysis 法计算，该模型中酶促反应的V max 为3.91×10-6 mmol/min ，K m 为0.12 mM ，阿卡波糖的K i 为90 μM 。 关键词：α-葡萄糖苷酶抑制剂；模型；动力学 文章篇号：1673-9078(2016)12-164-170 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.12.026 A Model for Screening Trace Amounts of α-Glucosidase Inhibitors and Methods for Judging Inhibition Type ZHU Juan-juan, YIN Zhong-ping, CHEN Ji-guang, SHANG GUAN Xin-chen, PENG Da-yong, JIANG Y an (Jiangxi Key Laboratory of Natural Product and Functional Food, College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, 330045, China) Abstract: Alpha-glucosidase inhibitors can inhibit carbohydrate hydrolysis and are commonly used to decrease postprandial blood glucose in individuals with hyperglycemia. A model for the rapid screening of trace amounts of alpha-glucosidase inhibitors was established based on the alpha-glucosidase-pNPG in vitro reaction system. The optimized parameters of this model were as follows: the enzyme concentration, substrate concentration, reaction temperature, and reaction time were 0.05 U/mL, 0.05~1 mM, 37 ℃, and 6 min, respectively. The inhibitory effect of acarbose was determined using this model, and the enzymatic reaction kinetics data were analyzed using five methods (Lineweaver-Burk plots, Eadie-Hofstee plots, Hanes-Wolff plots, Eisenthal-Cornish-Bowden direct plots, and Non-linear regression analysis). Data processing and comparison of results showed that these five methods had distinct characteristics as the K i , K m , and V max calculated by these five methods differed slightly. Non-linear Regression Analysis was more convenient, reasonable, and reliable, and therefore was the first choice for processing the data of enzyme kinetics. By this model, the V max (×10-6 mmol/min) and K m (mM) of enzymatic reaction were calculated to be 3.91 and 0.12, respectively and the K i (μM) of acarbose was 90. Key words: alpha-glucosidase inhibitor; model; kinetics 据国际糖尿病联盟（IDF ）统计，2013年全世界糖尿病患者约3.82亿[1]。我国约有5000万糖尿病患者， 收稿日期：2015-12-24 基金项目：国家自然科学基金资助项目（31460436，31260368）；江西省自然科学基金项目（20132BAB204004） 作者简介：朱娟娟（1989-），女，硕士研究生，研究方向：天然产物与功能性食品 通讯作者：尹忠平（1971-），男，博士，副教授，研究方向：天然产物与功能性食品 居世界第二位[2]。研究表明，高血糖是糖尿病的主要 特征，也是导致糖尿病并发症的重要原因[2]。糖耐量受损（IGT ）主要表现为餐后血糖升高，因此控制患者餐后血糖水平非常重要。根据IDF 《Ⅱ型糖尿病全球指南》和《中国Ⅱ型糖尿病防治指南》，服用α-糖苷酶抑制剂是Ⅱ型糖尿病治疗的首选方法之一[3,4]。膳食中碳水化合物的消化吸收是影响餐后血糖的关键因素，为了防止餐后高血糖，患者必须控制日常饮食中碳水化合物的摄入量，严重影响了患者的生活质量。
肿瘤实验动物模型的建立及应用研究进展
肿瘤实验动物模型的建立及应用研究进展 摘要：实验动物模型是人类肿瘤的复制品，可分为自发瘤模型．诱导模型、移植模型和转基因动物模型。实验动物模型与其模拟的人类肿瘤在分子、组织学以及生物学特性方面有许多共同性，可以用于肿瘤发病机制研究、肿瘤治疗药物的筛选以及肿瘤的基因治疗。本文对肿瘤实验动物模型的建立及其临床应用进展予以综述。 关键词：动物模型；筛选；基因治疗 Abstract：Lab0ratory animal model is replication of human tumors，including idiopathetic tumor model、induced tumor madel、transplanted tumor model and transgenic animal model．Laboratory animal madel is similar with human tumors it anah,gues on molecule．histulngical anatomy and bionomics．can be used in the investigation of tumor etiopathogenesis，screening of tumor curative and tumor gene therapy．This article review about experimental animal models of tumor establishment and it’8 clinical application． Key words：Laboratory animal model；Seining；Gene therapy 实验动物模型是人类肿瘤的复制，利用动物模型可以缩短研究时间，观察肿瘤发生、发展的全过程，并可在人为控制条件下进行各种实验研究，对肿瘤的发生发展机制、预防及治疗的研究有着重要意义。现对动物肿瘤模型的类型及应用进行 综述。 1 肿瘤动物模型的类型及其建立 1．1 自发瘤模璎实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的肿瘤。自发性肿瘤动物模型最大的优点是，完全在自然条件下发生的疾病，排除了人为因素，肿瘤的发生、发展与人类肿瘤相似，反映了动物的肿瘤易感性和环境致癌物质、促癌物质的积聚程度。但以自发瘤模型作为动物模型使用的仅为少数，且存在周期长，饲养动物量大，耗资大的缺点。 但动物自发瘤模型是转移瘤模型的来源之一¨一。 1．2 诱导模型用致癌物在 动物一定部位或一定器官诱发出的肿瘤，在诱导模型的建立中，动物和致癌物的选择极为重要，且可以通过控制致癌物的计量来控制诱癌时间和程度。如某种肿瘤仅能在某种动物身上诱发，与动物种系和不同器官的敏感性有关，因此动物种系间差别很大。如用芳香烃类致癌物诱发皮肤癌，以小鼠最佳，而大鼠很难诱发出皮肤癌，亚硝胺类致癌物在大鼠体内可诱发食管癌，而在小鼠体内仅能诱发出前胃癌旧J。1937年，Hueper首次报道用B萘胺成功诱导犬的膀胱癌模型，现已发现许多能诱导膀胱癌的化学物质，目前较理想的致癌剂有3种：芳胺N一[4一(5一硝基-2-呋喃)2一噻唑]甲酰胺、N一丁基．N(4-羟丁基)亚硝胺和N一甲基亚硝基脲(N—methylnitrosourea，MNU)。N．丁基一N(4一羟丁基)亚硝胺的致癌性局限于大鼠、小鼠和犬的膀胱。N．丁基一N(4-羟丁基)亚硝胺的进一步代谢产物N-丁基一N一(3一 羧丙基)亚硝基胺从尿中排泄，直接与尿路上皮接触，造成上皮细胞DNA的损伤，从而导致细胞癌变po。N一丁基一N(4一羟丁基)亚硝胺常溶于饮水中饲喂动物，常用浓度为0．05％L3,4]。芳胺N一[4一(5一硝基-2．呋喃)2．噻唑]甲酰胺常用于诱发C3H／He小鼠、Fischer大鼠膀胱癌∽j J，主要是鼠类动物对其敏感性高。食物中添加某些促癌物质呵缩短致癌周期，提高致癌率。但芳胺N—E4一(5．硝基-2一呋喃)2一噻唑]甲酰胺诱发动物膀胱癌有需时长、费用高的缺点。MNU属直接致癌剂，需膀胱灌注，常选用雌性6—8周龄Wister、Fischer大鼠为实验动物，以便于经尿道插管灌入MNU溶液。Kunze等旧1研究表明，MNU分次灌入膀胱内其诱癌率与MNU总量及灌人次数呈正相关，诱癌需时与MNU总剂量呈负相关。 1．3 移植模型这是目前应用最多的肿瘤模型，用肿瘤组织或细胞(源于动物或人)移植到动物
建立肿瘤血管生成抑制剂的体外筛选方法
建立肿瘤血管生成抑制剂的体外筛选方法 李 惠 1,2 叶 庆 3,4 李运曼 1 (1中国药科大学,江苏南京210009;2江苏先声药物研究有限公司,江苏南京210042; 3南京军区总医院博士后科研工作站,江苏南京210002;4南京八一医院全军肿瘤中心,江苏南京210002) 摘 要 以Avastin 为阳性药,建立稳定、客观的肿瘤血管生成抑制剂的体外评价体系。用CCK -8检测人脐静脉内皮细胞(HUVECs )的增殖情况;荧光定量的Boyden 小室法检验HUVECs 的迁移能力;荧光定量分析HUVECs 对纤维蛋白的粘附能力;运用图象分析软件I m age -Pr o Plus 定量分析HUVECs 的小管形成行为的图像。结果表明,在该体系中,Avastin 能够抑制VEGF 诱导的HUVECs 与血管生成相关的生物学行为。该体系具有操作简单、可重复性好、易量化的特点,是一种在体外筛选肿瘤血管生成抑制剂的理想模型。关键词 肿瘤血管生成抑制剂 体外筛选方法 收稿日期:2009-04-10 作者简介:李惠(1984～),女,硕士,肿瘤药理学研究。李运曼(1957～),女,教授,博导,心血管药理学研究。 I nvesti gati on of an Evaluati ve Exper i m ent al Sche me of Anti -angi ogen i c Therapy L i Hui 1,2 Ye Q ing 3,4 L i Yunman (1China Phar maceutical University,J iangsu Nanjing,210009;2Si m cere Phar maceutical Gr oup,J iangsu Nanjing,210042; 3Postdoct orMoving Stati on,General Hos p ital of Nanjing M ilitary Command,J iangsu Nanjing,210002; 4Peop le’s L iberati on A r my Cancer Center,the 81st Hos p ital of Peop le’s L iberati on A r my,J iangsu Nanjing,210002) Abstract An evaluative experi m ental sche me of anti -angi ogenic therapy was established .HUVECs p r olifera 2ti on was detected by CCK -8kit .Fluorescence quantitative Boyden cha mber assay was e mp l oyed t o analyze the HU 2VECs m igrati on .Fluorescence quantitative adhesi on assay was perf or med t o evaluate the ability of HUVEC adhesi on t o fibr onectin.I m age -Pr o Plus quantitative analysis of tube f or mati on was conducted .The results indicated that Avastin inhibited the angi ogenesis -related bi ol ogical behavi or of HUVECs in vitr o .The experi m ental sche me was reliable,easy t o operate and quantify .It was an ideal model f or evaluating the anti -angi ogenic therapy . Keywords an evaluative experi m ental sche me anti -angi ogenic therapy 上世纪60年代初,Folkman 和Becker 观察到,在 肿瘤血管未出现时,离体灌注器官中的肿瘤生长受到 严重限制[1] 。后来,在1971年,Folkman 提出了肿瘤 生长依赖血管生成的假设,认为不超过1mm 3 的微小肿瘤,可通过被动弥散获得所需的氧和营养,但肿 瘤进一步生长就必需有血管生成来支持[2] 。干扰肿瘤与其微环境之间的相互作用进而阻断肿瘤血管新生,可为肿瘤治疗提供新的希望。 肿瘤血管生成过程是一个复杂的级联反应。在 肿瘤细胞分泌的促血管生成因子的刺激下,邻近血管静息状态的内皮细胞被激活。活化的内皮细胞分泌蛋白酶,使内皮细胞连接松弛,基底膜和细胞外基质降解,于是,基质中包含的各种促血管生成因子(如VEGF )被释放,继续刺激内皮细胞,使其侵入周围组织,并增殖、迁移,形成管腔结构。最后,基底膜和细胞外基质重塑,周围支持细胞(如平滑肌细胞)被募集,使新生血管稳定并成熟 [3] 。 — 91—第23卷第5期2009年5月 化工时刊 Che m i ca l I ndustry T i m es Vol .23,No .5 M ay .5.2009
酶抑制剂筛选模型研究进展_王振
·综述·2013年8月第20卷第22期 20世纪60年代，日本科学家梅译滨夫提出了酶抑制剂的概念，从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。随着酶学研究的深入，对酶结构的认识，已能在分子水平上认识酶的作用机制，并根据酶的作用原理来设计各种酶的专一抑制剂作为药物，来调节体内的异常代谢。 酶抑制剂作为药物的治疗基础是通过限制酶催化底物的反应能力，使底物浓度增高或代谢产物浓度降低，以达到改善症状的目的。在一系列酶促反应中，以抑制限速酶或关键酶的效果最好。在目前上市的药物中，以受体为靶点的药物占52%，以酶为靶点的药物占22%，以离子通道为靶点的药物占6%，以核酸为靶点的药物占3%。酶抑制剂的开发是新药的重要来源。随着现代生物科学技术的发展，酶抑制剂作为药物越来越受到医药界的重视。 药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性（生物活性、治疗作用）的实验方法，是寻找和发现药物的重要途径之一。在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，在新药发现和研究中发挥了积极的作用。随着生命科学的发展，新的药物筛选模型不断出现，不仅促进了药物的发现，而且对药物筛选的方法、理论、技术都产生了巨大影响[1]。 酶抑制剂的筛选模型主要为动物模型和细胞分子水平筛选模型。动物模型由于规模小、效率低、样品量大、成本高等缺点，不适合作为药物初筛的模型。细胞和分子水平的筛选模型，具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模筛选和一药多筛等特点[1]，已成为目前酶抑制剂筛选的主要方法。本文就近几年来酶抑制筛选的主要模型进行综述。 1高通量筛选模型 高通量筛选是以分子细胞水平的实验方法为基础，以微型板为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，同时对数以万计的样品进行检测。高通量筛选以其高效、快速的优点，已成为酶抑制剂新药发现的主要手段。酶抑制剂的高通量筛选模型，主要为分子水平的筛选模型，也有少量细胞水平的筛选模型。筛选以酶为作用靶点的药物，不仅要观察酶与药物的结合，更要观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点，酶的反应底物和产物都可作为检测指标[2]。以酶为作用靶点的高通量检测方法，绝大多数是直接检测酶的活性，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类[3]。 曹鸿鹏等[4]采用荧光分析法建立了流感病毒神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选模型，从甲型及乙型流感病毒中制备出神经氨酸酶，以有荧光特性的化合物为酶的底物，利用96孔板建立了适合高通量筛选神经氨酸酶抑制剂的荧光分析法。方法：96孔板中，100μl体系中含有20μmol/L MU-NANA（底物），3μl神经氨酸酶溶液，10μl待测样品溶液，37℃，pH3.5，孵育15min，355/460nm测定荧光强度。 张冉等[5]采用比色法建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选模型。从小肠上段提取α-葡萄糖苷酶，以蔗糖为底物，通过测定体系中葡萄糖的生成量来检测α-葡萄糖苷酶的活性。方法：384孔微板中，20μl体系中含有10μl 酶提取液，30mmol/L的蔗糖5μL，待测样品5μl，37℃，孵育30min，505nm波长下测定吸光度。李婷等[6]也建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选模型。方法：96孔板中，160μl体系含2.5mmol/L和0.2U/mlα-葡萄糖苷酶，37℃，pH7.0，反应15min，400nm波长处测定吸光度。 Vollmer等[7]采用放射法建立了一种以青霉素结合蛋白（PBP）为靶的抗生素的高通量筛选方法。PBP既是糖基转移酶又是肽转移酶，该法是筛选其糖基转移结构域的活性位点上的可结合物。方法：96孔板中加入莫诺霉素混悬液，然后加入3H标记的PBP（细菌膜粗提物）和受试化合物，孵育，过滤去掉非结合的放射性，闪烁计数测得放射性指示PBP与莫诺霉素结合的情况及受试化合物对其的影响。 另外，根据酶的特点，还有一些特殊的方法。肖尚志[8]建立了醛糖还原酶抑制剂的高通量筛选模型。组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞至8～15代时，用胰蛋白酶消化后，接种至24孔板，加入胎牛血清浓度为10%、葡萄糖 酶抑制剂筛选模型研究进展 王振宋洋彭坤 山东阿如拉药物研究开发有限公司，山东济南250101 [摘要]通过查阅文献，综述目前酶抑制剂筛选的主要模型，包括动物模型、高通量筛选模型及固定化酶反应器。并对其应用原理、应用情况及优缺点进行了阐述。 [关键词]酶抑制剂；筛选模型；靶点；验证 [中图分类号]R965.1[文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2013）08（a）-0018-03 Research Progress of Screening Model of Enzyme Inhibitor WANG Zhen SONG Yang PENG Kun Shandong Arula Pharmaceutical Research&Development Company Limited,Shandong Province,Jinan250101,China [Abstract]After researching relevant literatures,the article summarizes the current main models of enzyme inhibitor including animal model,high throughput screening model,and immobilized enzyme reactor as well as their mechanisms of application,applicable applications,advantages and disadvantages. [Key words]Enzyme inhibitor;Screening model;Target spot;Confirmation 18 中国当代医药CHINA MODERN MEDICINE