总大肠菌群分析检测实施细则
总大肠菌群分析检测实施细则
粪大肠菌群是细菌中的一部分，是指一群在37℃培养2h能发酵乳搪、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌。
多管发酵法
一、适用范围
本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。
本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。
二、实验室所用设备、器皿
1、无菌区工作台
2、恒温培养箱
3、高压蒸汽灭菌器
4、冰箱
5、酒精灯
6、天平
7、电炉
8、采样广口瓶
9、烧杯、玻璃棒
10、玻璃发酵管
11、试管架
12、移液管
13、锥形瓶
二、培养基
（1）乳糖蛋白膝培养液乳糖蛋白胨培养液
蛋白胨10克
牛肉浸膏3克
乳糖5克
氯化钠5克
溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL
蒸馏水1000 mL
制法：将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2——7.4，再加人1 ml 16g/l的澳甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95kPa (115℃，10lb）高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
（2）二倍浓缩乳糖蛋白膝培养液按上述乳糖蛋白陈培养液
除蒸馏水外，其他成分量加倍
（3）伊红美蓝培养基
A蛋白陈10g
B 乳糖10g
C 磷酸氢二钾2g
D 琼脂20g~30g
E 蒸馏水l000ml
F 伊红水溶液（20g/l) 20ml
G 美蓝水溶液（5g/L) 13m
制法：将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加人乳糖，混匀后分装，以68.95kPa (115℃，10lb）高压灭菌20min。临用时加热融化琼脂，冷至50℃～55℃，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。
（4）革兰氏染色液
4.1结晶紫染色液
成分：a 结晶紫1g
b 乙醇（95%，体积分数）20mL
c 草酸钱水溶液（10g/l）80mL
制法：将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸馁溶液混合。注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。
4.2革兰氏碘液
成分：a 碘1g
b 碘化钾2g
c 蒸馏水300 ml
制法：将碘和碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。
4.3脱色剂：乙醇（95%，体积分数）。
4.4沙黄复染液
成分：a 沙黄0.25g
b 乙醇（95沉，体积分数）10ml
c 蒸馏水90mL
制法：将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加人蒸馏水。
4.5染色法
A将培养18h~24h的培养物涂片。
B将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
C滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
D滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s，水洗
E滴加复染剂，复染1min，水洗，待干，镜检。
三、仪器
培养箱：36℃士1℃。
冰箱：0℃～4℃。
天平
显微镜。
平皿：直径为9cm。
试管
分度吸管：1mL , 10mL。
锥形瓶
小倒管。
载玻片
四、实验步骤
1、乳糖发酵试验
取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白陈培养液中，取lml水样接种到10mL单料乳糖蛋白陈培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml（即0.1ml 水样）注入到10ml单料乳糖蛋白陈培养液中，每一稀释度接种5管。
对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10 mL水样双料培养基，每份接种10ml水样。
检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.1，0.0lmL甚至0.1 ,0.01 ,0.001 ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种．每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌刻度吸管。
将接种管置36℃士l℃培养箱内，培养24h士2h，如所有乳糖蛋白膝培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。
2、分离培养
将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃土1℃培养箱内培养18h~24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。
深紫黑色、具有金属光泽的菌落；
紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；
淡紫红色、中心较深的菌落。
3、证实试验
经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽抱杆菌，同时接种乳糖蛋白豚培养液，置36℃士1℃培养箱中培养24h士2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。
五、结果报告
根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN ( most Probable number，最可能数）检索表，报告每l00ml水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。乌管法结果见表2.15管法结果见表3稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。
表2 用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MPN )
5个10ml管中阳性管数最可能数（MPN）
0 < 2.2
1 2.2
2 5.1
3 9.2
4 16.0
5 >16
表3 总大肠菌群MPN检索表
（总接种量55.5mL，其中5份10mL水样，5份1mL水样，5份0.1mL水样）
接种量/mL
总大肠菌群
/(MPN/mL)接种量/mL
总大肠菌群
/(MPN/mL)
10ml管1ml管0.1ml管10ml管1ml管0.1ml管
0 0 0 <2 1 0 0 2 0 0 1 2 1 0 1 4 0 0 2 4 1 0 2 6 0 0 3 5 1 0 3 8
0 0 4 7 1 0 4 10
0 0 5 9 1 0 5 12
0 1 0 2 1 1 0 4
0 1 1 4 1 1 1 6
0 1 2 6 1 1 2 8
0 1 3 7 1 1 3 10
0 1 4 9 1 1 4 12
0 1 5 11 1 1 5 14
0 2 0 4 1 2 0 6
0 2 1 6 1 2 1 8
0 2 2 7 1 2 2 10
0 2 3 9 1 2 3 12
0 2 4 11 1 2 4 15
0 2 5 13 1 2 5 17
0 3 0 6 1 3 0 8
0 3 1 7 1 3 1 10
0 3 2 9 1 3 2 12
0 3 3 11 1 3 3 15
0 3 4 13 1 3 4 17
0 3 5 15 1 3 5 19
0 4 0 8 1 4 0 11
0 4 1 9 1 4 1 13
0 4 2 11 1 4 2 15
0 4 3 13 1 4 3 17
0 4 4 15 1 4 4 19
0 4 5 17 1 4 5 22
0 5 0 9 1 5 0 13
0 5 1 11 1 5 1 15
0 5 2 13 1 5 2 17
0 5 3 15 1 5 3 19
0 5 4 17 1 5 4 22
0 5 5 19 1 5 5 24
接种量/mL 总大肠菌群
/(MPN/mL)接种量/mL 总大肠菌群
/(MPN/mL)
10ml管1ml管0.1ml管10ml管1ml管0.1ml管
2 0 0 5
3 0 0 8
2 0 1 7
3 0 1 11
2 0 2 9
3 0 2 13
2 0
3 12 3 0 3 16
2 0 4 14
3 0
4 20
2 0 5 16
3 0 5 23
2 1 0 7
3 1 0 11
2 1 1 9
3 1 1 14
2 1 2 12
3 1 2 17
2 1
3 1
4 3 1 3 20
2 1 4 17
3 1
4 23
2 1 5 19
3 1 5 27
2 2 0 9
3 2 0 14
2 2 1 12
3 2 1 17
2 2 2 14
3 2 2 20
2 2
3 17 3 2 3 24
2 2 4 19
3 2
4 27
2 2 5 22
3 2 5 31
2 3 0 12 3 3 0 17
2 3 1 14 3 3 1 21
2 3 2 17 3 3 2 24
2 3 3 20 3 3 3 28
2 3 4 22 3 3 4 32
2 3 5 25 3 3 5 36
2 4 0 15
3
4 0 21
2 4 1 17
3
4 1 24
2 4 2 20
3
4 2 28
2 4
3 23 3
4 3 32
2 4 4 25
3
4 4 36
2 4 5 28
3
4
5 40
2 5 0 17
3 5 0 25
2 5 1 20
3 5 1 29
2 5 2 2
3 3 5 2 32
2 5
3 26 3 5 3 37
2 5 4 29
3 5
4 41
2 5 5 32
3 5 5 45
接种量/mL 总大肠菌群
/(MPN/mL)接种量/mL 总大肠菌群
/(MPN/mL)
10ml管1ml管0.1ml管10ml管1ml管0.1ml管
4 0 0 13
5 0 0 23
4 0 1 17
5 0 1 31
4 0 2 21
5 0 2 43
4 0 3 2
5 5 0 3 58
4 0 4 30
5 0 4 76
4 0
5 3
6 5 0 5 95
4 1 0 17
5 1 0 33
4 1 1 21
5 1 1 46
4 1 2 26
5 1 2 63
4 1 3 31
5 1 3 84
4 1 4 36
5 1 4 110
4 1
5 42 5 1 5 130
4 2 0 22
5 2 0 49
4 2 1 26
5 2 1 70
4 2 2 32
5 2 2 94
4 2 3 38
5 2 3 120
4 2 4 44
5 2 4 150
4 2
5 50 5 2 5 180
4 3 0 27
5 3 0 79
4 3 1 33
5 3 1 110
4 3 2 39
5 3 2 140
4 3 3 4
5 5 3 3 180
4 3 4 52
5 3 4 210
4 3
5 59 5 3 5 250
4 4 0 34
5 4 0 130
4 4 1 40
5 4 1 170
4 4 2 47
5 4 2 220
4 4 3 54
5 4 3 280
4 4 4 62
5 4 4 350
4 4
5 69 5 4 5 430
4 5 0 41 5 5 0 240
4 5 1 48 5 5 1 350
4 5 2 56 5 5 2 540
4 5 3 64 5 5 3 920
4 5 4 72 5 5 4 1600
4 5 5 81 5 5 5 >1600
菌落总数、大肠菌群测定方法
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
大肠杆菌的检测(MPN计数法)
食品微生物检验技术课程综述 大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科114 姓名：张花 学号： 114031431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟 大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌 Petrifilm测试法
1设备和材料 1.1恒温培养箱：36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂 2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏
总大肠菌群数量测定
总大肠菌群 在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直接测定肠道致病菌。 总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 一多管发酵法 1应用范围 1.1本法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。 1.2水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在。 2原理 根据总大肠菌群应具有的生物特性， 产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。 3仪器 3.1显微镜 3.2革兰氏染色用有关器材。 3.3高压蒸汽灭菌器。 3.4干热灭菌箱。 3.5恒温箱。
3.6冰箱。 3.7放大镜。 3.8试管、平皿（直径 4培养基 4.1乳糖蛋白胨培养液 4.1.1成分 蛋白胨10g 牛肉膏3g 乳糖5g 氯化钠5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 蒸馏水1000ml 4.1.2制法 将蛋白胨、牛肉膏、 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液， 灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。4.3品红亚硫酸钠培养基（供多管发酵法用）4.3.1成分 蛋白胨10g
乳糖10g 磷酸氢二钾3.5g 琼脂15~30g 蒸馏水1000ml 无水亚硫酸钠5g左右 5%碱性品红乙醇溶液 4.3.2储备培养基的制备如革兰氏阴性无芽胞杆菌， 9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中 1ml 1000ml蒸馏水中加热溶解， 充分混匀，分装于装有倒管的试管中，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸160℃灭菌2h 调整pH为7.2~7.4，再加入1ml置高压蒸汽灭菌器中，以115℃乳糖及氯化钠置于 20ml 先将琼脂加至900蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH值为7.2~7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌中以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.3.3平皿培养基的配制 将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。
大肠菌群平板计数法的注意事项
大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要 求检测的项目。在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠 菌群平板计数法的注意事项。 方法选择 相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标 此处不再赘述。因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。 培养基的要求 平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。但值得注意 的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。 稀释度的确定 国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。什么样的稀释度是合适的呢这要根据计数来决定。计数环节要求选择菌落数在15CFU-150CFU的平板进行计数，
大肠菌群测定方法
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。 具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 （二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。证
(完整版)实验9水中总大肠菌群的测定—多管发酵法
实验九水中总大肠菌群的测定—多管发酵法一．实验目的和要求 1．掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术。 2．预习第六章细菌学检验法的关内容。 二．原理 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。 三．仪器 (1)高压蒸气灭菌器。 (2)恒温培养箱、冰箱。 (3)生物显微镜、载玻片。 (4)酒精灯、镍铬丝接种棒。 (5)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶。 四．培养基及染色剂的制备 1．乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。 2．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。 3．品红亚硫酸钠培养基： ①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀，定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于冷暗处备用。 ②平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠，置于另一灭菌试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭菌）。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再褪至淡红色为止（不宜加多）。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即将此培养基适量（约15mL）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。 4．伊红美培养基： ①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解。再家人2.0g邻酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。
大肠菌群检测方法
大肠菌群检测方法 进入无菌室步骤 1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。 2．关灯后0?5小时后放可进入。 3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套 实验步骤 1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成） 2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。 3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml） 4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml） 5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液 7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml） 8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。） 10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中） 11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成 －2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成 －3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样 12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面） 13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。 14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准） 15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。16，清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。
水的大肠菌群检测方法
4．1 在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100mL。 4．2 在10支装有5mL三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10mL。 4．3 轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。 4．4 观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。 5 证实试验 5．1 平板分离 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。 5．2 复发酵试验 挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36±1℃培养箱中，培养24h。5．3 凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，为大肠菌群阳性。记下证实实验的阳性管数，查最大可能数（MPN）检索表得出1000mL水样中总大肠菌群的MPN值。 总大肠菌群（MPN）检索表 二、大肠菌群膜法测定 1 定义 大肠菌群（coliform bacteria）为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，将带菌滤膜贴在含乳糖的选择性培养基上，经37℃培养24小时后，呈现深暗红色带金属光泽的菌落。 2 仪器 2．1 滤器 2．2 滤膜，孔径0．45μm。直径根据滤器规格，目前常用的有35mm和27mm两种。 2．3 抽滤设备 2．4 无齿镊子 2．5 其它仪器见《GB/T ××××－××公共场所茶具微生物检验方法，大肠菌群测定》中第3章。 3 培养基 3．1 品红亚硫酸钠培养基 3．1．1 成分：蛋白胨10g 酵母浸膏5g 牛肉膏5g 乳糖10g 琼脂10～20g 磷酸氢二钾3．5g
colitag大肠菌群和埃氏大肠杆菌快速检测方法.
Colitag大肠菌群和埃氏大肠杆 菌快速检测方法 主要内容 ?基本概念 ? Colitag方法特点 ?基本介绍 ?检测过程 |?第三方认可
基本介绍 ?总大肠茵群醉底物法 在选择性培养基上能产生半乳辖并酶的细菌群落，请细茵群落能分解色廉底物释放色廉体使培养基呈现颜色査化，以此技术来检测水中总大肠茁影的方法称为总大肠茵群髓底场法 ?埃氏大肠杆茵酶底物法 在选择性培养基上能产生半乳罄昔酶，分解色孫底物，释放出色原体，从而使培菲基颜色发生变化.同时，酸酶分解产生荧光物质，便苗落能够在紫外光照射下产生特征桂荧光，以此技术检测埃氏大肠杆苗的方法称为埃氏大肠杆繭酶底物法. Coli tag方法特点 ?可以检测到受损大肠苗群和埃氏大肠杆菌。其它方法检测这些受损酋时常会遗漏. ?操作过趕简单.检测准确度高，假阳柱和假阴性是目前最低的. ?检测时间短于传统方法.
基本介绍 ?检测时何：24小时 *羹国国家环保蜀等权嵐机构测试站匙：佩阴柱lb假朋性小于 ?检测At生勒种矣：可同时栓测大厢荀祥和埃氏大麟轩罠感同时隆测龔丸騰杆36和疑氏丸肠打歲 ] ＜楼测结杲更迟方式；可绘测有#无，也可检剧瑕可能鈿苗数（MPN〕 ?检测所需配舍谊备：可调恒涅培拓箱（蛋少可必控制.禎口拓振氏度 ^44.5+0.2 ）T专刑玖管（鈕果只检测山有喷T则不宵要此 确）* M6nm UV灯（用366 nm匸￥灯照射观蔡灵龙｝? ?方法权威性：其吗国事环保局认可的标准快速检测方法：中圍国曩标准中規定的*＜屣*T法；日本、韩国*法国和名西等国家的国素折准* 拥有Fi：j（l refiusviuidim^if 41 - 檢测下喂；MFI /10（hnl.液俸 检测过程1.取一包检测试剂，与100 mL被测液体混合；2.摇匀混合，充分溶解，若要定量则转移溶液至定量盘，在35摄氏度的环境下培养22-26小时。培养后的水样进行以下认定： A :如果水样呈黄色，说明有大肠菌群存在；B:如果用366 nm UV灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在。3.如果检测粪大肠菌，则先在35度环境下培养4小时后，改成44.5度培养20小时，进行以上第3项观测。A:如果水样呈黄色，说明有粪大肠菌存在；B:如果用366 nm UV 灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在 第三方认可（1）美国EPA认可：美国EPA目前已经认可10种用于检测大肠菌群和埃氏大肠杆菌的方法，其中Co litag是美国EPA认可的检测数据最好的 一种。Colitag通过美国国家环保局严格的检测程序，结果表明：colitag检测大肠 菌群和大肠杆菌的假阴性为0%，假阳性小于5%。这个结果首先是由美国国家环保局的生物学家以正式信函的形式通知CPI公司。后来这一结果在2002年3月的 《联邦登记》（Federal Registe）上发表，具体请见67卷45期第10538页（Page 10538, Vol. 67 N O. 45）。同时，美国国家环保局对另一方法的检测报告显示，该法检
滤膜法测定总大肠菌群
滤膜法测定总大肠菌群 1 主题内容与适用范围 本方法规定了生活饮用水中总大肠菌群的滤膜测定方法。 本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。 2 方法提要 用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。 3 培养基与试剂 3.1 品红亚硫酸钠培养基 3.1.1 成份 A 蛋白胨10g B 酵母浸膏5g C 牛肉膏5g D 乳糖10g E 琼脂15~20g F 硫酸氢二钾3.5g G 无水亚硫酸钠5g左右 H 碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mL I 蒸馏水1000mL 3.1.2 储存培养基的制备 先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2~7.4，再加入乳糖，分装，115℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。 3.1.3 平皿培养基的配制 将上法制备的储存培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。 用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿中。待冷却凝固后置冰箱内备
用。此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。 3.2 乳糖蛋白胨培养基 3.2.1 成份 A 蛋白胨10g B 牛肉膏3g C 乳糖5g D 氯化钠5g E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL F 蒸馏水1000mL 3.2.2 制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4 仪器 4.1 滤器。 4.2 滤膜，孔径0.45~0.65μm。直经根据滤器规格，目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。 4.3 抽滤设备。 4.4 无齿镊子。 4.5 培养箱: 36±1℃。 4.6 冰箱: 0~4℃。 4.7 天平。 4.8 显微镜。 4.9 平皿: 直径为9cm。 4.10 灭菌刻度吸管: 1mL,10mL。 5 检验步骤 5.1 准备工作 5.1.1 滤膜灭菌: 将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。
全面大肠菌群平板计数法的注意事项..docx
大肠菌群平板计数法的注意事项 大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要求检 测的项目。在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠菌群 平板计数法的注意事项。 方法选择 相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。但大肠菌群多少算是含量较高呢？国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以 100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标 此处不再赘述。因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。 培养基的要求 平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min 即可使用。特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。但值得注意的是，VRBA 需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。 稀释度的确定 国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。什么样的稀释度是合适的呢？这要根据计数来决定。计数环节要求选择菌落数在15CFU-150CFU的平板进行计数，因此培养后菌落数在这个范围内的稀释度就是适宜的稀释度。实验室经常检测的产品的大肠菌群的水平检测人员可以预计的，但是对盲样，我们能做的只有根据实
水质 总大肠菌群测定作业指导书
水质 总大肠菌群测定作业指导书 1 含义及执行标准 1.1 含义 总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24小时内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 1.2 方法原理 多管发酵技术是以最可能数（most probable number ，简称MPN ）来表示试验结果的。它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN 表获得结果的。 1.3 水环境质量标准 表1-1 总大肠菌群地下水质量分类指标 （GB/T 14848-93） 表1-2 总大肠菌群生活饮用水卫生标准 （GB 5749-2006） 表1-3 总大肠菌群渔业水质标准 （GB 11607-89） 1.4 水污染物排放标准 表1-4 总大肠菌群船舶污染物排放标准 （GB 3552-83） 2 分析方法 2.1 方法名称、方法来源及适用范围
方法名称：多管发酵法 方法来源：《水和废水监测分析方法》(第四版)国家环保总局2002年第五篇第二 章五(一) 方法适用范围：此法适用于各种水样（包括底泥）的总大肠菌群测定。 2.2仪器 高压蒸汽灭菌器 电热干燥箱 恒温培养箱 显微镜 冰箱 采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压 蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。 2.3 标准菌株制备 将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。必须包 括大肠埃希氏菌和山夫登堡沙门氏菌两种对照。接种完后需记录：母种的来源，母种和工作 种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯 度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。 2.4 培养基 2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸馏水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 2.4.3 品红亚硫酸钠培养基：市售品红亚硫酸钠培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 2.4.4 伊红美蓝培养基：市售伊红美蓝培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 2.3.5培养基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中，当培养基颜色变化，或体积明 显变化时废弃不用。 2.5分析步骤 2.5.1 生活饮用水 ①初发酵实验：在二个装有已灭菌的50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的大试管中（内有倒 管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100ml；在10支装有已灭菌的5ml三倍浓缩乳糖 蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10ml，混匀后置于 37℃恒温箱培养24h。 ②平板分离：经初发酵试验培养24h后，发酵试管颜色变黄为产酸，小玻璃倒管内有气泡为
饮用水中大肠杆菌的检测方法
饮用水中大肠杆菌的检测方法 (一)水样的采集 供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4h，在0～4℃下保存不应超过24h ，如不能在4h 内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。 1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。 2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。 (二)初发酵试验 1.水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。 2.接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基(接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL，小心混匀放入37℃培养箱中培养24h 。此即5管法。 3.结果观察：37℃中培养24h后取出观察，观察有无气体(杜汉氏小管内有无气体)和酸产生(培养基有无变色)。在48h之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。 若所测定的15支管中均为阳性反应，说明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培养和观察。
饮用水大肠菌群检测方法
饮用水大肠菌群检测方法 大肠菌群是指在37℃培养24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革蓝氏阴性无芽孢杆菌的总称。主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。 水的大肠菌群数是指100 mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽孢杆菌等多种细菌。这些细菌都可以随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。 水中大肠菌群的检测方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可适用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要的时间较长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于堵塞滤孔的水样。 (一)水样的采集 供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4h，在0～4℃下保存不应超过24h ，如不能在4h 内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。 1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。 2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。 (二)初发酵试验 1.水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。 2.接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基(接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，
colitag大肠菌群和埃氏大肠杆菌快速检测方法.
检测过程 1. 取一包检测试剂，与 100 mL 被测液体混合； 2. 摇匀混合，充分溶解，若要定量则转移溶液至定量盘，在 35 摄氏度的环境下培养 22-26 小时。培养后的水样进行以下认定： A：如果水样呈黄色，说明有大肠菌群存在； B：如果用 366 nm UV灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在。 3. 如果检测粪大肠菌，则先在 35 度环境下培养 4 小时后，改成 44.5 度培养 20小时，进行以上第 3项观测。 A：如果水样呈黄色，说明有粪大肠菌存在； B：如果用 366 nm UV 灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在 第三方认可（1）美国 EPA认可：美国 EPA目前已经认可10种用于检测大肠菌群和埃氏大肠杆菌的方法，其中 Co litag 是美国 EPA 认可的检测数据最好的一种。 Colitag通过美国国家环保局严格的检测程序，结果表明：colitag检测大肠菌群和大肠杆菌的假阴性为0%，假阳性小于5%。这个结果首先是由美国国家环保局的生物学家以正式信函的形式通知CPI 公司。后来这一结果在2002年3月的《联邦登记》（Federal Register）上发表，具体请见67卷45期第10538页（Page 10538, Vol. 67 N O. 45）。同时，美国国家环保局对另一方法的检测报告显示，该
法检测大肠杆菌出现9%的假阴性，检测大肠菌群出现13%的假阳性，此结果发表于 1989 年 7 月 17 日的《联邦登记》（第 29998页，第二段，B部分第三行）和1992年6月10日的《联邦登记》（第 27475 页，第一列的第一整段）。（2）美国 Wisconsin 州卫生实验室验证：美国 Wisconsin 州卫生实验室通过大量不同实际样品对美国EPA认可的10种该类方法进行了检验，发现只有两种方法分析采样结果完全正确。Colitag是其中一种。
粪大肠菌群检测方法20110520
粪大肠菌群的测定（多管发酵法） 一、检测限 二、试剂(均为分析纯) 1、配制单倍乳糖蛋白胨培养液（1份量）(因有固体培养基，以下配置方法仅做参考) 单倍乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、碳酸钠10.6g。 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1mL）：称取溴甲酚紫1.6g倒入小烧杯，用少量95%乙醇溶解，移至100mL容量瓶，用95%乙醇多次洗小烧杯，洗液移入容量瓶，最后用95%乙醇定容至100mL，摇匀备用。（滤纸、100mL小烧杯2只、100mL容量瓶1只、95%乙醇、玻璃棒、药匙、天平、滴管、溴甲酚紫） 碳酸钠（10.6g）：称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水，并定容到100mL。（100mL容量瓶1个、100mL小烧杯2只、碳酸钠） 将单倍乳糖蛋白胨培养液成分蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4（用10%碳酸钠调节），再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管(10mL左右)中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用（冰箱中可存放3个月）。(>1L锥形瓶1只、1mL移液管1根、pH计、电炉、倒置的小玻璃管的试管60套（小试管(12x150mm ）+小套管（杜氏小管）（约6mm × 36mm )）、高压蒸汽灭菌器、试管架（10只入）、纱布和棉花) 2、三倍配制单倍乳糖蛋白胨培养液：制法同上，除蒸馏水外，其余配方比例三倍。 3、EC培养液（1份量） 将EC培养液所需成分胰胨20g、乳糖5g、胆盐三号1.5g、磷酸氢二钾（K2HPO4）4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g、氯化钠5g，加热溶解于1L烧杯中，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。用10%Na2CO3调节pH以防止培养基灭菌后pH上升0.2左右（确定值需要前期在实验室寻找规律）。再将分装试管置高压蒸汽灭菌器中，115℃灭菌20min。灭菌后pH应为6.9。（>1L烧杯1只） 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。 三、耗材和仪器 1、仪器：高压蒸汽灭菌器、生化培养箱（恒温箱）（25-44℃）、无菌操作台、天平 2耗材：倒置的小玻璃管的试管70套（小试管(12x150mm）+小套管（杜氏小管）（约6mm × 36mm )）；与小试管配套的棉塞或纱布和棉花；药匙、电炉、3mm接种环3根、吸耳球、牛皮纸、酒精灯1个、火柴、镊子2个、笔、试管架、滤纸（1盒）、、1mL及10mL移液管各2支 三、实验步骤 1、水样接种量 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管（平行）。 （如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1ml或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中） 2、初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管（含有玻璃倒管的试管）中（取原水样1mL，加如到9mL无菌生理盐水中混匀。这时候得到的稀释液1mL就相当与0.1mL，
食品中大肠菌群的测定附mpn检索表)
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表
注：+，表示阳性；—，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确
大肠菌检验方法(发酵法)验证方案
食（饮）具大肠菌群检验方法—发酵法 验证方案 1．验证目的和原理 1.1 验证目的 为确认本实验室所采用的方法适合于食（饮）具大肠菌群检验，特制定本方案验证GB 14934-94食（饮）具消毒卫生标准食（饮）具大肠菌群检验方法，发酵法能否准确检验出食（饮）具中的大肠菌群。 1.2 原理：通过试验来评价整个检验方法的准确性、有效性。 2．验证方法步骤 2.1验证前的准备：进行食具大肠菌群发酵法验证前，所有的仪器和试剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。 2.2验证试验的操作计划：做空白对照，以及阳性对照。 3．试验实施 3.1试验前的准备 3.1.1主要仪器设备：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。，冰箱：2 ℃～5 ℃，天平：感量 0.1 g，振荡器，无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头，无菌锥形瓶：容量 500 mL。，无菌培养皿：直径 90 mm， pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸，无菌滤纸。 3.1.2操作环境：环境洁净度不应低于10000级无菌室。 3.1.3试验样品：两套经消毒灭菌后的餐具，包含碗，盘，口杯，匙，筷子。3.1.4试剂： 0.9%无菌生理盐水 3.1.5验证用微生物名称及其编号 实验菌株的来源：中国工业微生物菌种保藏管理中心 3.1.7培养基
3.2验证试验操作 3.2.1样品制备 将大肠埃希菌菌苔用9mL生理盐水稀释至10-3，用无菌棉签蘸取稀释后的菌液，涂抹在餐具表面待用。 3.2.2验证方法 按照编制的作业指导书进行采样，检验。 检验程序见图1 图1
食品中大肠菌群的测定(附MPN检索表)
实验六食品中大肠菌群的测定 一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定
食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。 ①存在于肠道内持有的细菌，才能显示出指标的特异性。 ⑧在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出。 ⑧在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁殖。 ④检验方法简便，易于检出和计数。 在食品卫生微生物检验中，可作为粪便污染指标菌依据的上述条件，粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜的。 另外，作为粪便污染的指标细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等，据报道，拟杆菌是人体肠道内第二个较大的菌群；厌气性乳酸菌占人体肠道内细菌组分的50％以上，一般粪便中该菌量为109个／g —1010个／g。肠道内属于肠杆菌科的细菌，除上述的细菌外，还有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌和副大肠杆菌等，也可以充当粪便污染指标菌。很多研究者认为，在冷踪食品或冷冻状态照射处理过的食品中，大肠杆菌可比其他多种病原菌容易死亡，因此，像这类食品，用大肠菌群作为指标菌就不够理想，而底群链球菌对低温抵抗力强，作为这类食品的粪便污染指标菌就比较适宜。上述的这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，因均比不上大肠菌群所具备的指标特异性，所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌。 当然，大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处： ①饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。 ⑧大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。 ②在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。 3．大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义 粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。 许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主