过氧化氢酶活力的测定实验报告doc

过氧化氢酶活力的测定实验报告

篇一：过氧化氢酶活性测定

实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）

过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。

一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：小麦叶片

（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。

（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.

0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。

三、实验步骤

（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。

用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。

四、结果计算

酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A－B）×VT/(W ×VS×1.7×t)

式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；VT提取酶液总量（ml）；

VS反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g）；t反应时间（min）；

1.71ml0.1mol/L KMnO4相当于1.7mgH2O2。

过氧化氢酶的活性测定

在植物体中，黄素氧化酶类的代谢产物常包含H2O2，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸

作用中的葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶、醛氧化酶等。H2O2的积累可导致破坏性的氧化作用，

而过氧化物酶和过氧化氢酶则可以清除H2O2，是植物体内重要的活性氧清除系统之一。其活

性还与植物的抗逆性有密切关系，本实验利用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。

一、原理：过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，

在此过程中起传递电子的作用，H2O2则既是氧化剂，又是还原剂。

R(Fe+2)＋H2O2=====R(Fe+3OH-)2

R(Fe+3OH-)2＋H2O2===R(Fe+2)2＋2H2O＋O2

合并上式：2H2O2====2H2O＋O2

据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸

钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。

5H2O2＋2KMnO4＋4H2SO4→5O2＋2KHSO4＋8H2O＋2MnSO4

即可求出消耗的H2O2量。

二、仪器和用具：研钵、三角瓶50cm3×4、铁架、酸式滴定管、恒温水浴、容量瓶

三、试剂：

10％H2SO4；0.2mol/l磷酸缓冲液pH7.8；

0.1mol/l高锰酸钾标准液： 3.1605gKMnO4 (AR) 用新煮沸的蒸馏水配制成1000ml，用

0.1mol/l的草酸溶液标定；

0.1mol/l H2O2：市售30％H2O2大约等于17.6mol/l，取30％H2O2溶液5.68ml稀释至

1000ml，用标准0.1mol/l KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定。

四、方法：

1. 酶液提取：取小麦叶片

2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25ml

容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转移至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000rpm离心，

上清液即为过氧化氢酶粗提液。

2. 取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定加入酶液2.5ml，对照为煮死酶液

2.5ml；再加入2.5ml 0.1mol/l H2O2，同时计时间，于30℃恒温水浴中保温10分钟，立即加

入10％H2SO4 2.5ml。

3. 用0.1mol/l KMnO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30分钟内不消失）为终点。

4. 结果计算：

酶活性用每克鲜重样品在10分钟内分解H2O2的毫克数表示：

(A-B)*Vt/V1*1.7

酶活（酶分解的H2O2 mg/g鲜重）＝-------------------

W

式中：Ａ-----对照用KMnO4 ml数Ｂ-----酶反应后KMnO4滴定ml数

Ｖt----酶液总量mlＶ1----反应所用酶液量mlＷ-----样品鲜重(g)

1.7----1ml 0.1mol/l KMnO4相当于1.7mg H2O2

[注意]．所用KMnO4溶液及H2O2溶液使用前要经过标定，0.1mol/l H2O2要新配制。

实验 48 过氧化物酶活性的测定（比色法）

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密

切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

一、原理

在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。

二、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料

马铃薯块茎。

（二）试剂

1 ． 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液 pH6.0 （见附录）。

2 ．反应混合液： 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液（ pH6.0 ）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚 28 μl ，于

磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。

（三）仪器设备

分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管，离心机。

三、实验步骤

1 ．称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r ／ min 离心 15 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。

2 ．取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液

3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。

四、结果计算

以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ] 表示之。也可以用每 min 内

A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。

过氧化物酶活性 [u/ （ g · min ） ]=

式中：Δ A 470 ——反应时间内吸光度的变化。 W ——植物鲜重， g 。

V T ——提取酶液总体积， mL 。

V s ——测定时取用酶液体积 , mL 。

t ——反应时间， min 。

蒲圻贝母Fritillaria puqiensis G.D.Yu et G.Y.Chen 是贝母属中一新种，其有效成分生物碱含量较高，止咳效果显著［1，2］。其中的蒲贝酮碱的效果与可待因相似，且无成瘾性，已被国家新药办立项进行一类新药开发。但由于蒲圻贝母以野生为主，连年的采挖已使其资源逐渐枯竭，难以为新药开发提供资源保证，为此我们对其进行了组织培养。蒲圻贝母鳞茎切块培养22d左右，可直接从切片边缘长出多个小鳞茎，以后小鳞茎逐渐长大。为了探讨鳞茎发生的机理，并为研究提高组培贝母鳞茎的生长率，诱发多鳞茎形成的方法，我们在培养的不同时期取材，对鳞茎形成过程中的可溶性蛋白，过氧化物酶及酯酶同工酶的酶谱变化进行了分析。

1 材料和方法

1.1 材料

蒲圻贝母F.puqiensis取自湖北省蒲圻市，经中国药科大学生药教研室李萍博士鉴定。

新鲜的蒲圻贝母鳞茎在流水下冲洗3h，0.1%氯化汞表面消毒20min，无菌水冲洗5次，切成0.5cm×0.5cm×0.2cm 的小块接种于MS附加BA 2mg/L-1，IAA 1mg/L-1的培养基上，在25℃黑暗条件下培养，获得无菌材料。分别在培养的不同时间取材，并以未进行培养的新鲜贝母鳞茎为对照，进行可溶性蛋白，过氧化物酶及酯酶同工酶酶谱分析。

1.2 方法

1.2.1 试剂的配制与凝胶的制备：参考文献［3］的方法。分离胶浓度为7.5%，间隔胶浓度为2.5%。

1.2.2 样品制备：称取新鲜的贝母鳞茎1g，在低温冰箱内放置1h后，加少许石英砂，加3ml提取缓冲液(0.1mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，其中含0.5mol/L蔗糖，0.06mol/L 抗坏血酸，0.006mol/L半胱氨酸)，在低温下研磨后离心20min，5000r/min，取上清液置-20℃下保存。

1.2.3 电泳：采用垂直板式聚丙烯酰胺凝胶电泳，加入溴酚蓝作为指示染料。稳定电流强度为12～24mA。可溶性蛋白的点样量为50μl，用含0.05%考马斯亮蓝的12.5%三氯乙酸溶液染色4h。过氧化物同工酶的点样量为30μl，用抗坏血酸-联苯胺染液染色，其组成为抗坏血酸70.4mg，联苯胺储存液20ml(2g联苯胺溶于18ml文火加热的冰醋酸中，再加水72ml)，0.6%过氧化氢20ml，水60ml。酯酶同工酶的点样量为50μl，按薛应龙［4］方法，即凝胶在0.2mol/L，Tris-HCl缓冲液(pH 7.1)预浸10min，然后移入含有7%醋酸-α-萘酯的丙酮溶液0.5ml，坚牢蓝12.5mg，0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.1)1ml，水23.4ml的染色液中染色10～30min，棕红色的同工酶谱带即呈现。

2 结果与分析

按谱带颜色的深浅程度将其划分为重带、次重带、轻带，并按迁移率的大小划分为3个区，Rf在0.1～0.3为慢速区

(A)，在0.4～0.6为中速区(B)，在0.7～0.9为快速区(C)。篇二：过氧化氢酶活性的测定

华南农业大学实验报告

专业班次 11农学一班组别XX30010110 题目影响酶促反应的因素姓名梁志雄日期

【实验原理】 1、

酶的化学本质是蛋白质，作为催化剂，与一般的有机和无机的催化剂相比较，有其相同之处，但也有其特异性。酶促反应的速度要比一般的催化剂催化的反应速度要快得多，本实验比较生马铃薯糜（含活泼过氧化氢）、熟马铃薯糜（已将过氧化氢钝化）、铁粉对于这个反应的催化效果，放出的氧气气泡越多，反应速度越快。

2、

酶的重要特性之一就是其催化的专一性，一种酶只能催化一个反应或者是一类反应。本实验分别研究淀粉酶和蔗糖酶的专一性。根据蔗糖酶和淀粉酶催化的反应方程式可知，反应生成的单糖都是还原糖，利用还原糖与本乃狄试剂试剂中的铜离子反应，生成转红丝的Cu2O沉淀，因此可以利用这个反应是否有砖红色沉淀产生来判断是否有产物还原糖生成，从而确定某种底物的存在是否有酶促反应的发生。

3、

在3中不同的pH条件下，比较淀粉酶催化淀粉水解能

力的大小，反应后加碘液，蓝色越深，证明淀粉残留越多，该反应的酶活性越低。蓝色越浅，淀粉残留越少，该反应的酶活性越高。

4、 5、

在0℃、37℃、70℃3个温度条件下，淀粉酶催化反应后淀粉的残余情况，加碘液后蓝色越深，残余淀粉越多，该反应酶活性越低。

能够使酶促反应速度升高的化学物质称为激活剂。能够使酶促放映速度下降的化学放映物质称为抑制剂。本实验在淀粉酶催化的反应系统中分别加入一定浓度的NaCl和CuSO4，比较反应后淀粉的残余量。蓝色越深，酶活性越低，蓝色越浅，酶活性越高。

【实验材料和试剂】

马铃薯块茎处理、淀粉酶、1%淀粉溶液、蔗糖酶粗酶液、本乃狄试剂、碘液、2%过氧化氢溶液、2%蔗糖溶液、缓冲液、氯化钠溶液、硫酸铜溶液【实验步骤】

1、配制适宜浓度的唾液淀粉酶溶液

2、酶催化的高效性实验，取四支试管，编号1~4，按照表1加入过氧化钠和各种催化物质，立即观察各管气泡出

现的情况，在下表中填入数据

2、酶催化的专一性实验，取试管6支，编号1~6，按照表2的顺序加入试剂，并进行保温处理，处理后将各管的颜

色变化记录在表2中，把颜色变化填入表2中表2酶催化的专一性实验

3、pH对酶促反应的影响实验，取试管3支，编号1~3，按照表3的顺序加进相应的试剂和保温处理，最后加入碘液观察各个试管颜色的变化

4、温度对于酶促反应的影响实验，取试管3支，编号1~3，按照表4的顺序加入相应的试剂和保温处理，最后加入碘液后观察各管颜色的变化表4温度对于酶促反应的影响实验

5、酶的激活与抑制剂实验，去试管3支，编号1~3，按照表5的顺序加入试剂和保温处理，观察各试管中颜色变化【实验记录】记录情况在表格中

【实验结论】

上述的5个实验，探究了酶的高效性、专一性，还有温度、pH、激活剂与抑制剂对于酶活性的影响，从实验现象可以知道，酶作为催化剂，与一般的有机和无机催化剂相比较，催化能力较强，一种酶只能催化一个或者是一类反应，酶具有高度的特异性，由于酶的结构关系，酶只有在最适宜温度和pH的条件下，才能发挥最大的催化作用，该温度称为最适温度，该pH称为最适pH，最后一个实验，我们知道了激活剂可以提高酶促反应的速度，而抑制剂即可以使酶促反应的速度下降，利用这两种物质，在工业生产中，就可以根据

生产的要求适当控制酶反应的速度。

篇三：实验2 过氧化氢酶活性测定

实验2 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）

一、实验目的

熟悉用滴定法测定过氧化氢酶活性。二、实验原理

过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系；过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。

5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 = 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4

三、实验器材 1材料：植物叶片

2仪器设备：研钵；酸式滴定管；恒温水浴； 3试剂：10% H2SO4； 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；

0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml；

0.1mol/L H2O2市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml。四、实验步骤

1、酶液提取：取植物叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml量筒中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至量筒中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2、取50ml三角瓶2个（1个测定，另1个为对照），测定瓶加入酶液 2.5ml，对照加煮死酶液 2.5ml，再加入 2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。

3、用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min内不消失）为

终点。五、实验结果

酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A－B）×Vt×1.7/(W×Vs×t)

式中：A-对照KMnO4滴定ml数； B-酶反应后KMnO4滴定ml数； Vt-提取酶液总量（ml）； Vs-反应时所用酶液量（ml）； W-样品鲜重（g）； t-反应时间（min）；

1.71ml0.1mol/L KMnO4相当于1.7mg H2O2 六、实验思考

过氧化氢酶与哪些生化过程有关?