胶回收相关问题

胶回收DNA注意事项

一、胶回收DNA注意事项

1.用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶，以减少回收胶的体积。

2.DNA的浓度要足够大。

3.紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，刀片要清洗，防止外源DNA的污染。

4.回收效率低：a.胶未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次；b.胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；c.电泳缓冲液pH太高；d.漂洗液中未加入无水乙醇;e.改用去离子水洗脱。

5.洗脱液体积不能小于说明书提供的最小洗脱体积。

6.胶块不溶：a.琼脂糖质量不好；b.含目的片段的凝胶再空气中放置过久，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；c.制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。

7.溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

8.电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

二、提高胶回收量的办法

1.增加电泳时的上样量。

2.电泳缓冲液用新鲜配制的。

3.切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积，含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。

4.同一种DNA片段的胶转移到同一个柱子上。

5.溶胶时所加溶液应与回收的胶1:1混合（或者多加一些），但不要多余750ul，否则会降低回收效率。

6.胶回收的关键：通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性，因此，

若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L）NaAC；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可在加热溶解胶后的液体里添加少量30％异丙醇。

7.加洗脱液之前，用乙醇处理柱子，放置约10分钟使乙醇充分挥发。

8.洗脱液要滴在膜中央，并静置两分钟，以充分洗脱结合在膜上的DNA。

9.可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4℃过夜。

10.洗脱液洗两次：将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。

三、影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素

1.DNA分子大小：迁移速率U与DNA分子大小成反比。

2.琼脂糖浓度：logU=logU0Krt胶浓度，U为迁移率，U0为DNA自由电泳迁移率，t为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA。Agarose：0.5%：1-30 kb；0.7%：0.8-12 kb；1.2%：0.4-7 kb；1.5%：0.2-3 kb

3.DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。

4.所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm。

5.嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率(不提倡加在电泳液中)。

6.电泳缓冲液（0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。