基因工程在食品工业中的应用上课讲义
基因工程在食品工业
中的应用
基因工程在食品工业中的应用
摘要：生物技术发展日新月异，基因工程的应用已经渗透到工、农、衣、国
防和环保等各个领域，深刻影响着人类的生活和社会的进程；当然，基因工程技术在食品中的应用也越来越广泛。它具有从本质上改变生物及食品性能的特性，因此越来越受到食品科技工作者的重视。本文阐述了基因工程的定义，详细介绍了基因工程食品的由来，并介绍了基因工程在食品原料改良中的应用；基因工程在食品发酵中的应用；基因工程在农副产品加工中的应用，同时，展望了基因工程技术在食品工业领域中的美好发展前景。
关键词：基因工程食品工业食品原料改良食品发酵农副产品Application of genetic engineering in food industry
Abstr act: Changing biotechnology and genetic engineering applications have penetrated into industry, agriculture, national defense, clothing, and the environmental protection and other fields, and deeply influenced the process of human life and society; Genetic engineering application in the food, of course, also more and more widely. It has essentially changed biological and food performance characteristics, so more and more brought to the attention of the food science and technology workers. This paper expounds the definition of genetic engineering, gene engineering was introduced in detail the origin of the food, and introduces the application of genetic engineering in food raw material improvement; The application of genetic engineering in food fermentation; Genetic engineering application in the agricultural and sideline products processing, at the same time, discussed in the field of genetic engineering in food industry good development prospects.
Key word: Genetic engineering food industry food raw material improvement food fermentation agricultural and sideline products 一、基因工程的定义
狭义：指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；
广义：指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品；将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
基因工程食品: 基因工程食品是指利用生物技术改良的动植物或微生物所制造或生产的食品、食品原料及食品添加剂等。它是针对某一或某些特性以突变、植入异源基因或改变基因表现等生物技术方式，进行遗传因子的修饰，使动植物或微生物具备或增强此特性，进而降低生产成本，增加食品或食品原料的价值，例如增强抗病性、改变营养成分，加快生长速度、增强对环境的抗性等
二、基因工程的发展史
基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中"安家落户"，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
三、基因工程在食品原料改良中的应用
（一)水化合物的改良
食品碳水化合物类食品方面利用基因工程来调节淀粉合成过程中特定酶的含量或几种酶之间的比例，从而达到增加淀粉含量或获得独特性质、品质优良
的新型淀粉。例如：通过反义基因抑制淀粉分枝酶可获得完全只含有直链淀粉的转基因马铃薯。这样油炸后的产品更具有马铃薯的风味，更好的构质，较低的吸油量和较少的油味。
(二)油脂的改良
目前，控制脂肪酸链长的几个酶的基因和控制饱和度的一些酶的基因已被克隆成功，并用于研究改善脂肪的品质。如通过导入硬脂酸-ACP 脱氢酶的反义基因，可使转基因油菜种子中硬脂酸的含量从 2%增加到 40%。而将硬脂酞CoA 脱饱和酶基因导入作物后，可使转基因作物中的饱和脂肪酸(软脂酸、硬脂酸)的含量有所下降，而不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸)的含量则明显增加，其中油酸的含量可增加 7 倍。除了改变油脂分子的不饱和度外，基因工程技术在改良脂肪酸的链长上也取得了实效。事实上，高油酸含量的转基因大豆及高月桂酸含量的转基因油料作物芥花菜 (Canola)在美国已经成为商品化生产的基因工程油料作物品种。
(三)蛋白质的改良
食品中动植物蛋白由于其含量不高或比例不恰当，可能导致蛋白营养不良。采用转基因的方法，生产具有合理营养价值的食品，让人们只需吃较少的食品，就可以满足营养需求。例如，豆类植物中蛋氨酸的含量很低，但赖氨酸的含量很高；而谷类作物中的对应氨基酸含量正好相反，通过基因工程技术，可将谷类植物慕冈导入豆类植物，开发蛋氨酸含量高的转基因人豆。
（四）碳水化合物的改良
对碳水化合物的改进，只有通过对其酶的改变来调节其含量。高等植物体中涉及淀粉合成的酶类主要有: ADPP葡萄糖焦磷酸酶(ADP- GPP)、淀粉合成酶
基因工程实验技术介绍
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养 基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另 一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有 液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。 水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。 （2）琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 （3）琼脂糖凝胶的染色 电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。 三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌 感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培 养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培 养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液 中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去 上清液
基因工程实验报告
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
基因工程》课程实验指导书
《基因工程》课程实验指导书 生物技术专业 黄淑坚黄良宗编写 佛山科学技术学院 2005年12月
目录 前言 (Ⅱ) 实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） (1) 实验二DNA目的片段的回收与DNA的体外连接 (7) 实验三重组DNA的转化 (10) 实验四重组DNA的鉴定 (13) 实验五外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 (16) 实验六表达产物的检测与分析——SDS-PAGE (18) 附录 (22) 参考文献 (34)
前言 基因工程学是以生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科为基础而发展起来的一门新兴技术学科，自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。本实验指导书在在方法上，力求可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。 由于基因工程的发展异常迅速，加之编写人员水平有限，难免有疏漏与错误，敬请各位师生批评指正。 编者 2005年12月
实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） 一、目的和要求 了解反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）基本原理和实验应用，掌握RT-PCR 反应的基本技术。 二、实验内容 RT-PCR扩增猪流感病毒M2基因部分片段。 三、仪器、设备和实验准备 1、仪器 恒温水浴槽、移液枪、EP管、PCR管、超净工作台、PCR仪、电泳仪。 2、试剂 反转录酶、RNA酶抑制剂（RNase Inhibitor）、流感病毒RNA、随机引物、流感病毒M2基因PCR引物、dNTP、Taq酶。 3、实验准备 用RNA抽提试剂盒抽提猪流感病毒RNA。 四、实验原理 RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。 反转录反应是在反转录酶作用下，以RNA为模板指导合成互补的DNA链的过程。反转录反应可以使用反转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成，由这三个基本步骤组成多轮循环。
植物基因工程实验技术
植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月
前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
1
目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
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(完整版)高中生物选修3第一章基因工程习题及答案
高中生物选修3第一章基因工程习题 1. SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于 治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图 所示。请根据下图回答： SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X [乙的研究] 注射 注射 灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D 减毒处理 动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D （1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因 为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。 （2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也 可以通过生物学方法—— 技术生产。 （3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康人C 获 得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种 或多种 提供科学依据。 2. 聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术， 反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。 反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要 过程如右图所示。 （1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则 经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的 数量至少是 个。 （2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是 。 （3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处： ① 。 ② 。 ③ 。 3. 逆转录病毒的遗传物质RNA 能逆转录生成DNA ，并进一步整合到宿主细胞的某条染色 体中。用逆转录病毒作为运载体可用于基因治疗和培育转基因动物等。 （1）病毒在无生命培养基上不能生长，必须依靠活细胞提供 循环重复 [甲的研究] 用激素等治疗 非典病人A 治愈的病人A 健康人合成或生产 其他辅助治疗 接种 提纯、
基因工程实验指导 - 专业实验I
基因工程实验指导书
缩略词表
实验一植物总DNA 的抽提及电泳检测 一【实验目的】 1、了解植物DNA抽提的主要方法； 2、掌握快速抽提DNA的方法。 3、了解掌握检测DNA质量的方法以及DNA定量的方法； 4、了解影响DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素； 5、训练DNA的琼脂糖凝胶电泳操作。 二【实验原理】 该方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。CTAB能溶解于乙醇。 改进的CTAB植物DNA抽提液迅速裂解细胞和灭火细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白质，上清加入异丙醇离心沉淀基因组DNA，进一步去除其它各种杂质，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心步骤，进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将基因组DNA从硅基质膜上洗脱。 琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯化的重要实验手段。DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况下，单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。
基因工程实验(答案)
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
高中生物选修3第一章基因工程习题及答案word版本
第Ⅱ卷非选择题 三．非选择题： 29．（7分）SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图所示。请根据下图回答： SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X [乙的研究] 注射 注射 灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D 减毒处理 动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D （1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。 （2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也可以通过生物学方法—— 技术生产。 （3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康人C 获得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种或多种 提供科学依据。 30．（8分）聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。 （1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是 个。 （2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是 。 （3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处： ① 。 ② 。 循环重复 [甲的研究] 用激素等治疗 非典病人A 治愈的病人A 健康人合成或生产 其他辅助治疗 接种 提纯、
基因工程实验考试试题(答案)
1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？ 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？ 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。 答：①取0.5g琼脂糖置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂糖溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线； ④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇、冷的异丙醇、终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq DNA聚合酶）。 答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，
基因工程试验指导
《基因工程》实验指导 湖南师范大学生命科学学院 遗传与发育生物学系 2009年5月
基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建 一、实验目的 本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。 二、实验原理 转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。 三、材料
限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品； 3. 2菌株及细胞系 DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃； 3. 3 质粒与表达载体系统 3. 3.1 pEGFP-N1载体 pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。含有人类巨细胞病毒（CMV）启 图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒 动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内
基因工程实验的详细步骤
基因工程实验 实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化 试剂 A.LB液体培养基（L）: 1000ml 蛋白胨（tryptone）10g, 酵母提取物（yeast extract）5g, NaCl 10g, 加去离子水至1000ml 用5MNaOH调至pH7.2-7.5。121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。 B.LB固体培养基（L）： 每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。 C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。 Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。 D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。 E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS. F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml. G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/L NaCl, 终浓度为10mg/ml。100 o C加热15分钟，冷却后分装。 H.饱和酚：市售酚需重蒸。重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的 0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提， 使pH达到7.6以上。 I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。 J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。 K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。 三、操作步骤 1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含 50μg/ml Amp）中，37 o C培养约12小时至 对数生长后期。 2．质粒DNA的少量快速提取---碱裂解法 A.取1.5ml培养液倒入1.5ml ependorf 管中，4o C下12000g离心3min。 B.弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。 C.菌体沉淀重悬浮于100μl预冷的溶液I中（激烈震荡，充分混匀）。 D.加入新配制的溶液II 200μl，快速盖紧管口，并倒置离心管，温和颠 倒ependorf管6-8次，以混匀内容物（千万不要震荡）,放置5分钟。 E.加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒
DNA重组技术实验报告
一、实验名称： 重组DNA技术 二、实验目的： 1.了解掌握DNA重组技术理论基础； 2.掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法； 3.掌握连接产物的转化方法及操作； 4.掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法； 三、实验原理: 1.重组DNA技术 重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型的技术。它主要包括以下几个步骤： ①目的基因的获取：主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。cDNA文库是以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组DNA文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，因此称为基因组DNA文库。 ②基因载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。分为克隆载体和表达载体。克隆载体：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。表达载体：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物。选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。
③目的基因与载体的拼接：通过粘性末端连接法（同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接）、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。 ④重组DNA分子导入受体细胞：将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞，主要有以下几种方法：a、转化：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程。b、转染：将外源DNA导入真核细胞的过程。c、感染：以λ噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。 ⑤重组体的筛选：可通过遗传标记如抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂交）等直接筛选或是根据免疫化学法、酶联免疫检测法等进行间接筛选。 ⑥无性繁殖转化子(含重组分子的受体细胞) ⑦目的基因的表达 2、质粒酶切及鉴定原理 限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA双链，形成一定长度的DNA序列。根据限制性内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类，II型限制性内切酶只需要二价镁离子的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA片段具有相同的末端结构，而且大多数的II型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。本实验采用的限制性内切酶是Bam HI 和Hind III。 对于DNA回收，回收的目的是为了纯化提取的质粒，以用于以后的分子杂交、重组质粒的构建、序列分析等。目前常用的回收技术有：柱纯化回收法、电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、DEAE滤膜插片法等，其中柱纯化回收法、电
基因工程与克隆技术讲义答案
基因工程与克隆技术 考点1 基因工程 1.(2015·浙江10月选考,节选)答案:限制性核酸内切酶 2.(2016·浙江4月选考,节选) 答案:(1)逆转录重组DNA分子农杆菌 B (2)摇床维持渗透压 3.(2018·浙江4月选考,节选)回答与基因工程和植物克隆有关的 问题: (1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切,在切口处形 成。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成,获得重组质粒。 (2)已知用CaCl2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的 是 , 从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。 解析:(1)EcoRⅠ酶切目的基因和载体,在切口处形成粘性末端;DNA连接酶使具有相同粘性末端的两个片段形成磷酸二酯键,能获得重组 质粒。 (2)目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为转化。经转化的农杆菌,在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,以使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态。 答案:(1)粘性末端磷酸二酯键 (2)转化使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态 1.基因工程的工具 2.基因工程的原理与操作步骤 (1)基因工程的原理 ①基本原理:让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。 ②基本要素:多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等。 (2)基因工程的基本操作步骤 3.形成重组DNA分子 (1)单酶切法
基因工程实验报告资料
实验报告 实验项目名称：基因工程综合实验所属课程名称：基因工程原理 班级：12生物工程3班学号：201230620312 姓名：李杰锋 指导老师：徐学锋
目录 0.摘要 (1) 1.前言 (1) 2.实验材料和仪器 (2) 2.1 实验材料 (2) 2.2 实验仪器 (2) 3.实验试剂 (2) 3.1DNA提取所需试剂 (2) 3.2 PCR实验所需试剂 (2) 3.3 双酶切实验所需试剂 (2) 4.实验步骤 (3) 4.1 质粒DNA提取 (3) 4.2 聚合酶链式反应（PCR） (3) 4.3 质粒DNA的双酶切分析 (4) 4.4 琼脂糖凝胶制备 (4) 5.实验结果与分析 (5) 5.1质粒DNA提取所得凝胶电泳结果 (5) 5.2 PCR扩增实验结果 (5) 5.3质粒DNA的双酶切分析结果 (6)
摘要：本实验包括质粒DNA的提取、DNA的凝胶电泳、质粒DNA中靶基因的酶切分析及质粒DNA中重组进的靶DNA序列的PCR扩增。通过本综合实验，进一步理解质粒DNA的提取原理、凝胶电泳中DNA分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR是如何实现DNA扩增的，也掌握了DNA的提取技术、凝胶电泳技术、DNA酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，进而了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA或RNA的地方。 关键词：凝胶电泳限制线内切酶DNA质粒 1 前言 本次实验对象为含有重组了1kb DNA片段的PET32.a表达质粒。该表达质粒中长度约6kb。首先采用离心破碎法破碎细胞，再使用碱裂解法提取质粒DNA。最后通过各种化学抽提纯化质粒DNA，最后得到纯化后的DNA质粒作为之后实验的材料。在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA 又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。 PCR是根据DNA双螺旋结构在变性温度下解链为单链DNA，在退火温度下加入反应体系的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在延伸温度下，通过DNA聚合酶的聚合作用，不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，由引物引导合成出与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增的技术。本次实验我们将以纯化后的质粒DNA作实验材料，在预先设计好引物后
(整理)基因工程试验.
基因工程实验流程
实验一丹参总DNA的提取 实验目的：掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的方法。实验材料：丹参叶片 实验器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，研钵和杵，离心管，微量移液器，枪头 实验步骤： 第一次使用前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加入指定量的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! 取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使用前加入β-巯基乙醇到终浓度2%。 1.取适量植物组织（新鲜组织100mg 或干重组织30 mg）在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。 2.转移细粉到一个1.5ml离心管，不要解冻，加600μl 65℃预热的裂解液PL (确认已加入β-巯基乙醇至2%)，剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头轻柔吹打帮助裂解。如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。 3.65℃水浴20-60分钟，在水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。可选如果组织干燥或者产量低，可以适当延长水浴时间。如RNA残留多，可在水浴前加入6μlRNA酶（20mg/ml）。 4.加入700μl氯仿/异戊醇（体积比24：1混合），颠倒充分混
匀几分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离心5分钟。若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前用等体积酚/氯仿（1：1）抽提一遍。 5.小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管，注意不要吸到界面物质。如上清比较浑浊，则需要重复步骤4一遍，直到得到透亮上清。 6.较精确估算上清量，加入1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加入无水乙醇!）后立刻涡旋，充分混匀。此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。 7.将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放- 5 - 入收集管中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液（先加700μl离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心）。 8.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。 9.加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。 10.加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。 11.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 12.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴
基因工程复习资料资料
基因工程复习资料
细菌的限制—修饰作用 核酸限制性内切酶的类型及主要特性
一个单位的限制性核酸内切酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50uL反应体系中，1h完全降解1ug底物DNA所需要的酶量。 星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。同位酶：识别位点相同，但切点不同。 同裂酶：识别位点和切点均相同，但来源不同。 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端 两种DNA连接酶 （1）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。分子质量为68ku
（2）T4噬菌体DNA连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平齐末端。分子质量为75ku p35页表2-4 简述DNA连接酶的作用机制及其特点 说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤 基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体，噬菌体载体，黏粒载体，噬菌粒载体，病毒载体，人工染色体等 质粒的概念：质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA 分子—眼虫、衣藻等）双链DNA 分子（酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自身复制和表达。 共价闭合环状DNA（SC构型）开环DNA（ oc构型）线形DNA （L构型）同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。
理想质粒载体的必备条件： A、具有较小的分子质量和较高的拷贝数 B、具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点（多克隆位点） C、具有两种以上的选择标记基因 D、缺失mob基因（载体的安全性：质粒不能随便转移、条件致死突变） E、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达（复制起点）、较小的宿主范围 蓝白班筛选原理 穿梭质粒载体(shuttle vector) ：由人工构建的具有两种不同复制子起点和选择性标记基因 黏粒载体也称柯斯质粒载体：它是一类含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体 噬菌体载体的优越性p69 黏粒载体的基本特点 (P70) 具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染等)； 具有质粒载体的特性(易于克隆操作、选择及高拷贝等)； 具有较高容量（35kb-45 kb）的克隆能力； 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。 表达载体构建的一般原则