组织学技术的基本理论和技术

组织学技术的基本理论和技术

组织制片分类

一、超活体染色制片二、活体染色制片三、分离制片法四、涂片法五、印片法六、整装片七、磨片法八、切片法九、血管注射法十、整装切片法

组织制片技术及其神经组织的制片技术

一、动物麻醉法1.乙醚吸入麻醉法2.戊巴比妥钠或乌拉坦注射麻醉法3.空气栓塞4.直接杀死法

二、动物取材（一）动物选择（二）组织取材的方法

神经系统的取材1.脊髓2.神经纤维3.大脑和小脑

三、固定和固定液

（一）固定的目的和意义:

目的：

1、能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。

2、保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。

3、使组织硬化，便于切块。

4、对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。

5、保存好大体标本。

6、可增强染色的作用

意义：

组织经一系列的处理后，就必须进行固定，当然有的组织是先固定，再进行处理，然后再固定。固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。

（二）固定的方法1.小块组织固定法2.局部组织固定法3.整体注射固定法4.蒸汽固定法三、固定和固定液

（三）组织固定与温度的关系

Bernard经过一系列的研究后认为，肝、肾、肺的最佳固定温度是70℃，和77℃，因为各种组织的结构不同，成分不一，电子密度不一样，因而固定所需要的温度也不样。我们的实验认为，65℃左右的温度可适合于各种组织，条件是固定取小块材料，时间在截取3-4min。（四）固定应注意的问题

1、组织固定越新鲜越好。

2、组织固定，组织块不宜过大。

3、对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。

4、组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。

5、固定液的量要充分。

6、特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。

7、组织的第二次固定或后固定。

（五）固定液：固定液必须具备的性能：固定液必需要有较强的渗透能力，能迅速地渗入组织内部，不会使组织过度收缩或膨胀，并且能使组织内易观察的成分可以凝固为不溶性物质，能使组织达到一定的硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲和力。

固定液的分类

单纯固定剂

1.福尔马林

2.乙醇

3.丙酮

4.氯化汞

5.重铬酸钾

6.铬酸

7.苦味酸

8.锇酸

9.醋酸10.三氯醋酸

固定液的分类

混合固定剂

1.甲醛混合固定液

2.酒精混合固定液

3.丙酮混合固定液

4.氯化汞混合固定液

5.重铬酸钾混合固定液

6.铬酸混合固定液

7.锇酸混合固定液

8.苦味酸混合固定液

9.三氯醋酸混合固定液四、组织冲洗、脱水与透明

（一）组织冲洗

1.简易流水冲洗法

2.一列式玻瓶或水槽冲洗法

3.倒置冲洗法

4.酒精洗涤法

组织与酒精1：20 12～24小时50%~70%酒精，更换3~6次，每4小时更换一次，可在70％酒精中较长时间保存

（二）组织脱水 1.脱水剂乙醇丙酮正丁醇二氧氯环 2.脱水方法

（三）组织透明1.二甲苯2.甲苯3.苯4.香柏油5.三氯甲烷（氯仿）6.安妮林油

五、组织浸蜡与包埋

（一）浸蜡软蜡：熔点：45～54℃硬蜡：熔点：56～58℃，60～62℃（包埋）（二）包埋 1.石蜡包埋操作过程制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋。

2.石蜡包埋注意事项

1.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求再60C左右。

2.包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。

另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。

3.包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也恰好用完为宜。

4.包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。

5.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷曲。

6.相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致，以利切片。

7.多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时，组织的排列一定要密挤靠拢，以求成直线或方块行，这样有利于切片。

8.石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水中加速冷却可增加石蜡密度，韧性和硬度。但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。

六、组织切片1.石蜡切片法2.火棉胶切片法3.冰冻切片法

七、染料与染色

（一）染色简史

（二）染料分类1.天然染料苏木精胭脂红（卡红）地衣红2.人工合成染料

八、常规染色技术

H-E染色的步骤和方法

常规HE染色步骤

（1）二甲苯（Ⅰ）5-10 min (2) 二甲苯（Ⅱ）5-10 min (3) 95%乙醇（Ⅰ）1-3 min（4）95%乙醇（Ⅱ） 1-3 min （5）80%乙醇 1 min（6）蒸馏水 1 min （7）苏木精液染色5-15 min (8 ) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s (9) 1%盐酸乙醇1-3 s (10) 稍水洗10-30 s (11)促蓝液返蓝10-30 s (12) 流水冲洗10-15 min （13）蒸馏水过洗 1-2 s (14) 0.5%曙红液染色1-3 min (15) 蒸馏水稍洗1-2 s (16) 80%乙醇稍洗 1-2 s (17) 95%乙醇（Ⅰ）2-3 s (18) 95%乙醇（Ⅱ） 3-5 s (19) 无水乙醇5-10 min (20) 石炭酸二甲苯5-10 min (21) 二甲苯（Ⅰ） 2 min (22) 二甲苯（Ⅱ） 2 min (23) 二甲苯（Ⅲ） 2 min (24) 中性树胶封固

注：①第（10）、（11）步可省去，（12）步冲水时间需延长至20-30min。

②第（20）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用无水乙醇。

冷冻切片HE染色步骤：（1）冰冻切片固定10～30 s

（2）稍水洗1～2 s（3）苏木精液染色（60℃） 30～60 s

（4）流水洗去苏木精液5～10 s（5）1%盐酸乙醇1～3 s

（6）稍水洗1～2 s（7）促蓝液返蓝5～10 s

（8）流水冲洗15～30 s（9）0.5%曙红液染色 30～60 s

（10）蒸馏水稍洗 1～2 s（11）80%乙醇 1～2 s

H-E染色应注意的问题

（1）取材,提前配好各种固定液,并备有大量原液备用,取材后立即整修组织块,换固定液后继续固定。

（2）取消化管时应注意的问题:因为消化管的粘膜上皮容易破坏和自溶,以往取材多为小片块,而且在外力(手压、刀切)作用下易造成粘膜损坏和肌层收缩.因此我们采用取大片及长段组织固定,将剖开的消化管贴在滤纸上.因消化管管壁薄,大片及长段固定不影响固定液的渗透,固定效果理想,然后再取未受损部位组织脱水,包埋,保存。

（3）消化管部位以空腹取材最为理想,尽量避免冲洗,特别是胃的壁细胞在空腹时胞质着色非常鲜亮。

（4）载玻片和盖玻片的处理:载玻片最好在无水乙醇中浸泡12～24hr,以达到彻底脱脂的目的,用前再用的确良白布擦净;盖玻片必须在清洗液中浸泡24hr后清水冲洗,浸无水乙醇数小时后用尼龙绸布擦净。

（5）伊红染液的浓度:以往常用0.5%～1%的伊红染液,此浓度脱色时间长,可以采用95%乙醇450ml+1%复制伊红乙醇溶液50ml的稀释液染色。

（6）封片:将切片从二甲苯中取出后,用尼龙绸布将组织周围的二甲苯擦净,组织片避免干燥,滴少许中性树胶,将盖片在酒精灯上烤一下,以达到蒸发空气中水份及将盖片上肉眼不易观察到的污物烧掉,并有利于中性树胶的均匀扩散。

（7）磨刀:在自动磨刀机上加机油磨刀,磨后擦净刀上的污垢即可切片.免去鐾刀这一工序,因经过鐾刀皮鐾刀有时使刀口损坏,(鐾刀皮用时间长后,刀皮二边上翅或鐾刀角度稍有不当,用力不匀等均能造成刀口损坏)。

细胞与组织的特殊染色技术

概述

细胞学特染技术

神经节神经细胞内高尔基复合体的显示

1.Da-Fano氏高尔基复合体显示法

2.Mcdonald氏高尔基复合体改良法

3.Cajal硝酸铀高尔基复合体显示法

4.高尔基复合体Elftman氏直接浸银法

5.高尔基复合体锇酸浸染法

神经组织

一、神经组织的取材和固定二、常用染色法三、神经组织染色注意事项

神经细胞（一）神经细胞分离标本牛脊髓神经细胞分离卡红染色法（二）大、小脑神经细胞及其突起的染色Cox氏法（三）小脑篮状细胞Kopsch氏改良Golgi氏法（四）假单极神经元Ranson氏吡啶银法（五）双极神经元De Castro氏法

神经细胞（六）多极神经元Ranson氏吡啶银法肠壁肌间神经丛的显示（七）尼氏体尼氏体天竺牡丹染色法尼氏体天青Ⅱ－焦油紫染（八）高尔基复合体高尔基复合体的显示法（九）攀缘纤维Ranson氏吡啶银法（十）神经原纤维Cajal氏法

突触改良的Cajal氏法

神经纤维1.郎飞氏结郎飞氏结石蜡切片法郎飞氏结分离制片法 2.神经纤维髓鞘漏斗膜Cajal氏硝酸铀法3.神经角质网的显示Hansen氏铁苏木精染色法

神经末梢Gross-Schultze氏改良Bielschowsky氏法Faworsky氏法对肌梭的显示

改良的Bielschowsky氏法对整装片环层小体的显示Lowit氏氯化金－甲酸法显示运动终板内脏神经末梢美兰超活体染色法

髓鞘（一）正常髓Weigert氏苏木精染色法髓鞘四氧化锇染色法（二）变性髓鞘Swank-Davenport改良March氏法染变性髓鞘Weigert-pal氏髓鞘染色

神经胶质细胞

1.纤维性星形胶质细胞Cajal氏金升汞法

2.原浆性星形胶质细胞Kopsch氏改良Golgi氏法

3.小胶质细胞改良的Penfield氏法

4.少突胶质细胞Grino氏法

神经组织特殊染色技术

一、Golgi氏神经细胞及突起镀银法二、Golgi’s-Cox法三、Cagal氏神经原纤维镀银法四、Cajal六法突触显示法五、Golgi-Jen氏突触镀银法六、Cajal吡啶银法（一）七、Cajal吡啶银法（二）神经组织特殊染色技术八、Nissl body C.V.T.M.T.合并染色法九、Nissl body 石碳酸复红染色法十、比萨斯克氏神经组织染色法十一、神经胶质细胞Cajal氏镀银法十二、少突胶质细胞和小胶质细胞Grino改良法十三、Del Rio-Hortega氏小胶质细胞和少突胶质细胞镀银法神经组织特殊染色技术十四、神经胶质细胞Penfield改良法十五、大脑皮质细胞分层及神经胶质细胞石蜡切片镀银法十六、少突胶质细胞和小胶质细胞Marchall法十七、Ranson氏游离神经末梢染色十八、运动终板、肌梭及腱梭镀金技术

神经髓鞘染色技术十九、Luxol快兰－焦油紫正常髓鞘及尼氏体染色法（Kluver氏）二十、Weil髓鞘染色法二十一、髓鞘（Osmic Acid）染色法二十二、Spielmeyer’s髓鞘冰冻切片染色法二十三、weigert’s神经髓鞘染色法神经髓鞘染色技术二十四、变性髓鞘Nauta 和Gygax染色法二十五、Fink Heimer 变性髓鞘染色法二十六、变性髓鞘新镀银方法（日本1975）二十七、Bielschowsky-Gros肠肌神经丛镀银技术二十八、中枢神经系统神经终足铬－银浸染技术二十九、乙酰胆碱酯酶与硝酸银混合法显示肌肉中神经轴突及运动终板

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