从毛霉中提取蛋白酶

实验一：从毛霉中提取蛋白酶及分离方案

组员：周云线周丽玲陆江妙

1 实验原理

毛霉又叫黑霉、长毛霉接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中的一个大属。以孢囊孢子和接合孢子繁殖菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝，在高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好。毛霉常出现在酒药中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆豉。许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。工业中利用其蛋白酶以酿制腐乳、豆豉等。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。

酶活定义：在4 0℃， p H7.2条件下， 1分钟内水解酪蛋白产生 l微克酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位。蛋白酶水解络蛋白，其产物络氨酸能在碱性条件下使福林-酚试剂还原，生产钼蓝与钨蓝，在680nm下测定其吸光度，可求得蛋白酶活力。考马斯亮蓝是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，这种现象称为盐析。在蛋白质的盐析中，硫酸铵最为常用，这是由于硫酸铵在水中的溶解度最低而且温度系数小不影响酶活性，分离效果好。

2 仪器

恒温培养箱、振荡摇床、恒温振荡器、离心机、722分光光度计、pH计、恒温水浴锅

3培养基

斜面培养基PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL 煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10mL（视试管大小而定），121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

固体培养基：麸皮10g，水12mL，自然pH值，适量装入250mL三角瓶中，l2l℃灭菌30min后趁热及时摇散，备用。

液体培养基：蛋白胨20g、葡萄糖10g、氯化镁2g、磷酸二氢钾2g，250mL锥

形瓶装样量50mL，l2l℃灭菌30min，培养72h。

4 相关溶液

福林-酚试剂、标准酪氨酸溶液（1000mL）、pH7.2磷酸缓冲液（1000ml）、2%酪蛋白溶液（500mL）、0.4mol/L三氯乙酸溶液（1000mL）、0.4mol/L碳酸钠溶液（1000mL），0.2mol/LHCL（1000mL）、1mg/mL牛血清蛋白标准溶液

考马斯亮蓝染色液：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

5 方法

（1）孢子菌悬液（血球计数板计数，106个/mL），斜面培养基培养48h后，用5mL生理盐水洗脱下孢子，将孢子菌悬液吸至无菌试管（无菌棉花或纱布过滤），梯度稀释法稀释至106个/mL。

（2）固体培养基培养三角瓶接入5%孢子菌悬液，28℃培养72h（每24小时翻动一次，用干净玻璃棒翻动并轻微搅打）。

（3）摇床培养，冷却后按5%接种量接入孢子菌悬液，150r/min ，28℃培养72h。

（4）粗酶液的制备

发酵液：将发酵好的液体培养物在3000rpm下离心20分钟，取上清液即为粗酶液。

固体培养基：将生长着毛霉的三角瓶加蒸馏水/0.3mol/L盐水/pH7.5缓冲液100mL拌匀，匀浆机搅拌破碎，40℃恒温水浴锅内浸泡1h，过滤，即得粗酶液。加蒸馏水100mL拌匀，置于40℃恒温水浴锅内浸泡1h，取出后用四层纱布过滤得粗酶液，供测定酶活用。

（5）蛋白酶活力的测定

①标准曲线的绘制取九支试管按下表将标准络氨酸溶液进行稀释。

从上述各试管中各取1mL,分别加入5mL0.4mol/L碳酸钠溶液、1mL福林-酚试剂，于40℃水浴中显色20min,在680nm波长下测定吸光度，绘制标准工作曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当于的络氨酸质量（μg）（即为K值）。

②蛋白酶活力的测定取4支10mL离心管，分别加入1mL稀释酶液，其中1支为空白管，3支为平行试管。置于40℃水浴中预热3～5min，在3支平行试验试管中分别加入1mL2%络蛋白溶液，准确计时保温10min。立即加入2mL0.4mol/L 三氯乙酸溶液，15min后离心分离或用滤纸过滤。分别吸取1mL清液，加5mL0.4mol/L碳酸钠溶液，最后加入1mL福林-酚试剂，摇匀，置于40℃水浴中

显色20min。空白试管中先加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，，再加入1mL2%络蛋白溶液，15min后离心分离或用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。以空白管为对照，在680nm波长下测定吸光度，取其平均值。

计算：蛋白酶活力=(K×A×4×N)/(10×m)

式中：K—在40℃、pH7.2条件下，单位质量的酶粉1min水解络蛋白为络氨酸的蛋白酶活力；A—平行试验管的平均吸光度；4—李希光中反应液的总体积，mL；10—反应时间，min；N—稀释倍数；m—酶粉称取量，g。

(6)蛋白质测定方法

①

以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

②样品中蛋白质含量的测定取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。然后利用标准曲线求出样品蛋白质含量。

（7）蛋白酶反应最适pH 将蛋白酶液与酪蛋白溶液置于不同pH值的磷酸钠缓冲液中，在40℃下测酶活力，以确定最适pH。（鉴定为酸性、中性、还是碱性蛋白酶）

（8）蛋白酶初步纯化

①硫酸铵分级沉淀取一定体积的粗酶液，分成8份，在冰水浴中缓慢加入固体硫酸铵至饱和度为30%、40％、50%、60%、70%、80%、90%，充分溶解后离心，分别测定上清液和沉淀酶活，绘制硫酸铵盐析曲线。

②透析 4℃下透析24小时，测定酶活和总蛋白含量。把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段。在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。用蒸馏水彻底清洗透析袋。放在1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套。用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50％是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，

可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。