拟南芥叶绿素荧光相关突变体E1991的图位克隆和基因功能分析

摘要.............................................................. II ABSTRACT................................................................................................................. V 缩写词(Abbreviation) .............................................................................................. VII 目录............................................................................................................................ I X 1 前言. (1)

1.1 叶绿体的发育研究进展 (1)

1.1.1 叶绿体研究概述 (1)

1.1.2 多因素影响叶绿体发育 (1)

1.2 叶绿素的代谢 (2)

1.2.1叶绿素的合成代谢 (2)

1.2.2 叶绿素的分解代谢 (3)

1.2.3 光合色素与植物衰老 (5)

1.3 光系统与能量代谢 (6)

1.3.1 光系统Ⅰ与光系统Ⅱ (6)

1.3.2 非光化学淬灭 (7)

1.4 叶绿素荧光参数的研究进展 (8)

1.4.1 叶绿素荧光机理和测量 (8)

1.4.2 叶绿素荧光参数的生物学意义 (9)

2 立题依据 (3)

3 材料与方法 (5)

3.1 常用仪器 (5)

3.2 实验材料、载体和菌株 (5)

3.2.1 植物实验材料 (5)

3.2.2 实验载体与菌株 (5)

3.3 实验药品和试剂 (6)

3.4 常用培养基和溶液的配制 (6)

3.4.1 常用培养基的配制 (6)

3.4.2 溶液的配制 (7)

3.4.3 抗生素的配制 (8)

3.5 实验方法 (8)

3.5.1 拟南芥的培养 (8)

3.5.2 拟南芥的杂交 (9)

3.5.3 拟南芥DNA的提取 (9)

3.5.4 可溶性蛋白提取和含量的测定 (10)

3.5.5 可溶性总糖提取和含量的测定 (10)

3.5.6 叶绿素提取和含量的测定 (11)

3.5.7 Trizol法提取拟南芥RNA (11)

3.5.8 反转录制备拟南芥cDNA (12)

3.5.9 PCR引物的设计 (12)

3.5.10 载体构建与重组质粒的鉴定 (14)

3.5.11 琼脂糖凝胶的配制与回收 (15)

3.5.12 T-DNA插入突变体的纯合鉴定 (16)

3.5.13 大肠杆菌感受态细胞的制备 (16)

3.5.14 质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞 (17)

3.5.15 农杆菌感受态细胞的制备 (18)

3.5.16 质粒DNA转化农杆菌感受态细胞 (18)

3.5.17 重组菌落与质粒的鉴定 (18)

3.5.18 质粒DNA的小量提取 (19)

3.5.19 农杆菌侵染 (19)

3.5.20 转基因植株的筛选 (19)

3.5.21 GUS染色方法 (20)

3.5.22 图位克隆 (20)

3.5.23 瞬转 (21)

4 结果与分析 (23)

4.1 突变体的获得 (23)

4.2 突变体的遗传学分析 (23)

4.3突变体的图位克隆 (24)

4.3.1 F2代分离群体的构建 (24)

4.3.2 基因粗定位结果 (25)

4.3.3 基因细定位结果 (25)

4.3.4 基因测序结果 (26)

4.3.5 Salk line突变体表型分析 (27)

4.4 突变体E1991的发育表型 (27)

4.4.1 E1991突变体与Col-0野生型叶绿素含量的测定 (27)

4.4.2 E1991突变体与Col-0野生型可溶性蛋白含量的测定 (28)

4.4.3 E1991突变体与Col-0野生型可溶性总糖含量的测定 (28)

4.4.4 ABA处理下的萌发差异 (29)

4.4.5 相关基因的表达分析 (30)

4.5 回补载体的构建与回补植株的筛选 (30)

4.5.1 回补载体E1991::pCAMBIA1300-COM的构建 (30)

4.5.2 回补植株的筛选 (31)

4.5.3 回补植株的表型分析 (31)

4.6 超表达载体E1991::p-S1300+的构建 (32)

4.7 E1991::GFP载体的构建 (32)

4.7.1 E1991::pHBT-GFP-NOS载体的构建及原生质体转化 (32)

4.7.2 E1991::S1300+-GFP载体的构建及原生质体转化 (33)

4.8 E1991::pCAMBIA1391-GUS载体的构建 (34)

4.9 蛋白原核表达载体的构建 (34)

5 讨论 (37)

结论 (39)

参考文献 (41)

致谢 (48)

前言

1 前言

1.1 叶绿体的发育研究进展

1.1.1 叶绿体研究概述

叶绿体是存在于光合自养生物中的半自主细胞器，是光合作用的主要场所，它具有独立的基因组，生长发育和增殖均由核基因和自身基因组共同调控。叶绿体基因组以双链环状DNA存在，通常有120-220 kbp[1]，每个叶肉细胞中的叶绿体基因约有10 000个拷贝数[2]。叶绿体基因组的相关研究，对于揭示生物进化过程有一定的指导意义，同时推动的叶绿体转化技术发展，为作物改良、生物反应器、生物制药等领域开创了新的方向[3]。

叶绿素的化学结构及其在光合作用中的功能最初在1913年，由Richard Willst?tter提出。而后，1932年，Robert Emerson和William Arnold发现了反应中心叶绿素，提出了光合作用单元的概念[4,5]。1947年，Sam Wildman从植物叶片里分离出了核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶[6]。1954年，Melvin Calvin发现了碳循环，因此也被称为卡尔文循环[7]。1964年Boardman和Anderson利用物理方法分离了两个光系统，并对其展开了各种详细研究[8]。1999年，Pfannschmidt 等人论证了光合作用过程控制叶绿体基因的表达[9]。2015年，Krzysztof等人整合了叶绿体细胞间的信号通路[10]。近年来，随着研究的深入以及研究手段的发展，人们对叶绿体的认识正在逐渐在加深。

1.1.2 多因素影响叶绿体发育

种子植物的叶绿体由无光合能力的前质体发育而来[11]，根据其接受光的程度，逐渐分化为叶绿体、白色体、淀粉质体和有色体等各种质体。

拟南芥植株中有五种光敏色素，而叶绿体发育初期，需由感受红光和远红光的光敏色素phyA、phyB[12,13]，以及能够感受蓝光和紫外光的隐花色素cry来调控光形态的建成[14]。随后光敏色素相互作用因子（phytochrome-interacting factors, PIFs）在光下与转移至核内的phyB结合，调节光形态建成相关基因的转录[15,16]。