转绿僵菌几丁质酶基因木霉菌对鳞翅目类昆虫中肠细胞影响分子机理

目录

摘要 ............................................................................................................................... I ABSTRACT ................................................................................................................. V 主要缩略语中英文对照 ............................................................................................ XI 目录 ..................................................................................................................... XIV 第一章文献综述 (1)

1、昆虫病原真菌在防治农作物害虫中的研究进展 (1)

1.1 昆虫病原真菌主要种类 (1)

1.1.1 白僵菌 (1)

1.1.2 绿僵菌 (1)

1.2 昆虫病原真菌防治害虫的主要作用机理 (1)

1.2.1 侵染过程中体表附着阶段 (2)

1.2.2 侵染结构的形成 (2)

1.2.3 昆虫体壁降解酶在昆虫病原真菌防治害虫过程中的作用 (2)

1.2.4 昆虫病原真菌体内定殖 (4)

2、木霉菌在防治病虫害中的研究进展 (4)

2.1 木霉菌源生物农药的重要性 (4)

2.2 木霉菌防治植物病害研究进展 (5)

2.2.1 竞争作用 (5)

2.2.2 重寄生作用 (6)

2.2.3 抗生作用 (8)

2.2.4 诱导植物产生抗病性 (8)

2.3 木霉菌防治害虫研究进展 (9)

2.3.1 木霉菌对植物线虫的防治 (9)

2.3.2 木霉菌对其他种类害虫的防治 (9)

3、杀虫转基因工程菌的研究进展 (9)

3.1 杀虫基因作用靶标 (9)

3.1.1中肠围食膜 (10)

3.1.2 中肠微生态菌群 (10)

3.1.3 中肠“组学”研究 (11)

3.2杀虫工程菌的转化技术进展 (12)

3.2.1杀虫工程菌主要功能基因种类 (12)

3.2.2杀虫微生物工程菌构建与防效 (13)

4、存在的问题与展望 (14)

4.1 外源杀虫基因转化对木霉菌生长发育及功能基因表达的影响 (14)

4.2 转杀虫基因木霉菌的生物安全性评价 (15)

4.2.1 对非靶标害虫的影响 (15)

4.2.2 对有益昆虫的影响 (16)

5、本研究的意义和主要研究内容 (16)

5.1 同一时空病虫害的发生与危害 (16)

5.2 本研究的意义及主要研究内容 (16)

参考文献 (18)

第二章绿僵菌几丁质酶基因的克隆及转化木霉菌 (34)

1 材料与方法 (34)

1.1 材料与试剂 (34)

1.1.1 供试菌株及质粒 (34)

1.1.2 主要试剂、培养基及溶液配制 (35)

1.2 方法 (37)

1.2.1 绿僵菌chit42基因的克隆 (37)

1.2.2绿僵菌chit42基因转化康氏木霉菌T30 (41)

1.2.3转化子鉴定 (45)

1.2.4转化子的生物测定 (48)

1.3 绿僵菌chit42基因融合eGFP转基因木霉菌的构建及功能分析 (50)

1.3.1 融合过表达框的构建及ATMT转化木霉菌 (50)

1.3.2 chit42基因融合eGFP转基因木霉菌功能验证 (50)

2 结果与分析 (51)

2.1绿僵菌chit42基因的克隆 (51)

2.2 chit42基因ATMT载体构建 (52)

2.3 chit42过表达子的获得及在DNA水平上的验证 (53)

2.4 chit42过表达子在RNA水平上表达的验证及几丁质酶活测定 (56)

2.5 转化子的生物测定 (57)

2.5.1 玉米螟幼虫校正死亡率测定 (57)

2.5.2对玉米螟生长发育相关基因表达的影响 (58)

2.6 绿僵菌chit42基因融合eGFP木霉菌转化子功能验证 (59)

2.6.1 chit42基因融合eGFP木霉菌转化子外源基因表达 (59)

2.6.2 绿僵菌chit42基因融合eGFP木霉菌转化子对立枯丝核菌的体

外抑制 (60)

3 讨论 (61)

参考文献 (63)

第三章不同来源几丁质酶几丁质结合域的筛选及融合chit42基因木霉菌转化子的构建及功能分析 (66)

1 材料与方法 (66)

1.1 材料 (66)

1.1.1 菌株及质粒 (66)

1.1.2 主要试剂、培养基及溶液配制 (67)

1.1.3 仪器 (67)

1.1.4 本部分用到的引物序列 (67)

1.2 方法 (68)

1.2.1 不同来源几丁质酶几丁质结合域的选择及合成 (68)

1.2.2 融合几丁质酶基因表达载体构建 (69)

1.3 融合几丁质酶基因转化木霉菌及其转化子的分子鉴定 (70)

1.3.1 融合几丁质酶基因转化木霉菌 (70)

1.3.2 转化子的分子鉴定 (70)

1.4 融合几丁质酶基因转化子功能验证 (71)

1.4.1对亚洲玉米螟幼虫的校正死亡率 (71)

1.4.2 对亚洲玉米螟中肠显微结构的影响 (72)

1.4.3 对玉米螟中肠相关基因表达的影响 (72)

1.4.4 对轮枝镰孢菌和立枯丝核菌的抑制性 (73)

1.5 转化子对玉米螟幼虫中肠几丁质酶基因表达的影响 (73)

1.5.1 中肠几丁质酶基因的克隆 (73)

1.5.2 不同处理后玉米螟幼虫中肠几丁质酶基因表达分析 (74)

1.6 木霉菌工程菌对玉米穗离体条件接种禾谷镰孢菌及亚洲玉米螟幼虫

的防治分析 (74)

1.6.1 木霉菌及玉米果穗品种 (74)

1.6.2 木霉菌工程菌对玉米果穗接种病虫后的防治效果分析 (74)

2 结果与分析 (75)

2.1 融合几丁质酶转化子分子鉴定 (75)

2.2 融合几丁质酶基因转化子生防性能测定 (78)

2.2.1 玉米螟死亡率测定 (78)

2.2.2 对玉米螟中肠显微结构的影响 (79)

2.2.3对玉米螟生长发育相关基因表达的影响 (80)

2.2.4 对轮枝镰孢菌和立枯丝核菌的抑菌率测定 (81)

2.3 不同木霉菌株对玉米螟中肠几丁质酶表达的影响 (83)

2.3.1 玉米螟中肠几丁质酶基因的克隆 (83)

2.3.2 不同处理玉米螟中肠几丁质酶表达分析 (84)

2.4 木霉菌工程菌对玉米果穗穗腐病菌及玉米螟幼虫的防治分析 (85)

3 讨论 (86)

参考文献 (88)

第四章木霉菌CHIT42转化子对玉米螟幼虫中肠微生态的影响分析 (90)

1 材料与方法 (90)

1.1 材料 (90)

1.1.1供试玉米螟幼虫 (90)

1.1.2 供试质粒 (90)

1.1.3 试剂 (91)

1.2 方法 (91)

1.2.1 木霉菌几丁质酶发酵液的制备 (91)

1.2.2木霉菌及工程菌饲喂4龄玉米螟幼虫及中肠组织解剖和基因组

提取 (91)

1.2.3 中肠细菌16S rDNA文库的构建 (92)

1.2.4 文库组成分析及系统发育分析 (92)

1.2.5 中肠微生态组成及优势菌群变化分析 (93)

1.2.6 玉米螟幼虫中肠肠球菌的分离与鉴定 (93)

1.2.7 肠球菌对玉米螟幼虫的致病能力检测 (93)

2 结果与分析 (94)

2.1 不同处理玉米螟中肠16S rDNA文库的构建及不同文库优势菌群组

成分析 (94)

2.2 文库特点分析 (97)

2.3 文库中来源于不同OTU的系统发育分析 (100)

2.4 玉米螟幼虫中肠肠球菌的分离与鉴定 (101)

2.4.1 中肠肠球菌的分离 (101)

2.4.2 中肠肠球菌的鉴定 (102)

2.5 肠球菌对玉米螟幼虫的致病力检测 (104)

2.5.1 肠球菌菌悬液的制备 (104)

2.5.2 喂食肠球菌法测定肠球菌对玉米螟的致病力 (104)

2.5.3 注射肠球菌法测定肠球菌对玉米螟幼虫的致病力 (104)

3 讨论 (106)

参考文献 (107)

第五章木霉菌转化子对家蚕中肠蛋白质组的影响 (110)

1 材料与方法 (110)

1.1 供试菌株及家蚕 (110)

1.2 主要试剂及溶液配制 (110)

1.2.1 蛋白质提取试剂 (111)

1.2.2 蛋白裂解及2-D试剂 (111)

1.3 实验方法 (112)

1.3.1木霉菌孢子悬浮液制备 (112)

1.3.2含木霉菌孢子悬浮液饲料喂食家蚕 (112)

1.3.3 木霉菌及转化子对家蚕抑制效应分析 (113)

1.3.4 家蚕中肠组织解剖及蛋白提取 (113)

1.3.5 家蚕中肠相关基因的克隆、RT-PCR及qRT-PCR (116)

1.3.6 谷胱甘肽-S-转移酶RNA干扰 (118)

2 结果与分析 (121)

2.1 木霉菌转化子对家蚕的抑制 (121)

2.2 对家蚕中肠蛋白质组学的影响 (124)

2.2.1 不同处理中肠蛋白质提取及双向电泳 (124)

2.2.2 差异蛋白点鉴定 (125)

2.2.3 差异蛋白质表达分析 (129)

2.3 GSTs2基因的RNA干扰 (133)

2.3.1 GSTs2基因RNA干扰载体构建 (133)

2.3.2 干扰后GSTs2基因在转录水平上的表达 (134)

2.3.3 GSTs2基因干扰后对家蚕应答木霉菌胁迫的影响 (135)

2.3.4 GSTs2基因干扰后对GST家族其他基因表达的影响 (135)

3 讨论 (136)

参考文献 (139)

第六章论文创新点、主要结论与后续工作展望 (142)

1 论文创新点 (142)

2 主要结论 (142)

3 后续工作展望 (144)

附录 (146)

一、攻读博士学位期间发表及拟发表的论文 (146)

二、学术会议论文 (147)

三、教材编写 (147)

致谢 (148)

第一章文献综述

1、昆虫病原真菌在防治农作物害虫中的研究进展

1.1 昆虫病原真菌主要种类

据不完全统计，世界上已记载的虫生真菌有100个属800多个种[1-2]。昆虫病原真菌约占昆虫病原微生物的60%以上，昆虫病原真菌可分为两大类，分别是子囊菌门（Ascomycota）和接合菌门（Zygomycota）。在我国，已报道的昆虫病原真菌已达405种，其中虫草属（Cordyceps）80种，寄生线虫的真菌有10种，寄生昆虫的真菌有215种，在所有报道的昆虫病原真菌中，开发应用的有约20种，其中应用最广泛的是白僵菌（Beauveria sp.）和绿僵菌（Metarhizium sp.）。

1.1.1 白僵菌

依据形态指标、生理生化指标及核酸指标将白僵菌属分为7个种，分别是球孢白僵菌（B. bassiana）[3]、布氏白僵菌（B. brongniartii）[4]、白色白僵菌（B. alba）[5]、多形白僵菌（B. amorpha）[6]、蠕孢白僵菌（B. vermiconia）、粘孢白僵菌（B. araneara）和苏格兰白僵菌（B. caledonica）[7]，目前农业部登记注册的白僵菌类真菌杀虫剂是球孢白僵菌（主要用于防治松毛虫和玉米螟）和布氏白僵菌（主要用于防治花生蛴螬）。

白僵菌类真菌杀虫剂同样存在效果不稳定，击倒害虫时间长及杀虫作用缓慢等缺点，其应用受到限制。

1.1.2 绿僵菌

绿僵菌属子囊菌门、肉座菌目、麦角菌科、绿僵菌属，是一种广谱的昆虫病原菌。绿僵菌主要种类包括白色绿僵菌（M. album）、金龟子绿僵菌（M. anisopliae）[8]和黄绿绿僵菌（M. flavoviride）[9]。目前全世界登记的绿僵菌类杀虫剂有17个，被广泛应用于农作物、森林、卫生等害虫的防治，其中主要是金龟子绿僵菌。

绿僵菌类真菌杀虫剂具有光谱的杀虫作用，利用其防治农业害虫，经济且对环境无污染，但由于其杀虫作用较慢，击倒害虫时间较长，其应用受到限制。1.2 昆虫病原真菌防治害虫的主要作用机理

昆虫病原真菌对寄主昆虫的入侵和感染一般分为以下几个阶段，依次为孢子