基因工程学期末考试
基因研究三阶段：①染色体遗传学阶段：从细胞染色体水平上进行研究②分子生物学阶段：从DNA大分子水平上进行研究③反向生物学阶段：直接从克隆目的基因出发，研究基因功能及其与表型关系
基因：是DNA上某一特定的可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列
核苷：由一个戊糖和一个碱基缩合而成的
核苷酸：由核苷中的戊糖的烃基与磷酸基缩合而成磷酸酯，它是构成核酸基本单位
顺反子：是一段核苷酸序列，或者说相当于一个基因的DNA或RNA单元，它编码一种完整的多肽链
编码区：含有大量的可以被细胞质中转译机器阅读的遗传密码，包括起始、终止密码子
非编码区：对于基因遗传信息的表达是必要的，但它们不会被转译成多肽序列
启动子：位于基因5'端上游外侧紧挨转录起始点的一段非编码区的核苷酸序列，功能-引导RNA聚合酶同基因正确部位结合
终止子：位于基因3'端下游外侧一段非编码的核苷酸序列，功能-具转录终止信号功能
真核生物和原核生物编码基因产物区别：①真~的基因都是以单顺反子形式存在，因此它们编码的也是单基因产物②原~的基因是以多顺反子的形式存在，意指一个mRNA分子编码多个多肽链，这些多肽链对应的DNA片段则位于同一转录单位内，享用同一对起点和终点分子探针：是一种带有高比活性放射性标记的并且只能同目的基因特定序列作碱基配对RNA或DNA分子，它们同目的基因杂交后，可通过放射自显影技术检测出来，从而达到分离基因的目的
移动基因：又叫转位因子，由于它可从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体间跃迁，因此称为跳跃基因，又分为插入序列、转位子、复合转位子
插入序列：分子量小于2000bp的（IS因子）
断裂基因：编码序列不连续的间隔基因
RNA剪辑：先转录成初级转录物，然后经过删除和连接，除去无关的DNA间隔序列的转录物，变成了成熟的mRNA分子，它从细胞核中输送到细胞质，再转译成相应多肽链，这种间隔子的删除和表达子的连接最后形成mRNA的过程，称RNA剪辑
假基因：这是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同。但都不能合成出功能蛋白质的失活基因。其是基因一退化形式。因为在某一阶段存在着伤及基因表达的一种或几种缺陷
基因工程主要研究内容：①目的基因的获取②重组体的制备③重组体的转化④克隆鉴定⑤目的基因表达
基因工程应用：A在农业生产中应用：①提高植物光合作用效率a.提高CO2固定率b.提高光能吸收率耳环转化率②提高豆科植物的固氮效率③转基因植物 B 转基因动物C在医药上应用①用转基因植物或动物生产药物与②用微生物生产药物③技术设计高效特异性生物制剂④研制疫苗⑤基因诊断⑥法医鉴定⑦基因治疗D在环境保护中：①检测水污染②生物降解
电泳种类：①琼脂糖凝胶电泳，用于3000-50000bpDNA片段分离。②聚丙烯酰胺凝胶电泳，用于1-1000bpDNA片段分离。③脉冲典藏凝胶电泳，用于分离条染色体。
复制子：每个基因组筒仓只有一个复制起点，这样的DNF分子称为复制子。
大肠杆菌的转化：将快速声场中的E·coli置于经（零摄氏度）预处理的低参氧化钙溶液中，使cell捧场形成原生质球，与外源DNF形成粘附在cell表面复合物。42℃短暂热刺激，复合物将会被细胞所吸收，在全培养基中生长一段时间可是转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子
基因的化学合成方法：寡nt片段化学合成方法：1.磷酸二酯法 2.磷酸三酯法 3.亚磷酸三酯法及在后者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。
研究DNA与PRO相互作用方法：①凝胶阻滞试验②DNase I足迹试验③甲基化干扰试验④体内足迹试验
PCR基本原理是什么，用PCR扩增某一基因需预先得到什么？
双链DNA分子加热分离成两单链，在DNA聚合酶作用下以单链DNA为模板，并利用反应混合物中的固相dNTP合成新生的DNA互补链，因为DNA聚合酶需一小段双DNA来启动新链合成，所以新生DNA链的起点由寡核苷酸引物在退火位置所决定
粘性末端：含几个nt单链的末端，分2类型：（1）5‘端凸出（2）3’端凸出
同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶：①完全同裂酶：识别位点和切点完全相同
Hind3和Hsu I ②不完全同裂酶：识别位点相同但切点不同Xam I和Sma I
同尾酶：识别序列不同但能切出相同的粘性末端BamH I, Bgl 2, Bcl I, Xho 2,
影响ligase效率的主要参数：①反应温度（最佳37℃，实用温度4-15℃）②连接酶浓度（平末端：1-2个单位，粘性末端：0.1个单位）③反应时间④ATP浓度（变动范围）⑤插入片段与载体分子的摩尔比值(最佳3:1)
体外连接DNA片段的方法：①用DNAligase连接具有互补粘性末端的DNA片段②用T4DNAligase将平末端的DNA片段连接起来，或是有末端脱氧nt转移酶给具有平末端的DNA片段加上PolyA—Poly(dT)尾巴后，再用DNAligase将他们连接起来。③先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或街头，形成粘性末端之后再用DNAligase连接。
平末端DNA片段的连接：①T4DNAligase ②用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴后，再用DNAligase连接。 a.同聚物加尾法 b.衔接物连接法c.接头连接法
基因工程对载体的要求：①在宿主细胞内能独立复制②有选择性标记③有一段多克隆位点，外源DNA插入其中不影响载体复制④分子量小，拷贝数多⑤容易从宿主细胞中分离纯化
Plasmid载体必须具备的基本条件：1.具有复制起点ORI。2.具有抗菌素抗性基因，是筛选标志，理想载体应有2种抗菌素抗性基因。3.若干限制性内切酶的单一位点，用来插入外源DNA片段，且插入后不影响复制功能。4.具有较小分子量，较高拷贝数。
柯斯质粒载体：是一类由人工构建的含入NDA的序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
1.大小：5-7kb。
2.组成：①入DNA：cos序列的控制包装序列。②pBR322：质粒复制子，抗菌素基因，几个限制酶的单一位点。
柯斯克隆的特点：1.具有入噬菌体的特征：克隆外源DNA后可体外包装成phage颗粒在宿主cell内形成环化DNA，但不能形成新的phage颗粒而溶菌。2.具有质粒载体的特征：大多带有pMB1或CoLE1的复制子，有抗菌素抗性基因和插入失活的克隆位点。3.高容量的克隆能力：45kb（不能低于30kb）。4.具有与同源序列的质粒进行重组的能力：在同一宿主细胞中，可与同源序列的质粒形成于合体。
克隆：在多细胞的高等生物个体水平上，具有相同基因型的同一物种的2个个体或多个个体组成的群体。在细胞水平上，同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。在分子水平上，凡带有一段DNA插入序列的，独特的宿主或载体单元就叫克隆。
cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保护和扩增称cDNA文库
cDNA文库特点：①不含内含子序列②可在细菌中直接表达③包含了所有编码pro.的基因④比DNA文库小得多，易构建
目的基因的分离，富集特定基因的mRNA或cDNA模版
①探针柱分离特异mRNA ②.mRNA差异显示PCR ③应用表达文库分离克隆的目的基因真核基因在E.coli中表达实验步骤：①引物设计②目的基因总DNA提取③目的基因的PCR扩增④目的基因连接到克隆载体⑤重组质粒的酶切鉴定与序列分析⑥目的基因连接到表达载体⑦转化到E.colicen中表达⑧表达产物的免疫性分析