淋巴细胞分型意义
淋巴细胞亚群分析临床意义
人体的免疫细胞包括T细胞和B细胞。T细胞管细胞免疫。CD4是辅助T细胞表面的一种标记。CD8是抑制性T细胞的一种标记。CD4/CD8增高，表示辅助性T细胞高于抑制性T细胞，说明免疫力好.CD3是所有总T细胞，CD3高表示总T细胞较高。CD4/CD8和CD3都高，是由于辅助性CD4细胞增高，因而总的T细胞也增高。是机体免疫力好的表现。
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析完整版
人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
淋巴细胞亚群(详细资料)
机体免疫状态是衡量机体是否患病的重要指标，目前多采用流式细胞术来监测机体的免疫状态，其中最重要的指标是检测T、B和NK淋巴细胞的水平。 T细胞主要包括T辅助细胞（Th）和T抑制细胞（Ts）细胞亚群。CD3+细胞代表外周血中总的成熟T细胞，理论上应约等于CD4+细胞和CD8+细胞的总和，但往往出现CD4+加CD8+细胞之和大于CD3+，这是因为CD4+细胞包括CD3+/CD4+细胞（真正Th细胞）和CD3-CD4+细胞（非Ts细胞），而后者包括CD3-CD8+CD16+56+细胞（一部分NK细胞）和CD3-CD8+CD16+56-（未知细胞）。由此可见，真正的TH细胞是CD3+CD4+细胞，真正Ts细胞是CD3+CD8+细胞。尤其当患者NK细胞明显增加时，会使CD4细胞和CD8细胞的总和远大于CD3+细胞，因此，用三色荧光标记才能分析真正的辅助性T细胞和抑制性T细胞。 首先在淋巴细胞中识别出CD3细胞，然后在CD3细胞中再区分CD4+和CD8+细胞。NK细胞的表面无T细胞和B细胞表面标志，但有CD16和CD56等标志，用CD16+56抗体能鉴定出NK细胞（一定是CD3阴性），CD3-CD16+56+细胞才是真正的NK细胞。根据是否表达CD8，又可将NK细胞分为CD3-CD8+CD16+56+细胞（所占比例小，不影响CD8比例）和CD3-CD8-CD16+56+细胞（主要成分）。 B细胞的表面标志是CD19，理论上CD3-CD19+细胞才是真正的B淋巴细胞。但 CD3+CD19+细胞很少，可忽略不计，所以CD19+细胞就是B淋巴细胞。 在抗肿瘤效应中，CD4和CD8分别是T淋巴细胞的辅助／诱导细胞亚群与抑制/细胞毒细胞亚群，CD4细胞的主要功能是通过其分泌的淋巴因子，增强和扩大免疫应答过程，辅助诱导其它免疫细胞如杀伤性T细胞，B细胞等共同发挥抗肿瘤作用，CD4细胞的减少，导致免疫功能低下。CD4/CD8比值是重要的免疫状态监测指标，其比例的降低与免疫系统损害的程度相关。 CD4降低见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂者；CD8降低见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病；CD4/CD8比值升高见于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应、病毒感染等；CD4/CD8比值降低见于艾滋病(常小于0.5)。监测器官移植排斥反应时，CD4/CD8比值升高预示可能发生排斥反应。
CD和CDT淋巴细胞检测
C D和C D T淋巴细胞 检测 集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]
CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测?? ? 1? 范围 本章规定了用多平台三级程序法和单平台一步法检测全血中的CD4+ 和 CD8+ T淋巴细胞。 ? 2?? 规范性引用文件 1997 Revised Guidelines for Performing CD4+ T-Cell Determinations in Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV) MMWR 46(RR-2);1-29 Publication date: 01/10/1997。 ? 3? 实验室条件 3.1 人员 进行HIV感染者CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训。 3.2? 设施和设备 3.2.1? 样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转振荡器、精确移液器（5μl~50μl、20μl~200μl、200μl~1000μl）。 3.2.2? 流式细胞仪检测区：流式细胞仪 3.3? 功能分区 实验室原则上应分为样品处理区和流式细胞仪检测区,各区的功能是： 3.3.1? 样品处理区应达到生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。 3.3.2? 流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。
? 4? 样品采集、运输和接收 4.1? 样品的采集 4.1.1? 选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。 4.1.1.1? 用于血液学检测的抗凝剂 （1） EDTA（1.5±0.15mg/ml血液）。 （2）在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。 4.1.1.2? 用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂 （1）用K3EDTA抗凝，收集样品应在30h以内，尽早（8h以内）处理。 （2）用ACD或肝素抗凝，收集样品在48h以内，尽早（8h以内）处理。 4.1.2? 静脉采血收集血样，将血液注入一个事先加入适当抗凝剂的试管（用真空试管）。 4.1.2.1? 当收集儿童样品时，采用儿童用注射器、小试管。 4.1.2.2? 采血后立即握住试管两端，颠倒混匀数次，将血液与抗凝剂混匀，以防止凝固。 4.1.3? 准备适当数量的样品管 4.1.3.1? 当同一样品的血球检测和流式细胞仪免疫表型检测在不同实验室内进行时，用2个装有K3EDTA的试管即可。 4.1.3.2? 在所有其它条件下用2个试管（用K3EDTA作血球检测，用K3 EDTA、ACD或肝素作流式细胞仪免疫表型检测）。 4.1.4 ?对所有样品编号，并写明日期和收集时间。 4.2? 样品运输
淋巴细胞培养
淋巴细胞培养 一、严格无菌操作 对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作。无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。 二、培养器皿的选择 淋巴细胞培养既可选择培养板(24 、48 、96 孔) 、培养瓶,也可选择三角烧瓶、试管等器皿进行培养。有研究表明提取的淋巴细胞用1. 5ml 离心管培养72 小时,细胞生长状况良好,细胞数与培养前比较,差异无统计学意义( P >0. 05) 。用青霉素小瓶进行培养,淋巴细胞生长也非常好。可以认为,对散在的细胞培养来说,用小器皿具有以下优点: (1) 便于操作:1. 5ml 离心管为一次性使用,青霉素小瓶可反复刷洗,而培养板、培养瓶价格偏贵且用过几次之后,便有些模糊不清,尤其是塑料的。更为重要的是,淋巴细胞培养为悬浮培养,在培养过程中需要不断晃动,而大多数实验室没有恒温摇床。我们发现,在培养过程中每隔6～8小时晃动一次培养器皿,便可解决这个问题。青霉素小瓶、1. 5ml 离心管晃动起来相对容易些。(2) 减少污染:因为淋巴细胞培养的液体量较少,一般为100～200μl , 故文献资料中多见用培养板( 48 、96孔) ,少见用培养瓶。对分散的淋巴细胞培养,一方面一次用不了那么多孔,另一方面一旦一孔有污染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培养也失败。而且,晃动培养板时,很容易使液体溅到培养板盖上,增加污染的机会。而使用青霉素小瓶、1. 5ml 离心管等小器皿便可避免这些现象,但缺点是不易观察细胞生长,需取样加到载玻片上观察。 三、血清的选择 淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。血清浓度在5 %～20 %时细胞生长比较好,当超过30 %时反而不利于细胞生长。 四、pH 值 细胞生长的最适pH 为7. 0～7. 2 ,可忍耐的pH 范围为6. 6～7. 8 ,当pH 低于6. 8 或大于7. 6 时, 都会抑制细胞生长。RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般升高0. 2～0.4 ,故配1640 培养液及其他用液时使pH 值达到7. 2比较合适,并且需经常检测pH 值。 五、培养空间 培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好维持在2～5mm 的范围,以便于气体交换。 六、恒温培养箱 温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。 七、常见失败原因
淋巴细胞亚群分析与临床---陈建林
一、流式淋巴细胞亚群检测的临床意义 1.了解不同情况下机体免疫功能状态 肿瘤（手术、放化疗患者的免疫功能检测） 感染（脓毒血症、重症监护患者等） 自身免疫病、免疫缺陷病等 不孕不育 某些血液系统疾病 其他：慢性肾病、骨髓移植恢复期等 2.辅助临床疾病的诊断 3.探索疾病的发病机理、病程及预后 4.观察监测疗效，指导临床建立治疗方案 二、淋巴细胞的分类及功能 B细胞(CD19+)：体液免疫 辅助/诱导T细胞(Th):介导和增强免疫应答 (CD4+) 淋巴细胞T细胞(CD3+）细胞毒性(Tc) /抑制性T细胞(Ts): 抗病毒、抗肿瘤 (CD8+) 调节性T 细胞(Treg):抑制免疫应答、维持免疫耐受 (CD4+CD25+) NK细胞：抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节 (CD16+/CD56+) 三、流式淋巴细胞亚群检测的临床应用 淋巴细胞亚群检测与儿科疾病 （一）评估机体免疫功能状态 多种小儿疾病原发或继发疾病均存在T细胞异常，观察T细胞变化，对小儿疾病病因、发病机制以及协助临床诊断与治疗等具有重要价值。 类型指标CD3+ CD4+CD8+CD4+/CD8+细菌性肺炎↓↓↓↓↑↓↓ 支原体肺炎↓↓↓↓↓↓↓↓ 病毒性肺炎↓↓↓↓↓↓↓↓ 传单增多症↑↑↓↓↑↑↓↓ 支气管哮喘↑↓↑
T 细胞CD4、CD8、CD3 检测介入时间-----结合退热、消咳、肺罗音消失时间观察T 细胞变化，特别针对儿科患者可合理调节抗生素使用，改善预后，避免药物损伤. （二）原发性免疫缺陷病的早期识别和干预 1.流式细胞仪分析T细胞亚群(包括CD3+、CD4+和CD8+)、B细胞(CD19+) 和NK细 胞(CD16+/CD56+)比例等主要检查项目,可对大多数原发性免疫缺陷病患儿作出诊断。 2.评估免疫接种前机体免疫状态 案例：T/B细胞联合免疫缺陷患 儿，未评价免疫系统功能，直接 接种灭活疫苗，造成严重感染T 细胞CD4、CD8、CD3 检测介入时间-----结合患儿科反复感染的临床症状及时检测； 在疫苗接种前2-3天作出评估。 淋巴细胞亚群检测在肿瘤临床的应用 恶性肿瘤的发生、发展、转移与人体免疫功能下降密切相关。人体的抗肿瘤免疫以细胞 免疫为主，体内发挥抗肿瘤免疫作用主要由CD4和CD8细胞完成。 （一）评价肿瘤患者的整体免疫功能 1．肿瘤患者处免疫抑制状态，T淋巴细胞降低。 2．肿瘤患者T淋巴细胞与病程相关，随病程逐渐降低。 CD3、CD4、CD4/CD8细胞数下降程度：Ⅳ期> Ⅲ期> Ⅱ期>Ⅰ期3．肿瘤患者T淋巴细胞持续低下，转移率高、易复发
外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备实验教学方法
107 第 30 卷第 1 期2012 年 2 月广东医学院学报 JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE V ol. 30 No. 1Feb. 2012 实验教学是高校教学的重要组成部分，在培养了使学生更好地了解和掌握消毒灭菌知识和技能，学生分析和解决问题能力、培养严密的思维方法和通过在PPT 上讲解后，再由带教老师用实物进行操踏实肯干的工作作风等方面具有不可替代的作用。作演示。这个过程加强了学生的无菌操作意识，树要使实验室成为推行素质教育、培养学生创新精神立学生的无菌概念。 和实验能力的主要阵地，必须突破传统的教学观念 1.2 通过实际操作，培养学生动手实践的兴趣，确和教学模式，探讨不同层次、具有特色的、多样化立严格的无菌操作观念 的实验教学方法。《医学遗传学》是高等医学院校在经过适当改装后的实验室里，带教老师向学的一门必修课，外周血淋巴细胞培养和染色体制备生讲解细胞培养基的配制方法及要求后，由学生自是这门课程的重要实验教学项目之一，是综合性实己操作。配制培养基是实验的重要环节之一，要求验项目。该实验包括灭菌技术、培养基配制、采血在无菌条件下操作。以往因为实验室条件所限，必接种、细胞培养、收集细胞制备标本、Ｇ显带处理 须用预先在无菌实验室里配制好的培养基给学生做[1-2] 和镜下观察分析等内容，实验过程繁琐，耗时实验，如果使用市售的培养基则成本费用高，并且长。根据目前学生人数多以及本实验的特点，我们学生都没有动手的机会。由于配制培养基是一项细进行了以下教学方法的探索和改进：微且繁琐的实验过程，一旦失败则后面的实验无法进行，要求带教老师把每一个细小的环节都仔细向1 多种实验手段结合，使繁琐的实验简单化学生交代清楚，包括一些操作的动作要领和容易出现的问题。有些学生会忘记按无菌操作要求用酒精1.1 运用现代教学手段，了解实验中使用器械、物灯高温消毒试管口和玻璃器皿，或者忘记消毒玻璃品的清洗消毒灭菌程序 安培，教师要预先强调并密切观察学生的操作，及由于学生初次接触本实验使用的仪器设备和试时纠正其错误，避免培养基被污染。学生们通过自剂，例如CO 培养箱、抽滤器、培养基(所需的药品2己动手配制培养基，了解了细胞培养的实验过程，及试剂)和秋水仙素、离心机、显微镜及玻璃器皿认识了每个操作环节的重要性，培养了高度的责任等，感到非常的陌生，因此我们应用多媒体教学手心和严谨的科学态度。 段介绍它们的作用、原理和正确的使用方法，让学 1.3 开放实验室，使每个学生参与整个实验过程，生容易理解和掌握。 激发其学习兴趣 外周血淋巴细胞培养是在体外条件下的细胞培在完成了以上实验课后，根据实验要求分2次安养技术，整个过程必须在严格无菌条件下进行，对排学生回实验室完成以下2个实验步骤。(1) 采血接实验所需的器皿(如烧杯、量筒、培养瓶、抽滤器、种及培养：在老师的指导下，由学生自己互相采静胶塞等)的消毒灭菌是进行细胞培养最重要及最基本脉血，注入配制好的培养液内进行培养。让学生互的条件，这个过程包括洗、煮、烤、高压灭菌。为 相采血进行实验，学生会更加关心实验的结果，更认真地进行后面阶段的实验，激发他们对这个实验的兴趣。(2) 在收获细胞前4 h ，尚要进行一个很关 摘 要：由于外周血淋巴细胞培养和染色体制备这一实验教学课程耗时长，步骤繁琐，要求学生完成全部实验过程并达到较好的教学效果操作起来不容易。经过多年的摸索，我们将普通实验室加以改造，采用集中采血、分批分阶段进行实验的方法开展实验教学，结果绝大多数学生均能顺利完成该实验，达到预期的教学效果。 关键词：细胞培养；染色体；实验教学 中图分类号：G 624.4 文献标识码：B 文章编号：1005-4057(2012)01-0107-02DOI: 10.3969/j.issn.1005-4057.2012.01.044 外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备实验教学方法的探索 廖 霞，陈小萍，周汝滨 （广东医学院生物学教研室，广东湛江 524023） 收稿日期：2011-11-12；修订日期：2012-01-30作者简介：廖 霞(1959－)，女，大专，实验师。
实验七+人体外周血淋巴细胞培养
实验五人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。
淋巴细胞亚群检测方案
目和相对比例都在一定的范围内。那么临床常见的淋巴细胞亚群包括哪些项 目？ 一、淋巴细胞亚群 二、抗体组合方案
联合CD45的三色方案主要是有四种不同的试剂。 1.CD45/CD3/CD4 这个抗体组合主要用来检测T3细胞和T4细胞。 2.CD45/CD3/CD8 用来检测T3细胞和T8细胞。 3.CD45/CD3/CD19 用来检测T3细胞和B细胞。 4.CD45/CD3/CD16和/或CD56 用来检测T3细胞和NK细胞。 （三）双色方案 如果实验室在边远的地区，条件不足，只能做双色方案，但是在双色方案中建议要把CD3加进来，因为CD45能很好地将白细胞和其他的干扰细胞，尤其是红细胞进行区分。如果不能用CD45，最好能用到 CD3，CD3可以特异的标记T淋巴细胞，T淋巴细胞和CD4做双标可以克服单一的CD4抗体。为此，双色方案中也分为四管，每管当中建议都包含有CD3。 1.CD3/CD4 用来检测T3细胞和T4细胞。 2.CD3/CD8 用来检测T3细胞和T8细胞。 3.CD3/CD19 用来检测T3细胞和B细胞。 4.CD3/CD16和/或CD56 用来检测T3细胞和NK细胞。 尽管检测条件不允许做四色或三色的分析，但也至少要用CD3和其他的直标抗体进行双免疫荧光染色方案，不建议采用单色方案进行淋巴细胞亚群分析。 （四）7-氨基放线菌素D(7-AAD)联合CD45方案 1．目的 对于超过24小时的标本或肉眼观察发现已经变质的标本，需使用7-氨基放线菌素D（7-AAD）结合 CD45（评估淋巴细胞、单核细胞和粒细胞死亡）复染评估细胞活力。 2.判定 7-AAD荧光染料主要染活细胞，主要用来鉴定细胞活性。 （1）7-AAD阴性者是活细胞群。
淋巴细胞亚群检测的临床意义
淋巴细胞亚群与临床 人体外周血的淋巴细胞是机体重要的免疫细胞，主要包括三种：T淋巴细胞（TC）、B淋巴细胞（BC）、自然杀伤细胞（NK）。TC主要表达CD3+，约占正常人外周血淋巴细胞总数的60--80%；BC主要表达CD19+，约占正常人外周血淋巴细胞总数的15--20%；自然杀伤细胞（NK）主要表达CD3--CD16+CD56+，约占正常人外周血淋巴细胞总数的10--20%。 通过T淋巴细胞亚群的监测可以了解在不同疾病状态下患者的细胞免疫功能状态，已经广泛在肿瘤、自体免疫、感染性疾病中, 辅助临床诊断、帮助了解发病机理、判断预后和指导临床治疗。T淋巴细胞亚群检测的内容为总T细胞（CD3+）及其亚群（辅助性T淋巴细胞，CD4+；抑制性或细胞毒T淋巴细胞，CD8+）的数量和比例。 在某些自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、自体免疫性溶血性贫血患者中CD3+/CD4+细胞的比值升高。在病毒感染（上感，AIDS等）、恶性肿瘤、再生障碍性贫血等疾病中，患者CD4+/CD8+比值降低，三种淋巴细胞的数量和比例均可能有相应的改变。T细胞亚群已被用来监测器官移植病人的免疫状态，协助发现和使其避免受到GVHD的攻击。由于在感染性、肿瘤性疾病、自体免疫性疾病和器官移植中患者的免疫功能和预后之间有着密切的关系，对其给予密切注意并及时采取适当措施、调节患者的免疫状态以改善预后就成为现代医学的一个重要内容。 常见疾病T淋巴细胞的改变（参考） 疾病 T细胞亚群 CD4+/CD8+ CD4+（辅助T） CD8+（抑制T） 类风关↑（活动期）↑↑ SLE --或↓（活动期）↑↓↑ 胰岛素依赖性糖尿病↑ 多发性硬化症↓↓↑ 乙型肝炎↑ 自身免疫溶血性贫血↑↑ 上呼吸道感染↓↓↓ 结核↓ AIDS ↓↓↑ CD4+/CD8+ CD3+ （总T） CD4+（辅助T） CD8+（抑制T）恶性肿瘤（白血病）↓↓↓↓↑↑↑↑ 再障及粒细胞减少症↓↑↓ CMV感染↓↑↓ 血小板减少↓↓↓↓↓↓ CD19为全部B细胞共有的表面标志，增高见于B细胞系统的恶性肿瘤，减低见于体液免疫缺陷病。BC主要介导抗感染等体液免疫，故不作为肿瘤患者的检测指标。 NK细胞主要表达CD3--CD16+CD56+ ，约占淋巴细胞的10--15%左右。NK细胞能非特异性杀伤肿瘤细胞，是机体第一道肿瘤防线，其杀伤活性可被IL-2等细胞因子诱导而显著增强。 通常在肿瘤患者外周血中， CD3+、CD4+、NK细胞减少，而CD8+细胞增加，CD4+/ CD8+的比值降低，。说明肿瘤病人的细胞免疫功能处于免疫抑制状态，识别和杀伤突变细胞的能力下降，形成了肿瘤的生长与转移。因此，淋巴细胞亚群的检测对了解肿瘤发病机制、了解某些药物或治疗方法对机体免疫功能的影响，了解患者自身免疫功能状态的变化，指导临床治疗和科研应用等，都有着极其重要的理论意义和应用意义。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
实验方案 实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其 识别。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。 在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。 正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 表1 人染色体组型及其特征
免疫功能淋巴细胞亚群检测的临床意义
免疫功能（淋巴细胞亚群）检测的临床意义外周血淋巴细胞根据生物学功能和细胞表面抗原表达分为3个群：T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）和NK淋巴细胞【自然杀伤细胞（natural killer)，CD3-CD16+和/或CD56+】。T细胞又分为辅助T细胞（CD3+CD4+）和抑制T细胞（CD3+CD8+)。淋巴细胞亚群分析是检测细胞免疫和体液免疫功能的重要指标，它总体反应机体当前的免疫免疫功能、状态和平衡水平，并可以辅助诊断某些疾病，如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等，分析发病机制，观察疗效及检测预后有重要意义。T淋巴细胞百分率或计数绝对值可用于区别和监测某些免疫缺陷病 和自身免疫性疾病。辅助T淋巴细胞减少：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制患者。抑制T淋巴细胞增多：见于自身免疫性疾病，如SLE、艾滋病初期、慢性活动性肝炎、肿瘤及病毒感染等。抑制T细胞百分率在一些免疫性疾病表现出超出正常参考范围，在许多先天性或获得性免疫缺陷病人中升高（如重症综合性免疫缺陷SCID,AIDS）。 CD4+/CD8+>2.5 表明细胞免疫功能处于“过度活跃”状态，容易出现自身免疫反应，见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等。CD4+/CD8+ 在肿瘤病人外周血中T淋巴细胞亚群数值都有异常，其特征是患者体内CD3+细胞、CD4+细胞明显减少，而CD8+细胞明显增加，CD4+/CD8+比值显著降低，说明肿瘤患者的细胞免疫功能处于免疫抑制状态，患者对识别和杀伤突变细胞的能力下降，形成了肿瘤的生长转移。骨髓造血
细胞的增殖和分化障碍也与T细胞亚群异常有关。如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中，患者的外周血CD4+细胞数减少，CD8+细胞数增多，CD4+/CD8+比值明显下降。 NK细胞介导某些肿瘤和病毒感染细胞的细胞毒性反应。 B淋巴细胞为体液免疫的重要指标。
项目十八 B淋巴细胞功能检测
项目十八B淋巴细胞功能检测 一、溶血空斑试验 (Plaque forming cell assay) 【实验原理】 将SRBC免疫动物，隔一定时间取其脾脏制成细胞悬液，当与SRBC混合孵育时，其中抗体形成细胞释放的抗体会与周围SRBC特异性结合，在补体作用下，使这些致敏的SRBC 溶解，从而在琼脂凝胶中的每个抗体形成细胞周围形成一个肉眼可见的溶血空斑。测定与补体结合力强的IgM形成细胞采用直接方法；测定与补体结合力弱的IgG或IgA形成细胞采用间接法，即实验中需加入抗免疫动物Ig的抗体(二抗)，才能促进溶血空斑形成。 此处只介绍小鼠琼脂直接溶血空斑技术。 【试剂和器材】 1．小白鼠体重18~22 g。 2．补体豚鼠混合新鲜血清。 3．SRBC悬液用Gey液将SRBC洗3次，分别配成2.5×108个细胞/ml和5×108个细胞/ml浓度的红细胞悬液。 4．Gey液、琼脂糖。 5．注射器、剪刀、镊子、不锈钢网、小平皿、试管、吸管、显微镜、温箱、水浴箱。 【步骤和方法】 1．免疫小鼠取1ml 2.5×108个细胞/ml 浓度的SRBC悬液注入小鼠腹腔，或取0.2 ml SRBC悬液经小鼠尾静脉注入。 2．制备脾细胞悬液将免疫4天后的小鼠处死，取脾脏制备细胞悬液(制备方法见动物组织中免疫细胞收集)，用Gey液配成1×107个细胞/ml的细胞悬液(每只小鼠约加6~10ml Gey 液)。 3．制备底层琼脂将14g/L琼脂糖(用Gey液配制)溶化后取2~3ml倾注于水平的小平皿内，凝固后去盖反扣于37℃温箱中预温备用。 4．制备顶层琼脂将5g/L琼脂糖(用Gey液配制)溶化，置48℃水浴中平衡备用。取脾细胞悬液和5×108个细胞/ml SRBC悬液各0.1ml，再加入未稀释补体0.05ml，混匀，置48℃水浴平衡片刻。加入0.8ml已平衡好的琼脂糖，混匀后倒入底层琼脂上，旋转平皿使之均匀平铺，凝固后置37℃温育3h。计数溶血空斑形成细胞(PFC)。 【结果判定】 1．将平皿置低倍显微镜下观察计数。溶血空斑中心有淋巴细胞，周围为透明区。 2．全脾中PFC数计算： 每个平皿PFC数×10×脾细胞悬液体积(ml) 或以每百万脾细胞所含PFC数来表示。 【注意事项】 1．试验选用Gey液为洗涤液和培养液，优于Hanks液、Eagle液和Dullecco液，但工作液需现用现配。 2．最好选用近交系小鼠，且鼠龄和体重应基本一致。 3．制备脾细胞过程所用Gey液应预先4℃预冷，制好的细胞悬液应及时放4℃备用，以保持脾细胞活力。 4．制备顶层琼脂时，温度应控制在45～48℃之间，温度太高细胞会失活，过低会使琼脂凝固，细胞不能分散，无法倒入平皿。各细胞成分要充分混匀，同时避免出现气泡；与琼
淋巴细胞亚群研究分析与临床---陈建林
淋巴细胞亚群分析与临床---陈建林
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、流式淋巴细胞亚群检测的临床意义 1.了解不同情况下机体免疫功能状态 肿瘤(手术、放化疗患者的免疫功能检测) 感染(脓毒血症、重症监护患者等) 自身免疫病、免疫缺陷病等 不孕不育 某些血液系统疾病 其他：慢性肾病、骨髓移植恢复期等 2.辅助临床疾病的诊断 3.探索疾病的发病机理、病程及预后 4.观察监测疗效，指导临床建立治疗方案 、淋巴细胞的分类及功能 B细胞(CD19+): 体液免疫 辅助/诱导T细胞(Th):介导和增强免疫应答 (CD4+) 细胞毒性(Tc) /抑制性T细胞(Ts):抗病毒、抗肿瘤淋巴细胞T 细胞(CD3+) (CD8+) 、调节性T细胞(Treg):抑制免疫应答、维持免疫耐受 V (CD4+CD25+) NK细胞：抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节 (CD16+/CD56+) 三、流式淋巴细胞亚群检测的临床应用 淋巴细胞亚群检测与儿科疾病 (一)评估机体免疫功能状态 多种小儿疾病原发或继发疾病均存在T细胞异常，观察T细胞变化，对小儿疾病病因、 发病机制以及协助临床诊断与治疗等具有重要价值。 类型指标CD3+CD4 +CD8+CD 4+ /CD 8+ 细菌性肺炎T JJ 支原体肺炎JJ 病毒性肺炎JJ 传单增多症TT JJ
细胞变化，特别针对儿科患者可合理调节抗生素使用，改善预后，避免药物损伤 （二）原发性免疫缺陷病的早期识别和干预 1.流式细胞仪分析 T 细胞亚群（包括CD3+、CD4+和CD8+）、B 细胞（CD19+）和NK 细 在疫苗接种前2-3天作出评估。 淋巴细胞亚群检测在肿瘤临床的应用 恶性肿瘤的发生、发展、转移与人体免疫功能下降密切相关。人体的抗肿瘤免疫以细胞 2 .肿瘤患者T 淋巴细胞与病程相关，随病程逐渐降低。 3 .肿瘤患者T 淋巴细胞持续低下，转移率高、易复发 T 细胞 CD4、CD8、CD3检测介入时间 结合退热、消咳、肺罗音消失时间观察 胞（CD16+/CD56+） 比例等主要检查项目 ，可对大多数原发性免疫缺陷病患儿作出诊断。 ■A CI ' ■ ■ Pe ■上珂.；弓* 直胞 直接 免疫为主，体内发挥抗肿瘤免疫作用主要由 CD4和CD8细胞完成。 琳旦细胞亚群分析 利1?屮|?耳1 I MK 血 CO3 , CD56 + 如施如雎[T a 1 co3+cr?a+ 调书?tt.T 细 Jl6.(TrGA) [SD4fC 口 35+CQ1.2 丁 lcw/\ 恤^^抑删，比如 普怦 IW ■痫 CP 切cos A 1.5 = （一）评价肿瘤患者的整体免疫功能 1 .肿瘤患者处免疫抑制状态, T 淋巴细胞降低。 CD4 CD3、CD4、CD4/CD8细胞数下降程度: 川期＞ n 期＞ I 期 Ft- 儿卜"価《种心?? 和 MiM 曝 mH 结合患儿科反复感染的I 临床） T 细胞 CD4、CD8、CD3 检测介入时间 2.评估免疫接种前机体免疫状态 i￥f -* . r PM - i TM 轧 9M - *.* ' ■ # K ：寸詁■贮 t ? rgp, 畔 h- ■. WT 赳：' "■ HuEWJ*， h 亡*七 '■■ ■■匕 _、. T 卡斗得—忙 U ?: hE i 瞬邑细J9包 吕性?■MT X T 如胞 CDSXU. /* * ** A 可《 4, J*.- B 加曲 CO 19. CD2O
淋巴细胞
1.掌握T、B淋巴细胞的主要膜表面分子和作用。 T细胞的膜表面分子及其功能T细胞表面具有许多重要的膜分子, 参与识别抗原 和T 细胞的活化、增殖、分化及功能的发挥并且是T细胞亚群的重要标志。 T细胞表面标志： （一）T细胞表面受体 1.T细胞抗原识别受体--TCR及TCR复合体 所有T细胞表面均具有能结合特异性抗原的膜分子，称T细胞抗原受体（TCR）。TCR功能：是识别和结合抗原肽的作用。 CD3分子：由γ、δ、ε、ζ、η五种肽链组成。 CD3分子的功能：稳定TCR的结构，传递T细胞活化信号。 TCR识别抗原后，刺激信号是通过CD3转导的。 2. 细胞因子受体（cytokine receptor，CKR） CK:主要指由细胞经刺激诱导而合成和分泌的具有高活性多功能的小分子蛋白质。. 白细胞介素(interleukin, IL) . 干扰素(Interferon, IFN) . 集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) . 肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF) . 生长因子(Growth factor, GF) . 趋化因子(chemokine, cK) 静止T细胞——>活化T细胞——>T细胞增殖、分化 3 .病毒受体 CD4分子是HIV的受体，HIV的gp120与CD4分子高亲和性结合。CD4+的T细胞是HIV 攻击的主要靶细胞 4. 丝裂原受体 可致细胞发生有丝分裂，进而增殖得名,可激活某一类淋巴细胞-------非特异性多克隆激活剂 ConA：刀豆素A PHA：植物血凝素 PWM：美洲商陆 丝裂原与受体交联，可直接使静止T细胞活化、增殖、转化为淋巴母细胞 （二）T细胞表面抗原（surface antigen） 1.MHC抗原：MHC-I（所有），活化后表达ＭＨＣ－Ⅱ（活化标志） 2.分化抗原（ＣＤ分子） （１）辅助分子——CD4和CD8分子 （２）协同（辅助）信号分子——CD28、CD152、CD40L、LFA-1、CD2 T细胞表面CD抗原: T细胞的膜辅助受体-CD4/CD8 功能：辅助TCR识别抗原和参与活化信号转导 CD4+/CD8+T能过表面的TCR-CD3复合体分子与APC表面相应抗原肽-MHC分子复合 物结合，CD4/CD8分子可与MHC分子紧密结合，使T细胞与APC的作用加强，并使胞内区的ITAM和蛋白酪氨酸激酶P56LCK活化，从而产生T细胞活化的第一信号，引发一系列激酶级联反应。 一、B细胞的膜表面分子
人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养 摘要：正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。[1] 关键词：外周血淋巴细胞低渗处理空气干燥法染色体组型分析 前言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便。 1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。 淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。[3] 淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。[2]染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。 1.材料方法 1.1 材料 人的外周血淋巴细胞。 1.2 器具 采血针、20mL培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪
CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测
CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测 1 范围 本章规定了用多平台三级程序法和单平台一步法检测全血中的CD4+ 和 CD8+ T淋巴细胞。 2 规范性引用文件 1997 Revised Guidelines for Performing CD4+ T-Cell Determinations in Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV) MMWR 46(RR-2);1-29 Publication date: 01/10/1997。 3 实验室条件 3.1 人员 进行HIV感染者CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训。 3.2 设施和设备 3.2.1 样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转振荡器、精确移液器（5μl~50μl、20μl~200μl、200μl~1000μl）。 3.2.2 流式细胞仪检测区：流式细胞仪 3.3 功能分区 实验室原则上应分为样品处理区和流式细胞仪检测区,各区的功能是： 3.3.1 样品处理区应达到生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。 3.3.2 流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。 4 样品采集、运输和接收
4.1 样品的采集 4.1.1 选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。 4.1.1.1 用于血液学检测的抗凝剂 （1）EDTA（1.5±0.15mg/ml血液）。 （2）在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。 4.1.1.2 用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂 （1）用K3EDTA抗凝，收集样品应在30h以内，尽早（8h以内）处理。 （2）用ACD或肝素抗凝，收集样品在48h以内，尽早（8h以内）处理。 4.1.2 静脉采血收集血样，将血液注入一个事先加入适当抗凝剂的试管（用真空试管）。 4.1.2.1 当收集儿童样品时，采用儿童用注射器、小试管。 4.1.2.2 采血后立即握住试管两端，颠倒混匀数次，将血液与抗凝剂混匀，以防止凝固。 4.1.3 准备适当数量的样品管 4.1.3.1 当同一样品的血球检测和流式细胞仪免疫表型检测在不同实验室内进行时，用2个装有K3EDTA的试管即可。 4.1.3.2 在所有其它条件下用2个试管（用K3EDTA作血球检测，用K3 EDTA、ACD或肝素作流式细胞仪免疫表型检测）。 4.1.4 对所有样品编号，并写明日期和收集时间。 4.2 样品运输 4.2.1 在室温下（18~23℃）保存和运输样品，避免极端温度（冷冻或过热）。超过37℃的温度会破坏细胞，对血液学和流式细胞仪的检测有影响。天气热时，需要用一个隔热的容器装样品，并且把这个容器放于另一个有冰袋和吸热物质的容器中。这种方法有助样品的保存。 4.2.2 尽可能快地将样品送至免疫表型检测实验室。