抗体ProteinA纯化方法

抗体P r o t e i n A纯化方

法

-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1

抗体ProteinA纯化

一．P roteinA柱子的制备

1.配制溶液；

结合／洗涤缓冲液：NaCl，；Na2HPO4，20mM ；。

配制500ml的方法：

称取NaCl ，Na2HPO4溶解于450ml的双蒸水中。调节PH为,补加双蒸水至总体积500ml。

2. 制备空柱子

（1）先打开用过的PD-10上盖，拿掉上面的盖膜。盖上盖子，摇晃，倒去里面的填料，用PBS清洗3次。

（2）用胶带固定好PD-10空柱子，要求垂直放置。

（3）在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。

（4）ProteinA填料混匀，（10ml包装一小瓶）。

（5）加入5ml的ProteinA到柱子中。

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二．纯化步骤

1.样品准备；将兔血清与结合缓冲液1：1混合，过滤（防止堵塞柱子）。

2.平衡柱子：用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。

3.上样：将准备好的血清样品上样，根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。

4.洗脱杂蛋白：用结合缓冲液冲洗柱子，直至结合液中不含蛋白。

5.收集抗体：用洗脱液过柱，同时收集漏出液（约3-4ml/管），直至漏出液中

不含蛋白。测定各收集管中的蛋白含量，合并蛋白管。（注意：收集管中需事先加入约150ul的1M Tris-HCl缓冲液，防止抗体在过酸的环境下失活）

6.柱子再生：用5-10倍体积的再生液再生柱子。

7.PBS透析收集的抗体。

三．试剂的制备

1. 结合缓冲液1000ml 500ml

甘氨酸

氯化钠

氢氧化钠调PH至

2. 洗脱缓冲液500ml

甘氨酸

用盐酸调PH至

3. 再生缓冲液500ml

甘氨酸

酸调PH至

4.称取碱，加80毫升的双蒸水，溶解后用盐酸调节，补加到水100毫升，