小动物活体成像技术_浙江大学

小动物活体成像技术

李冬梅万春丽李继承

摘要：随着小动物成像技术的发展，活体小动物非侵袭性成像在临床前研究中发挥着越来越重要的作用。本文围绕五种小动物成像专用设备，综述其特点及主要应用，比较各种设备的优势和劣势，总结小动物活体成像设备的发展趋势。

关键词：小动物；活体；成像技术

Small living animal imaging technology

LI Dong-Mei1 WAN Chun-li 2 LI Ji-Cheng 1

（1Medical college of Zhejiang university，2Shanghai sciencelight biology sci&tech Co.,Ltd.）Abstract: With the development of small animal imaging technology, non-invasive imaging in small living animal models has gained increasing importance in pre-clinical research. Based on five kinds of small animal imaging special equipments, this article reviews their characteristics and illustrates their main applications. Meanwhile, this article also compares the advantages and limitations of these equipments and summarizes the trends of small living animal imaging equipments.

Key words: small animal;living; imaging technology

动物模型是现代生物医学研究中重要的实验方法与手段，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施，同时大鼠、天竺鼠、小鼠等小动物由于诸多优势在生命科学、医学研究及药物开发等多个领域应用日益增多。近年来各种影像技术在动物研究中发挥着越来越重要的作用，涌现出各种小动物成像的专业设备，为科学研究提供了强有力的工具。

动物活体成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。动物活体成像技术主要分为光学成像(optical imaging)、核素成像（PET/SPECT）、核磁共振成像（magnetic resonance imaging ，MRI）、计算机断层摄影（computed tomography，CT）成像和超声（ultrasound）成像五大类。

活体成像技术是在不损伤动物的前提下对其进行长期纵向研究的技术之一。成像技术可以提供的数据有绝对定量和相对定量两种。在样本中位置而改变，这类技术提供的为绝对定量信息，如CT、MRI和PET提供的为绝对定量信息；图像数据信号为样本位置依赖性的，如可见光成像中的生物发光、荧光、多光子显微镜技术属于相对定量范畴，但可以通过严格设计实验来定量[1]。其中可见光成像和核素成像特别适合研究分子、代谢和生理学事件，称为功能成像；超声成像和CT则适合于解剖学成像，称为结构成像，MRI介于两者之间。

1 可见光成像

体内可见光成像包括生物发光与荧光两种技术[2]。生物发光是用荧光素酶基因标记DNA，利用其产生的蛋白酶与相应底物发生生化反应产生生物体内的光信号；而荧光技术则采用荧光报告基因（GFP、RFP）或荧光染料（包括荧光量子点）等新型纳米标记材料进行标记，利用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光就可以形成体内的生物光源。前者是动物体内的自发荧光，不需要激发光源，而后者则需要外界激发光源的激发[3]。

1.1 生物发光：哺乳动物生物发光，一般是将萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）基因整合到需观察细胞的染色体DNA上，以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时，荧光素酶也会得到持续稳定的表达[4]。标记后的荧光素酶

只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光强度与标记细胞的数目呈线性相关。

除萤火虫荧光素酶外，有时也会用到海肾荧光素酶（renilla Luciferase）[5]。二者的底物不一样，萤火虫荧光素酶的底物是荧光素（D-luciferin），海肾荧光素酶的底物是腔肠素（coelentarizine）。二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在540~600nm，后者所发的光波长在460~540nm左右。前者所发的光更容易透过组织，在体内的代谢较后者慢，而且特异性好。所以，大部分活体实验使用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因，如果需要双标记或特殊的实验，也可采用后者作为备选方案。

新问世的PpyRed红色漂移荧光素酶，把以前的荧光素酶的发光峰从562nm漂移到612 nm。随着发光波长的增加，PpyRed红色漂移荧光素酶穿透性大大提高，被皮肤吸收的比例显著降低，且光的漫射现象减少，提高了分辨率。总的说来，PpyRed红色漂移荧光素酶提高了活体生物发光成像的灵敏度和分辨率[6]。

对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。通过荧光素酶基因标记的细菌进行的胃肠道排空的实验可以把活体成像的研究应用扩展到药物动力学、胃肠道功能学等领域[7]。

1.2荧光：荧光成像技术发展迅速，主要表现在成像探针的不断更新；光学成像系统不仅提供定量信息，还能提供三维立体图像和多项复杂的数据；红外线断层扫描重建、光谱分离、图像融合和多通道成像技术已经在许多成像系统常规应用。

随着小动物成像技术的发展，成像探针种类越来越多，功能越来越强大[8]。量子点(quantum dots，QDs)荧光标记是纳米技术和体内荧光成像技术结合的一种新技术，除了能对活细胞实时长时间动态荧光观察与成像，对细胞间、细胞内及细胞器间的各种相互作用的原位实时动态示踪外，还可以标记在其他需要研究的物质上，如药物、特定的生物分子等，示踪其活动及作用，其在长时间生命活动监测及活体示踪方面具有独特的应用优势[9]。

可见光成像的主要缺点是二维？平面成像及不能绝对定量，新一代荧光分子断层成像（fluorescence molecular tomography, FMT）采用特定波长的激发光激发荧光分子产生荧光，通过图像重建提供目标的深度信息和对目标物进行立体成像，并且可以定量及多通道成像，能够在毫米量级的组织中检测与某种生理功能相关的荧光探针的浓度分布，在疾病特别是癌症的早期诊断、基因表达图谱、蛋白质功能研究、受体定位、细胞通路解释和检测小分子蛋白之间的相互作用等生物技术方面，有着重要的作用[10]。

几种基于荧光显微镜技术的方法适用于体外细胞也适合体内细胞的观察，如多光子显微技术、激光显微共聚焦技术和纤维光学方法等。因为共聚焦显微术使用方便、耗费少，所以应用最广泛，但如果观察时间过长且组织光穿过率低，光毒性导致的细胞死亡是其应用的局限性之一[1]。多光子显微技术能达到800 μm以上深度的空间分辨率，通过多通道检测不同标记的荧光物体，以及信号融合可得到三维图像信息，也可提供几个小时的高空间分辨率的成像[11]；虽然活体多光子显微成像系统提供的是相对定量的荧光信号，但它可以使用血管内定量参数及细胞迁移间隙定量。

可见光成像优势是使用低能量、无辐射、对信号检测灵敏度高、实时监测标记的活体生物体内的细胞活动和基因行为[12]，被广泛应用到监控转基因的表达、基因治疗、感染的进展、肿瘤的生长和转移、器官？移植、毒理学、病毒感染和药学研究中。目前光学成像大多还处在以小动物为对象的基础研究阶段，但随着可见光成像技术的成熟和完善，针对临床研究前期的相关工作将陆续开展。

2 核素成像

正电子发射断层成像技术(positron emission tomography，PET)和单光子发射计算机断层

成像术(Single-Photon Emission Computed Tomography，SPECT)是核医学的两种显像技术。

临床PET、SPECT显像效果欠佳，分辨率较低（临床PET分辨率为4~8 mm），无法满足小动物显像研究的要求[13]。小动物PET、SPECT专为小动物实验而设计，探测区域小，空间分辨率很高，可达1.0mm[13]，有些？动物PET使用活动的扫描架不只适合小动物也适合中等大小的动物[14]。PET与SPECT相同之处是都利用放射性核素的示踪原理进行显像，皆属于功能显像。除了一般的分子成像技术都具有的无创伤、同一批动物持续观察的优点外，小动物PET/SPECT与其他分子显像方法相比还具有以下显著优势：①具有标记的广泛性，有关生命活动的小分子、小分子药物、基因、配体、抗体等都可以被标记；②绝对定量；③对于浅部组织和深部组织都具有很高的灵敏度，能够测定感兴趣组织中p-摩尔，甚至f-摩尔数量级的配体浓度，对于大鼠的检测很方便；④可获得断层及三维信息，实现较精确的定位；⑤小动物PET/SPECT可以动态地获得秒数量级的动力学资料，能够对生理和药理过程进行快速显像；⑥可推广到人体[15]。

2.1 小动物PET：进行小动物PET显像，首先是利用医用回旋加速器发生的核反应，生产正电子放射性核素，通过有机合成、无机反应或生化合成制备各种小动物PET正电子显像剂或示踪物质。显像剂引入体内定位于靶器官，利用PET显像仪采集信息显示不同断面图并给出定量生理参数。小动物PET的优势在于特异性、敏感性和能定量示踪标记物，且PET使用的放射性核素多为动物生理活动需要的元素，因此不影响它的生物学功能，放射性标记物进入动物体内后，由于其本身的特点，能够聚集在特定的组织器官或参与组织细胞的代谢；半衰期超短，一般在十几分钟到几小时，适合于快速动态研究，如11C、15O、3N ，半衰期在20min以内[16]；同时湮没辐射产生的两个能量相等的γ光子互成180°，提供了很好的空间定位，所以正电子成像仪一般不需要机械准直器，采用电子准直，从而大大提高了探测灵敏度，改善了空间分辨率。

尽管小动物PET已取得了巨大发展，然而却面临以下挑战，空间分辨率和系统绝对灵敏度是影响PET图像质量的重要指标，但分辨率和灵敏度却是一对矛盾体，分辨率虽已达到1mm，但却降低了灵敏度；同时小动物PET在很大程度上缺少解剖结构信息和使用放射性核素，要求回旋加速器靠近成像设备[14]。

基于小动物PET巨大的应用潜能与前景，其必将成为药物的寻找和开发、以动物模型模拟人类疾病揭示疾病的生化过程、研究活体动物基因表达显像以及其他生物医学领域的重要方法[17]。

2.2 小动物SPECT：相对于小PET系统，小SPECT系统使用长半衰期的放射性同位素，不需要回旋加速器。常使用的放射性核素不是生理性元素，如：99m Tc、111In、123I和67Ga等，这些放射性核素的半衰期从6h到3天，通常较PET使用的放射性核素半衰期长。单光子SPECT 的灵敏度、分辨率及图像质量较PET差；而多光子SPECT系统空间分辨率能达到200μm，应用此模式图像可以由多个叠加数据重构，扫描时间也降低到几分钟，每个动物的辐射剂量也降低了[14,18]。随着技术的发展特别是新探测器如CZT (cadmium zinc telluride)将提高小SPECT 敏感度到小PET水平。随着放射线示踪剂种类增加及不依赖回旋加速器，小SPECT有很大的应用前景，可用于监视生理功能、示踪代谢过程和定量受体密度等[18]。

作为生物医学研究的重要技术平台，核素成像技术用于发现易于为核素标记的既定靶目标底物的存在，或用于追踪小量标记基因药物和进行许多药物抵抗或病毒载体的传送。

3.小动物CT

CT是利用组织密度的不同造成对X射线透过率不同，对机体一定厚度的层面进行扫描，并利用计算机重建三维图像的影像技术。小动物CT（微型CT）作为一种最新的CT成像技术，具有微米量级的空间分辨率（>9μm）并可以提供三维图像[19]。大多数系统使用圆锥形的X射线辐射源和固体探测器。探测器可以围绕动物旋转，允许一次扫描动物整体成像；CT的视野

探测器是决定CT分辨率水平的关键部件，小动物CT能达到不同的分辨率，从15~90μm，其应用范围很广；专门用于体内研究的仪器的最佳分辨率是50~100μm，虽然分辨率低但可降低辐射剂量，增快研究进展，使长期纵向研究得以顺利进行[20]。在分辨率为100μm时，对整个小鼠进行一次扫描大约需15分钟，更高分辨率的扫描需要更长时间的扫描[16]。

小CT系统在小动物骨和肺部组织检查等方面具有独特的优势。对于骨的研究，分辨率限制在15μm，如果在小梁水平上分析，负荷也被考虑在内；小CT也常应用在呼吸系统疾病（如哮喘、慢性阻塞性肺疾病）的检测，为避免呼吸和其他人为因素造成的动物固定器移动，现在多用附加组件来控制呼吸和使人为因素最小化；特异对比因子的使用可以进一步促进软组织的研究如心血管发生、肿瘤生长等。高分辨率小CT系统在研究软组织肿瘤和转基因动物的特征性结构上取得了较好的效果[14]。

第一代小CT的主要缺点是即使使用特异对比因子、高辐射剂量和长时间的扫描，对软组织的相对分辨率仍很低。第二代小CT系统组合了很多在临床上使用的技术，配置了小探测器组件和更强大的X线管，可实现更快地扫描整个动物（0.8s），并可使用临床对比剂（造影剂）而且使灌注研究成为可能。此外，使用碘酸盐造影剂显著地改善了图像的对比度，能够看清更小直径的血管（20μm）。这项技术主要的不足是还必须暴露在电离辐射下，特别是持续反复的研究，电离辐射可能改变肿瘤学等方面的研究[14]。

为了使CT具有分子成像能力，特异CT探针被设计出，探针在CT扫描时同时使用[21]。遗憾的是，对比剂的使用导致射线的危害。因为敏感度和空间分辨率也依赖于CT暴露的时间和对比剂使用的数量。

4.小动物MRI

MRI是依据所释放的能量在物质内部不同结构环境中不同的衰减，而绘制出物体内部的结构图像。相对于CT，MRI具有无电离辐射性(放射线)损害，高度的软组织分辨能力，无需使用对比剂即可显示血管结构等独特优点。对于核素和可见光成像，小动物MRI的优势是具有微米级的高分辨率及低毒性；在某些应用中，MRI能同时获得生理、分子和解剖学的信息，这些正是核医学、光学成像的弱点。对于小动物研究，小动物MRI是一个功能强大、多用途的成像系统[22]，但是MRI的敏感性较低（微克分子水平），与核医学成像技术的纳克分子水平相比，低几个数量级[14]。所以它不是最理想的成像系统，随着多模式平台的发展，如MRI/PET，可以从一个仪器中得到更全面的信息。

最近，动物MRI发展的焦点集中在新的增强对比因子以增加敏感度和特异性。增强对比因子分为非特异性的、靶向性的和智能性的[23]。非特异探针如螯合钆显示非特异的分散模式，用于测量组织灌注率和血管的渗透率；靶向探针如钆标记的抗生物素蛋白和膜联蛋白顺磁性氧化铁颗粒被设计成特异配体如多肽和抗体，如近年研制的超小顺磁性氧化铁(USPIO) 可用于标记癌细胞、造血细胞、干细胞、吞噬细胞和胰岛细胞等，在体外或体内标记后进行体内跟踪，了解正常细胞或癌细胞的生物学行为或转移、代谢的规律[24]；膜联蛋白V顺磁性氧化铁颗粒被用来检测凋亡细胞，因为凋亡细胞磷脂酰丝氨酸暴露在细胞表面，导致与其有高特异性结合的膜联蛋白V（Annexin V）的摄取增加[25]。智能探针和靶向探针一样有一特异靶点，但不同的是在和特异配体作用以后探针信号才改变，才可以被检测出。

目前MRI分子影像图像仅仅局限于临床前期的动物研究中，MRI分子影像距离真正的临床分子影像图像还有很远的路程，需要设计新的分子探针来适应临床诊断和治疗的需要。

5.小动物超声

超声基于声波在软组织传播而成像，由于无辐射、操作简单、图像直观、价格便宜等优势在临床上广泛应用。在小动物研究中，由于所达到组织深度的限制和成像的质量容易受到骨或软组织中的空气的影响而产生假象。所以超声不像其他动物成像技术那样应用广泛，应用主要集中在生理结构易受外界影响的膀胱和血管[26]，此外小动物超声在转基因动物的产

前发育研究中有很大优势[27]。

小动物活体成像设备主要特点

主要成像技术空间分辨

率

敏感度成像深

度

扫描时间定量成像因子靶点小动物研究中主

要应用

生物发光3~5mm p-nmol1~2cm 数分钟否荧光素分子基因表达，细胞和

细菌的示踪

荧光2~3mm p-nmol<1cm 数秒钟到

数分钟否荧光物质生理功能

分子

疾病浅表的分子

事件的快速扫描

FMT 1mm p-nmol<10cm 数分钟到

数小时是近红外线

染料

生理功能

分子

报告荧光染料的

定量成像

PET 1~2mm p-nmol无限制数分钟到

数小时是18F-,

64Cu- ,11C-

标记复合

物

生理功能

分子

多种示踪物的多

功能成像

SPECT 1~2mm p-nmol无限制数分钟到

数小时是99m Tc-等标

记复合物

生理功能

分子

对标记的抗体、蛋

白和肽类成像

CT 15~100μm m-cmol无限制数分钟是碘酸盐分

子解剖结构

生理功能

肺和骨的成像

MRI 10~100μmμ-mmol无限制数分钟到

数小时是螯化的顺

磁颗粒

解剖结构

生理功能

分子

多功能成像并有

软组织高对比度

超声50~500μm mmol mm~cm 数秒钟到

数分钟是微气泡解剖结构

生理功能

血管和介入成像

动物胚胎发育

6. 发展与展望

传统的形态学成像技术，如CT、MRI和超声等有较高的空间分辨率，但他们的共同缺点是直到组织结构变化才能检测到疾病，即对疾病的敏感性较低，而这时疾病通常已到中晚期；功能成像技术，如可见光成像、核素成像则能通过分子和细胞的变化检测到疾病，例如肿瘤在导致组织结构变化之前就可通过核素成像被检测到，但功能成像技术的空间分辨率较低，结构信息不足[28]。由于每种成像技术都有其独特的优势和局限性，结合几种技术的多模式成像平台，象PET/SPECT/CT，FMT–CT, FMT–MRI , PET–MRI等应运而生，这些多模式成像平台促进了图像的重构和数据的可视[29]。例如PET/SPECT–CT、PET/SPECT–MRI将PET显像与高分辨率、非侵入性解剖学显像如CT、MRI等结合起来，这样在研究中即可获得生物功能信息又得到解剖结构信息。

如PET与CT两种不同成像原理的设备同机组合，不是其功能的简单相加，而是在此基础上进行图像融合，图像融合处理系统利用各自成像方式的特点对两种图像进行空间配准与结合，将影像数据注册后合成为一个单一的影像。PET-CT同机融合具有相同的定位坐标系统，动物扫描时不必改变位置，即可进行PET-CT同机采集，避免了由于动物移位所造成的误差。CT除用于解剖定位外，还可提供一种快速低噪音衰减校正和部分体积校正方法，并在PET 图像重建过程中降低显像噪音、提高图像质量。小动物专用PET/CT扫描仪将极大提高PET 显像的准确性。几种技术结合的多模式成像平台是动物活体成像的一个发展趋势。

随着分子生物学及相关技术的发展，各种成像技术应用更广泛，成像系统要求能绝对定量、分辨率高、标准化、数字化、综合性、在系统中对分子活动敏感并与其他分子检测方式

互相补偿及整合。与此同时，作为动物显像的技术平台，动物成像技术将在生命科学、医药研究中发挥着越来越重要的作用。

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