分析方法的确认

2.对已确认方法的验收（V erification for previously validated methods）

对于像ASTM,US EPA,ISO和IP这些已通过合作研究(collaborative studies)进行确认的方法，且能够适用于方法所要求的范围之内，对于这类的方法则不需要向内部方法（in-house method）那样的严格验证，同样适用于出版的带有实验数据的科学文献。鉴于此，对于使用这些方法的实验室，大体上能够验证（verify）操作者按照方法中要求操作且能够获得相同的结果即可。方法的验收（verification of method）必须包括对现有已验证方法使用前所进行统计纠正(statistical correlation)。

但需要注意的是，由于不同标准机构或公认的技术组织对于方法标准的文件化（documentation）差异，如果组织在所发布的方法中没有验证报告或缺乏部分性能(performance characteristics)或仅对部分性能确认（verify），则实验室不能够直接使用方法，需要确认。

在使用条件下的方法验收不仅仅是要验收体系符合于方法的要求，同样也验收了方法准确度、精确度或其它参数的符合性。常用以下方式证明方法性能（method performance）：

l 空白，评定污染

l 实验控制样品（e.g.化学分析加标），评定准确性

l 重复测定，评定精确度

l 定量的、批次的分析，需要定期验证校准曲线标准溶液

l 监控质量控制样品，常通过使用控制表（SPC）

l 参与能力验证，这些组织可提供与方法要求一致的样品，具有选择代表性的浓度值、基体、分析参数等。

如对原内部方法（in-house method）做了微小的改变（换成不同生产商生产的色谱柱，选择不同的生长基质等），则也需要对方法做验收。

验收程序中关键参数依赖于方法的性质和所可能遇到样品的类型。足够用于统计分析数量的样品，样品浓度类型需要涵盖所要评定/测定结果范围之内。对于定量分析，至少评定方法偏差和测量精密度，痕量分析则需要考虑方法检出限LOD和LOQ，以确定满足需求。定性方法，对现有已确认方法或与已经结果对比进行纠正研究（correlation studies）是需要的。如果一个机构要对标准方法进行重大的修改，则需要全面的验证。当然，难以确定哪些因素的改变会导致重大的变化，除非标准中有说明哪些修改会影响测试结果。但是一般以下几种情形，可视作为重大改变，如使用不同的溶剂、使用HPLC代替GLC、不同的介质、影响繁殖的关键温度或时间。

如果客户需要比已确认的标准更加详细的说明，则需要附加的确认。

3. 方法确认和确认参数

非标准方法和内部开发方法需要方法确认。方法性能基于方法的有意使用（intended use）。如果一个方法用于定性分析，那么就不需要对在设备整个动态范围内确认方法的线性。

在进行验证之前应对方法范围和确认准则进行界定和文件化。这些包括但不局限于以下问题：

a) 测量目的（要鉴定什么和为什么要鉴定）？

b) 样品的基体可能是什么？

c) 是否有干扰存在，如有，这些干扰物质需要测试吗？

d) 测量范围多少（期望测试浓度含量范围）？

e) 是否特别法律或法规要求？

f) 是否要对仪器设备和环境条件特别考虑吗？

g) 使用什么类型的设备？方法是否需要特定的仪器或是否其它同类型的仪器也能够用？

h) 是否有样品制备、抽样、处理程序和包括使用设备的方法？

以下工具用于证明有能力满足方法性能的具体要求：

1. 空白：使用各种各样的空白评价分析物对分析信号的大小和其它因素如干扰物对信号贡献大小。空白也可用于测量检出限评定。

2. 参考物质(Reference materials)和有证参考物质(certified reference materials)：利用已经性质或含量值的物质评定方法准确性和获得干扰物质的信息。当把它们作为测量程序中一部分，它们就是我们所熟知的标准物质。在批量分析过程中，定期将它们安插在批次测量中，可评定分析过程的稳定性。注意：同一种标准物质，不能既用于校准（配制曲线）又用于偏差测量。

3. 加标物质(spiked materials)和溶液(solution)

4. 残留物质Incurred materials: 这类物质关注的被分析物（目标物）也许主要来自外部。在取样之前，目标物就已经在某个时段引入到样品中。常用于加标物质的替代。（与加标物质相比，此方式引入的目标物与基体结合得更加紧密。目标物的值取决于与基体接触的目标物的量、基体捕获和流失的比例及代谢过程的其他损失。例子：肉中的助长剂，用含有助长剂的饲料喂养的动物的肉制备。）

5. 重复测量（Replication）: 重复测定可评估测量的精密度。

6. 统计技术（Statistical data analysis）: 利用统计技术评估方法准确性、精密度、线性范围、检出限和定量限和测量不确定度。

比对确认（Comparative validation）

比对确认（纠正或交叉）常用于生物分析和用于证明使用两个或以上方面测定某些测量参数是否一致（equivalent）。如果用原已验证的方法作为参考，将修规后的方法与其进行比对。不存在仅有单一个测试就能评估方法一致性或可接受准则。一般将灵敏度高或高回收率的方法认为是最好的。为了证明替代方法（alternative method mean）与参考方法之间是没有统计学差异（显著性差异），则可以利用配对t-test检验分析变异性和结果差异性。定性方法的比对确认研究，可包括对操作性能的鉴定（identification）（灵敏度、选择性、假定假阳性和假定假阴性）。

确认研究可利用外部机构的一些附加技术研究做支持，考虑利用能力验证的数据。

当单一研究（a simple study）要在不同地点或不同机构进行时，每一个地点或机构需要利用加标标准物质和subject samples进行交叉验证确保实验室内（inter-laboratory）的可靠性。同样，也可考虑使用不同分析技术的比对实验（如LC-MS-MS与ELISA）。

初步确认Primary validation

对于比对验证无法使用的情况下（如内部开发方法，修改的标准方法可影响最终测试结果，标准方法超出了其使用范围，可替代分离或检测原理使用、以及快速分析方法），则在导入方法之前，必须要进行方法初步确认。此时，确认成为了确认一个替代、新颖或其它独立特点方法的操作局限性和性能为目的的探索性工作。会对方法的性能做出大量和/或表示性的说明。

第一步界定要鉴定或测量对象；包括定性表示要测定的实体（entity）和定量（如可能的话）。然后对规则（说明）和客户的任何要求进行确认方法。

第二步选择某些性能参数(Performance Parameters)进行测定。在后续表述。注意：不同的国家或国际委员会组织对这些参数的定义不尽相同。本文件所使用的定义来源于国际测试术语（VIM）(JCGM200,2008)。在很多情况下，这些术语替代了其它的组织的定义。但是，一些解释说明应要与其领域相关。

由于在不同的领域，性能参数测试所需要的样品量也不同，但必须要保证足够的量保证实现方法结果统计有效性（statistically valid），如够用于t-test（t检验）评定准确性。推荐每一

个基体中每一个浓度点的每个测试要至少重复7次测定。实际操作上，这些数量都会超过。一般而言，越多的样品测试，越大的自由度，对于测量的统计学分析就越可信。

基体变化（matrix variation）在许多方面是最为重要的因素但是也是测试误差中最难以把握一个因素。因此，重要的是考虑样品物质性质引起了基体变化。就某一些程序而言，如LC-MS-MS基本程序，采用合适的措施确保在整个方法过程中降低基体影响，特别是基体的性质在方法确认过程中的变化（FDA,2001）。

方法分析的每一步要调查这些环境的，基体，材料或程序变化，在物质收集过程和分析过程中对基体中分析物测定的影响。对于方法确认除了后续所列的那些参数之外，同样也要考虑对评定分析物的稳定性。如许多溶质在色谱分析前易分解，可能发生在溶液制备、萃取、净化、相转移或存放在冰箱的管瓶中或自动进样器。必须要在样品收集和处理过程，长期或短期贮存，经过循环的冷冻和融化以及处理工程中，考虑到样品分析物的稳定性。稳定性实验考察试验的条件要与实际样品处理和分析的条件一致，同样也要对储备液中分析物稳定性做评定。

以下是一个方法确认中关于罐装水果中Sn元素稳定性的分析的例子：

例子：

标准溶液中Sn：准备一个新的标准溶液绘制工作曲线，与之前配制储存的溶液进行比对，以分析在标准溶液中Sn在一段内的稳定情况。

基体中Sn：在典型的储存条件下，对于水果中的Sn要多次的分析，使用ICP-OES测定其Sn含量是否降低或消失。

消解溶液中Sn：对含有已经浓度值的水果样品进行消解，并在一周内每日测定。

方法确认参数（Performance Parameters）

3.1 线性范围Range in which the calibration equation applies (linearity of calibration)

线性用于表达某个给定参数浓度与其信号（响应）之间比例关系。利用校准方程度量线性，因此只是涉及到仪器测量。线性分析同样利用与整个方法，故也用于考察分析物浓度正确度（trueness）的方程。

对于仪器分析，推荐通过以下的草案（方案）（Thompson etal.2002,LGC,2003）将校准曲线模型的验证作为方法确认的一部分。

l 6个或以上的校准标准点（包括空白或与一个低浓度点零接近的标准点）。

l 校准浓度点理论上要均匀分布（涵盖）目标浓度范围，不同浓度要独立的配制，不从同一母液中配制。

l 校准溶液的浓度范围覆盖到待测分析物浓度0-150%或50-150%，具体根据看哪个会更适合。

l 标准溶液每个浓度点至少要重复两次测定，建议3次或更多次，随机测定浓度点。

响应值与浓度之间的斜率可以快速地表示出现两者之间的关系。经典的最小二次拟合方程y = a + bx（y，仪器响应值；x,浓度值）常用于测试分析，a,为线性拟合的截距；b,线性拟合方程的斜率）拟合的标准方差(the standard error) s y/x用来评判拟合是否良好。通常使用线性拟合相关系数来表示（correlating coefficient），但要注意这种容易产生误导，有不同的争论。残差用于评估非线性。绘制拟合数据和残差图表用于证实线性和离群检验。如果重复方差与浓度成比例，则会选用加权拟合（weighted regression）而不是经典最小二乘法。

在标准曲线拟合时，统计方法非常的有用，如ICP-OES和ICP-MS的二次拟合方程。例如在Hibbert(2005)在论证测量不确定度与其参数是否呈线性关系时，采用的二次校准方程。如果在所考查的浓度范围之内不能呈现所期待的线性关系，则应设法消除导致线性差的因素，或者限制（缩小）浓度的范围以确保其线性。在某些情况下，即便非线性方程是适合的，但也要谨慎使用，需要验证所选用这种模型的可行性。一般而言，标准曲线仅需要对样品中

可能涉及的分析物浓度的范围便可，曲线的标准浓度范围过宽并不是件好事，因为其测量的不确定度随着浓度范围变广而增加。

校准曲线的数据可以用于评估精密度（实际上，sy/x用于y的重复性，sy/x/b用于浓度x的评估。要计算精密度，曲线要准备至少3条。（译者注：可准备一定数量标准溶液，后对每个浓度点测定3次。）

注意，从数据上可计算出定量限（LoQ）。

对于非仪器的测试分析，可通过选择不同浓度点（低，中，高浓度）的标准溶液测定线性。最低浓度点应接近于检出限，中浓度和高浓度分别是？？（原文：The lowest level should fall at approximately the limit of detection, the edium and high levels one and two levels higher respectively），可在中和高浓度间加入中间标准溶液，则可提高准确性。将结果绘制成“响应曲线”。

3.1.1 测量区间/范围Measuring interval

测量范围正常是源于线性的研究。测量范围是定义为分析物在其上下限浓度范围之间能够满足一定准确度、精密度、线性要求等（如可接受的不确定），而这个上下限的浓度范围叫为测量范围。实际上，可接受的不确定通常是在高于上限浓度而评估获得的（超过了线性范围）然而需要非常小心的考虑确认浓度范围，如在LOQ和最高浓度之间的确认。注意：在一些场合，数据测量范围也被称为工作范围。（“工作区间working interval”, “工作范围working range”, “测量范围measuring range”,或“测量范围measurement range”.）

3.1.2 基体影响Matrix effects

一旦工作曲线的范围已经被确定之后，那么必须确定基体对分析物回收性能的影响。从原则上，一个样品中不只含有待测物一种物质，同样含有其他成分（外来物质，共生物质等），样品中这些成分构成的存在对结果有潜在性影响，提高或降低设备检测器对待测物的响应值。基体对强度和存在（occurrence）中产生不利影响，一些技术容易受到影响，因此，有些干扰物会使得分析物的回收变得很差，甚至从100%到一个很大的数。例如，在用气、液色谱测定农残分析时，通常可知基体的存在使得强度增强。在一些复杂样品或不明的基体，如食品，是很难评估基体对分析的影响。

如不存在基体干扰，则用标准物质配制溶液更好。而如果怀疑存在基体干扰，则需要通过在典型样品萃取液中添加标准溶液进行识别。每种基体类型溶液中准备3个浓度点，并至少重复测定1或2次。

为了测定基体对仪器响应的影响，配制校准曲线时，加入基体配制的校准曲线的溶液浓度点应与不含有基体的标准溶液浓度一致，这样可以考察这两个曲线斜率是否存在显著性差异，如果小于10%，则认为不需要对基体影响进行修正。然而，需要注意标准加入法不能对所添加基体的影响进行弥补（消除）。至于非仪器分析方法，可通过3.4.3节回收（recovery）对是否存在基体干扰进行确认。

如果基体添加标准（matrix fortified standards）测出的结果要较纯标准物测出（全过程）的结果要高或低。这些结果由于目标物在基体物质中回收率低，或存在干扰导致高回收率，可能因为基体的存在抑制或提高仪器检测器的响应。为确认这些可能性，机构可通过单纯标准物质、用于分析全过程的标准物质、在空白基体溶液中的标准物质、在萃取前加入到基体中的标准物质所取得的结果进行比对。然后，进行以下测定：

l 纯标准与全过程分析的标准物质间结果表明目标物对于本方法的损失情况，当结果数值增加，则表明试剂有污染。

l 全过程分析的标准物质、在萃取液或消解液添加的单纯标准物质所测出的结果，可用于说明基体对检测系统是否存在增强或抑制影响。

l 萃取或消解前的空白基体溶液中添加标准物质、在萃取或消解后添加标准物质之间的结果

比对表明在测试过程中的损失情况。(AOAC flworkshop). 在

3.2 选择性

在方法确认过程中，它是在确定所测定的方法满足有意测定（intended to measure）要求重要的参数。另外，方法应不受到干扰，否则可能产生错误结果。方法选择性确保在有干扰物的存在情况下能实现测试结果的准确性，如存在竞争性非目标微生物、杂质、降解物和基体成分。术语“选择性”和“专一性”（specific）经常被交替使用。“专一性”一般是指方法能对目标物产生单独的响应。而选择性是指方法能对许多实体产生响应，这些实体能或不能之间区别开来。由于极少有方法仅对目标物有响应，因此对于选择性术语的使用会更适合。

对于高度专一性测定程序的方法（如色谱/质谱）具有很好的选择性。然而，对于比色法，目标物的显色常会受到性质相同或有色共萃取物的影响。由于分析者要确定所有潜在的干扰物是非常不实际的，分析员需要利用知识和经验考虑那些最相关性的情况。

如果有需要考察潜在干扰物的影响，通过加入已知浓度的可疑干扰物进行分析。这种测试对含有一定浓度的目标物的样品中进行，且涉及的浓度范围应包括实际样品中可能会碰到的浓度值（单个浓度点测试可接受，也可测定含有多种不同浓度的干扰物的样品。）如果一个方法要定量多种目标物，则需要测定这些分析对象间是没有互相干扰的。需要考察干扰物的影响——是否干扰物提高或抑制测定物质的定量检测？原则上，所开发方法具有一定级别的选择性而无大干扰。如果定量或测定受到干扰物的阻碍，则需要进一步的方法开发。但是小的影响是可以容许的，包括在偏差的评估中。

方法需要进行证实（confirmation），如韩鸥低浓度的有机化合物的样品（食品中农残和有机污染物），需要对微量有机物进行阳性定性（positive identification）.确认适用于残余物的定性和浓度分析。对于阳性样品的浓度与定性的确认，可通过不同检测方法或柱子或使用专用的质谱或其他可选择的分析方法进行确认（如NDA序列分析和凝胶电泳）。这种情况下必须执行证实技术的确认。

3.3 灵敏性（sensitivity）

方法灵敏性是指随着分析物浓度的变化而引起响应值的变化，它是响应曲线的有效梯度。灵敏度越大通常认为更小的（线性）动态范围和低测量不确定度。对于仪器分析，灵敏度可以用校准工作曲线y = a + bx中的斜率b来表示，利用经典最小二乘法线性拟合进行计算，也有经验性方法，对含有多种不同浓度分析物的样品进行测定。灵敏度可通过分析样品萃取液中的添加标准物质进行测定。当平均斜率>1或<-1时，则表明为高灵敏性。高灵敏度表明方法在分析物含量在微小变化下就能感应的到。但高灵敏度同时也意味着低动态线性范围。如果灵敏度随着每天的操作环境发生变化，则这种方法在所期望的浓度范围就难以获得满意、线性的响应。灵敏度的确认将作为机构正常进行质量保证和控制程序中一部分。

3.4 准确性Accuracy

准确性是单个测量结果的一个性质，受到随机和系统误差所影响的。因此其本身不包括在方法确认中。准确度表示结果与真值之间的接近程度，因而其包括了精密度和正确度（偏差来表示）。

精密度与测量的重复性和再现性条件相关，“表示每次重复性测定获得相同结果的一致性。换句话说，精密度就是多个测量结果之间的一致性。重复性是指多次测量结果的分散性，主要受到随机误差的影响，它不是表明结果与真值间的接近程度。

一个测量系统可准确不精确、精确不准确、或者既不准确也不精确。如果一个测量系统中存在系统误差，增加测量次数可以提高测试精密度，但无法提高准确性。消除系统误差可提高准确度但不能改变精密度。然而，测量体系的有效性是指其是否满足“目的的适应性”，因此需要按照确认准则对准确性和精密度进行评估。这是没有绝度衡量标尺（there is no absolute scale.）。

我们无法获得完全的测量，理想的测量在有限的测量仪器下尽可能接近真值。

以下图解用于说明两个术语，准确度和精密度之间的区别。

A.既准确又精确

B.精密度高，但准确性差

C.准确性与精密度均差

3.4.1精密度（Precision）

ISO 3534-1(2006)表述了精密度作为在重复性条件下（重复性、中密度、再现性条件下）获得多个独立结果之间接近程度（分散程度）。要获得怎样程度的精密度主要依赖于这种测试的作用与重要性。注意“独立测试结果是指结果是在不受到以前同样或类似样品测试结果的影响，这些样品应该独立准备，可认为是在总体样品中随机样品。

精密度在数学上通常用测量不精密度的来表达，如多次测量的标准偏差（标准偏差越大，精密度越低）或相对标准偏差（变异系数）。也可用其他合适的方式表达。为了要获得正常操作条件下方法的精密度，则测试必须在同样条件下进行，测试样品为正常分析的典型样品，样品准备要与正常操作一致，试剂、测试设备、分析人员和操作均要实际测试的情况一致。样品要均匀，否者如果无法获得均质材料需要通过认为准备或样品溶液进行评定其准确性。精密度会随着分析物浓度的变化而变化。如果分析物的浓度超过平均值的50%则需要对精密度进行评定。对于某些测试，可能只对数据使用者的特别显著的一个或两个浓度进行评定，如产品质量控制（QC）或法规限值。

对于单一实验室的方法确认，测量精密度的最好的方式就是对实验室的某一个样品的多个部位和有证标准物质（CRM）或参考物质（RM）在正常条件下进行长期测定。通常包括以下表述的实验室间再现性的测定（再现性条件），在不同样品、不同时间进行，且数据之间没有显著性差异，则这些数据将结合用于计算合并（pooled）标准偏差。

主要注意的是，上述关于精密度的阐述都是相对于定量分析而言的。定性分析则可以用稍微不同的方式来处理。在一个界定的被分析物浓度阈值水平上，定性分析是一种有效的是或否。对于定性方法来说，精密度不能用标准偏差或相对偏差来表示，而是用真阳性(或阴性)的比率来表示，真阳性在所有阳性（包括真阳性和假阳性）的占有比例。这些比率的测定应该在不同的浓度范围内进行，包括低于阈值的浓度、在阈值范围水平上的浓度以及高于阈值的浓度水平。

精密度=真阳性的数量/(真阳性数量和假阳性数量)*100%

可利用F检验统计法对两个方法的精密度进行显著性检验。

对于精密度，测量的重复性和再现性常作为其量度。重复性和再现性在分析方法内的测量浓度不同而不同，因而需要在多个浓度点进行测定，其中一个浓度点应包含测试范围内最低浓度。对于可疑基体产生的影响，测定多个浓度点显得尤为必要。

3.4.1.1 重复性

重复性是在重复性条件下的精密度。重复性是指一个机构用相同的方法在同一个实验室由相同的操作人员在短时间内用相同的设备测得的相互独立的测试结果。（条件尽可能一致，如温度、加热温度）。在合适的测试次数，可用标准偏差（s），方差（s2）等表示。如果方法中涉及到仪器分析，则除了方法重复性外还要有仪器重复性。重复性是体现了测量结果短期变异，同样也是用于评定在单一批次分析中重复测定可能存在的差异。然而，其低估了在长期正常条件下测量结果的分散性。

重复性的测定，要在自由度至少在6下测定。如在一系列（series）测试一个样品（item）测定7次，或2个样品，每个系列测定4次；3个样品，每个系列3次。

仪器重复性可通过对校准曲线中标准溶液、加标溶液进样测定7次，后计算平均值、标准偏差。进样应是在随机性下进行以降低偏差。

方法重复性通过准备含有不同浓度分析的共用（pool）样品或浓度相近的用于方法回收率研

究的样品进行测定，亦可使用在加了相应标准溶液的空白溶液中进行测定。制备多个加了标的萃取液在同一天内由同一个分析员进行分析。计算平均值，标准偏差，相对标准偏差。3.4.1.2 再现性(reproducibility)

再现性是指在多个条件变化下进行一系列测定出的结果的精密度评估。如使用同种方法测定相同项目，但由不同操作员在不同机构、不同设备、不同时间内的测定。可表示为标准偏差（s），方差（s2），概率分布系数，例如在利用两种以上校准标准溶液在一段时间、测定一定数量的试样。对于单个实验室通常使用实验室内再现性、实验室间的再现性或中密度精密度这些术语来表示相关的再现性精密度，这些条件包括在不同时间内测定，在与日常使用方法中条件差别尽可能小的情况下测定（如不同分析员利用不同设备的测试）。

再现性标准偏差可通过一系列多个样品获得，或多个系列测定结果的合成标准偏差进行计算。测试的自由度可通过系列量和每系列中样品数量进行计算。

每系列测试中样品数系列量重复性自由度再现性自由度

7 1 6 不适用

4 2 6 7

3 3 6 8

2 6 6 11

n m (n-1)*m n*m-1

如果测试方法是用于对一系列样品类型进行测定（如不同分析物浓度或样品基体），则精密度的评估需要选择每个类型代表性的样品进行测定。由于一个方法的精密度会随着分析物浓度的降低而变得差。

3.4.2 正确度T rueness

测量正确度用于表述多次重复性测定结果的平均值与参考值之间的接近程度。正确度差意味着存在系统误差。偏差（bias）是正确度的表示方式。偏差低则结果正确度就高。

测量结果的偏差可以看作是由方法本身偏差，实验室偏差，来源于某一个特定分析带来偏差之间工作作用的结合。

回收（recovery）试验用于评定偏差。回收是指在样品（溶液）加入已知含量的分析物并在整个分析方法过程中测定，测定的结果减去原先未添加分析物的溶液测定结果并除以所添加浓度含量，则计算出回收率百分比。在高偏差测试中，测定值与参考值会重大的偏离。

考虑到不同批次（runs）之间的变化，偏差在测试一段时间，如果可能的话，通过覆盖整个浓度测试范围的不同试样。当一个方法不能如预期那样在整个测试范围偏差一致时（如非线性校准曲线），则需要对不同浓度水平的样品进行测定（至少对高或低含量测试）。否则，机构必须要证明在真个测试范围之内具有相同的正确度。

最为理想评定偏差是能够找到样品的基体匹配、浓度相近的有证标准物质（CRMs），并测试。

然而对于大多数的测量，合适的CRMs是无法获得的，需要寻找可替代的物质来评定偏差。对于分析参考物质RM来评定回收率，则是一个好的选择。（假定基体与待测样品的基体匹配，目标物具有足够的特征性。）经过多个合作实验室测定的特征性的材料可以用于此目的。如果合适CRMs或RMs都无法获得，则偏差只能通过在基体空白中加入一系列浓度的目标物。在这种情况下，回收率可通过加标前后浓度差与加入标的量之比来计算。公式如下：

R=(C1-C2)/C2*100

C1是指加入标准物质之后测定的浓度；

C2为未加入裱糊尊物质之前测定的浓度；

C3是指加入标准物质的浓度。

对于一些测试，如农残分析，机构可以在已确认不含目标残余中加入标样。然而对于许多测试，有必要向那些含有本底（natural）值分析物的样品中加入标样。

在这种情况下，偏差可通过加标样品前后之差进行计算。同时需要注意，加标样品回收率要比在样品中本身就含有（native）分析物或残留物质的测定要好。例如，当在饮用水中加入氟离子计算的回收率要较为可靠，而在土壤中加入有机氯杀虫剂所计算的回收率就会差些。这主要对于被添加和本身就存在（native）的分析物质的萃取的效率存在差异。如果可能的话，加标回收数据需要提供多个平均值进行证明。参加包括本底样品（natural sample）、含有残留物质的样品的能力验证。

在一些情况下，机构不得不只能依赖于加标评定其偏差。在这种情况下，100%的回收率并不一定意味着（好）正确度。但差回收率则一定意味着有偏差，即使这些总偏差可能被低估了。

一已知偏差的国际或国家认可的参考方法常用来评定另一种方法的偏差。利用两种方法按照相关测试程序对多种基体或浓度的典型样品进行测定。可用t-test对方法间的偏差显著性进行评定。

3.5 检出限和定量限

检出限（LOD）或定量限（LOQ）的测定通常是在目标物的含量在接近于“零”的时候才需要进行测定。当方法应用于所测定的分析物浓度要比定量限大的多时，检出限与定量限评定就显的不是非常有必要了。但是对于那些浓度接近于检出限与定量限的痕量和超痕量测试，常报出“未检出”时，这时检出限或定量限对于风险评估或法规决策则就显得非常的重要。

不同的基体需要独立评估其检出限和定量限。

3.5.1 检出限（LOD）

对于大多数现代的分析方法检出限（LOD）分为两个部分，方法检出限（MDL）和仪器检出限（IDL）.

方法检出限是在应用在某个具体基体内的分析物的测定。方法检出限可定义分析物质能在可靠将分析物测定信号区别于特定基体背景（噪音）的最低浓度或量。换句话说，方法检出限就是方法中测定出大于相关不确定度的最低量（Taylor，1989）。在分析方法检出限（MDL）时需要靠考虑到所有基体的干扰。

方法的检出限不应与仪器最低响应值相混淆。使用信噪比可作为考察仪器性能的一个有用的指标，但不适用于评估方法检出限。目前大多数的分析都是利用设备进行分析，但每个设备对于所检测的分析物的量都会有一定检出能力。这种检出能力可用仪器检出限（IDL）进行表示。仪器检出限可定义为仪器能将目标物与设备背景相区别或可靠检测的最低量（仪器噪音）。随着灵敏度增加，IDL降低，仪器噪音降低，IDL也降低。

可用多种方法确定检出限，以下罗列出应用评定检出限的一些方法。

3.5.1.1 基于虚拟（visual）评估LOD

Visual评估可应用于非仪器方法和仪器分析方法，同时也可应用于定性测试方法的评估。

通过在样品空白中添加已经浓度的分析，后评定能够可靠被检测出的最低浓度值。

在样品空白中加入一系列不同浓度的分析物。在每一个浓度点需要进行约7次的独立测试。各个浓度点的重复性测试应该随机性。对于定性分析，通过绘制阳性百分比（阴性）与浓度之间的响应曲线，检查确定哪个浓度阈值是不可靠的。

3.5.1.2 空白标准偏差进行评定LOD

通过分析大量的空白进行评定（推荐20个以上）。样品空白独立测试的次数（n大于10以上），以及加入最低可接受浓度的样品空白测试次数（n大于10次以上）。LOD的可用样品

空白平均值值加上3被标准偏差。（0+3S）

3.5.1.3 基于校准曲线的LOD评定

如果LOD数据或与LOD相近的数据无法得到，则可利用校准曲线的参数进行评估。用空白加上空白的3倍偏差，仪器对于空白的响应可用方程截距a表示，仪器响应的标准偏差可用校准曲线的标准偏差Sy/x来表示。故可利用方程y LOD = a + 3 s y/x = a + bx LOD , 则x LOD = 3 s y/x/b. 这个方程广泛应用于分析化学。然而由于这是推断，当浓度接近于期望LOD时，则所测定的数据就会显得不那么可靠，建议当浓度接近于LOD时，需要证明要在合适的置信区间内能够被测定出来（可靠的被测定出来）。

3.5.1.4 基于信噪比LOD

由于仪器分析过程都会有背景噪音，常用的方法就是利用已经低浓度的分析物与空白样品的测量信号进行比较，确定出能够可靠测定出的最小的浓度，最典型的可接受的信噪比是2:1或3:1。

3.5.2 定量限LOQ

定量限同样是指检测限，然而定量限与LOD是有区别。类似于LOD，LOQ也可以分成两个部分，方法定量限（MQL）和仪器定量限（IQL）

方法定量限可定义为在特定基体中在某一可信度（a certain degree）内对分析物能进行可靠确认和定量的最低浓度值。

仪器定量限可定义为仪器能够对分析物进行可靠确认和定量的最低浓度值。

定量限可以用分析物在样品中的浓度来表示（百分比，ppb）表示。多种惯例采用于LOQ 的评估。主要是从其可信性（certainty）考虑(如测试是否基于法规目的，测试不确定度和可接受准则等)，最普遍可接受的是将空白加上10倍的重复标准作为LOQ或3倍的LOD（给出了更大的数）或高于方法确认中使用最低加标的50%作为LOQ.为了使数据更加的可信性，LOQ可用10的LOD来表示。在某一特定测试领域其它因素可以应用，那么机构应当将那些现行的因素考虑在内。

定量限是在特定的基体和方法评估的，不同机构之间或在同个机构内由于不同设备、技术和试剂不同而有差异。

3.5.2.1 报告检出限LOR

报告检出限是实际定量限或高于LOQ.

LOD-快速参考

离子选择电极测定氨氮含量AMMONIA BY ION SELECTIVE ELECTRODE (ISE)（quoted ：ANALYTICAL DETECTION LIMIT GUIDANCE & Laboratory Guide for Determining Method Detection Limits，Wisconsin Department of Natural Resources Laboratory Certification Program，April 1996，PUBL-TS-056-96）

本例子介绍了用认可的离子选择性电极法测定氨氮的方法检出限MDL.仪器生产商声称其仪器的可以检出0.05 mg/L的氨氮含量. 使用3个标准溶液，浓度分别为1, 5, and 10 mg/L 和空白。将0.05 mg/L乘以5倍即0.25 mg/L作为最初的“最低浓度值）(当然选择的浓度值可以在0.05 ~0.25 mg/L之间). 结果列于表中，为计算MDL需要根据自由度，查表得出t 值。对于本例自由度为6，t为 3.143（99%概率）。

T ABLE I - AMMONIA

Sample Results % Recovery

sample 1 0.20 80%

sample 2 0.21 84%

sample 3 0.22 88%

sample 4 0.22 88%

sample 5 0.24 96%

sample 6 0.21 84%

sample 7 0.23 92%

Mean = 0.22 87.4%

Std Dev. = 0.013

MDL= (s)(t-value)= 0.013 x 3.143= 0.040859

修约为0.041mg/L

LOQ= 10 x (s)= 10 x 0.013= 0.13 mg/L

利用以下方面进行确认：

1. Spike Level (MDLx10>Spike): (0.041)(10) = 0.41 > 0.25 ug/L [OK, Meets Criteria]

2. Spike Level (MDL

3. MDL < Req'd? --- [No Requirement]

4. S/N Estimate (ave/sd): 0.22/0.013= 16.9 [Check for Error]（2.5-10）

5. A ve. % Recovery: 87.4% [Acceptable]

原文：

This example calculates the MDL for ammonia-nitrogen using the approved ion selective electrode method. The electrode's manufacturer claims that the probe can detect ammonia as low as 0.05 mg/L. The instrument was calibrated using three standards at 1, 5, and 10 mg/L and a blank. The first step, estimating the MDL, requires familiarity with the analytical procedure. In this case, the manufacturer's claim is a convenient place to start. Multiplying the manufacturer's number, 0.05 mg/L by a factor of 5 gives 0.25 mg/L for an initial spike level (the spike level could be anywhere between 0.05 to 0.25 mg/L). The ISE method requires 100 ml of sample per analysis.

A stock standard was prepared by spiking reagent water at the appropriate concentration, and seven 100 ml aliquots were prepared and analyzed as prescribed in the method. The results for the study are shown in the Table I (in mg/L).

To calculate the MDL, simply multiply the sample standard deviation by the correct Student's

t-value from Appendix A.

T ABLE I - AMMONIA

Sample Results % Recovery

sample 1 0.20 80%

sample 2 0.21 84%

sample 3 0.22 88%

sample 4 0.22 88%

sample 5 0.24 96%

sample 6 0.21 84%

sample 7 0.23 92%

Mean = 0.22 87.4%

Std Dev. = 0.013

For seven replicates and six degrees of freedom, t is found to be 3.143. The MDL is calculated as follows:

MDL= (s)(t-value)= 0.013 x 3.143= 0.040859

Rounding to the correct number of significant figures, the calculated MDL becomes 0.041

mg/L, slightly lower than the manufacturer's claim. The limit of quantitation can also be calculated:

LOQ= 10 x (s)= 10 x 0.013= 0.13 mg/L

The MDL is now verified using the five point

check:

1. Spike Level (MDLx10>Spike): (0.041)(10) = 0.41 > 0.25 ug/L [OK, Meets Criteria]

2. Spike Level (MDL

3. MDL < Req'd? --- [No Requirement]

4. S/N Estimate (ave/sd): 0.22/0.013= 16.9 [Check for Error]

5. A ve. % Recovery: 87.4% [Acceptable]

https://www.360docs.net/doc/bd13384446.html,/s/blog_7a680dd801014t7z.html