发酵中试操作规程

发酵中试操作规程

一.灭菌操作

（一）准备

1.打开控制器电源、电脑电源后，控制系统自动打开；

2.检查所有阀门是否关闭，盖紧罐盖上各种盖帽，旋紧罐盖上压紧螺栓；

3.预先启动蒸汽发生器及空气压缩机，将控制器中的温度控制设置为手动。

4.标定pH、DO电极，将电极插入罐体侧面的传感器口并及时的锁紧螺母，确保安装妥当防止高压下传感器弹出伤人。将从罐体传感器口取下的不锈钢塞放到指定位置。

5.确定发酵罐底阀已经关紧，倒入培养基，调整pH值，加消泡剂，旋紧投料口。注：氯离子对不锈钢会带来不可逆转的破坏，因此应避免用盐酸溶液调节pH，如工艺上无法避免加盐酸，应控制盐酸溶液浓度不大于5%且在添加过程中不得直接接触不锈钢。

（二）培养基预热

1.打开排气阀，打开夹套冷凝水阀排尽夹套水，关闭其它阀门。拔掉冷凝器的出水管，以防冷凝器中水受热膨胀。

2.启动反应器搅拌马达。调转速100~200Rpm.（注意：开启搅拌时，应先按下搅拌开关，再设置好转速，最后将控制方式改为“自动”）

3.蒸汽进夹套：缓缓打开夹套蒸汽阀蒸汽进夹套（注意：此时有轻微爆破声属正常，如声音过响，则开阀的速度应减慢）。待排水总口排出蒸汽时调节冷凝水阀，控制蒸汽排出量以有少量蒸汽冒出即可，并控制夹套内压力不超过0.2Mpa。当培养基预热至98℃时，进入灭菌操作。在培养基温度在80~90℃时可以适当的减慢升温速度，在本温度区域可以杀灭大部分的微生物。

4.蒸汽进取样阀: 打开出料阀 (关紧底阀),打开罐底蒸汽阀,蒸汽进入取样阀内腔,当出料阀排尽冷凝水后应调节其开度,以有少量蒸汽排出即可。

（三）灭菌

1.蒸汽进过滤器：关闭夹套蒸汽，适当降低搅拌速率，微开过滤器上的两个排冷凝水阀，打开过滤器前蒸汽阀，缓缓打开空气管线切断阀，让蒸汽进入罐体，当空气过滤器上两个冷凝水阀出口冷凝水很少时，调节这两个冷凝水阀以有少量蒸汽排出为宜。当排气口有蒸汽排出或罐温到达100℃两分钟后，关闭排气阀。打开底阀，蒸汽进罐(开阀时观察视镜处培养基翻动的变化，以有少量的变化为宜）.当罐温达到100℃以上时,培养基中的溶氧接近零,可以标定溶氧的零点。

2.当达到预定温度（121℃）或罐压，开排气阀至有蒸汽排出，打开接种阀，打开冷凝水阀，根据罐压或罐温变化的趋势，及时调节蒸汽阀。阀门调节宜微调应避免大幅度开关。当反应器罐压或罐温维持在预定的范围内开始计时。

3.保温开始后，排气阀蒸汽排量不宜太小，否则可能导致液面以上的罐体部分尤其罐盖达不到消毒温度。

4.移种管线消毒(适用于多级发酵)

在保温过程中打开移种管线阀及发酵罐受种阀，保温结束前关闭受种阀和移种管线阀。

（四）灭菌完成及降温（先开后关，后开先关）

1.关闭冷凝水阀，旋紧接种口，旋紧底阀，再关紧取样器的蒸汽阀。旋紧出料阀。

2.关紧夹套蒸汽及夹套排水阀，关紧空气管线切断阀及冷凝水阀，关紧过滤器前蒸汽阀，全开空气阀，空气经过滤器进入发酵罐。

3.当温度降至90℃以下后，在控制器中将温度设定为预定温度并将控制方式设定为“自动”，发酵罐进入自动降温。适当调高搅拌转速。

4.在降温过程中，始终监视罐压，严禁压力掉零。当温度到达工艺要求时，调节搅拌转速、空气流量、开空气进罐底阀，调整罐压、标定溶氧电极斜率及校正pH电极的零点。

注意事项：

1.消毒前必须排尽排气冷凝管中的水；

2.消毒后，空气应缓缓通入过滤器；

3.操作过程中不要面对有蒸汽喷出的管口，以免被烫伤。

二.发酵操作

（一）准备

1.溶氧电极标定:调节空气流量、罐压、搅拌转速、罐温（为了保证工艺参数的可比性，建议上面四参数维持一个固定值），待所有参数稳定后，标定溶氧电极斜率为100%，

2.pH电极零点校正:高温消毒后pH电极的零点或多或少都会发生漂移,应预校正。取样用外源pH电极精确测定培养基的pH值，根据精确测定值与在线的pH 值的差值在标定菜单中直接修改零点，使在线值等同精确测量值。

（二）接种：

1.摇瓶倒种:调节进气量至0.2VVM，开排气阀至罐压接近零（不得大于0.02Mpa），预先旋松接种口，在接种口处放好酒精棉并点燃，打开接种口，倒入种子，然后旋紧接种盖，立即调高罐压。最后将酒精棉，摇瓶等及时清理掉。

2.差压移种:

移种管线消毒:检查受种阀并关紧,开冷凝水阀，开种子罐出料阀，开移种管线蒸汽阀，开移种管线切断阀，当管道冷凝水排尽后调节冷凝水阀以有少量蒸汽排出为宜。消毒30分钟后，关紧冷凝水阀，关紧蒸汽阀，并立即开受种阀，用发酵罐中的空气对移种管线进行保压。等移种管线冷却后就可以移种。

差压移种：调整种子罐与发酵罐的压力，维持种子罐罐压大于发酵罐罐压约0.05Mpa,开种子罐罐底阀，种液进入发酵罐。移种结束必须立即关紧受种阀，并调高发酵罐罐压。移种管线应及时用蒸汽清洗，防止堵塞，操作同移种管线的灭菌操作。

3.接种后，开排气过滤器的冷凝器冷却水。

（三）发酵开始前设定发酵参数

1.发酵初始化：

接种后立即通知项目组长或者管理员，在控制器的发酵罐状态画面输入“发酵批号”，将发酵开始时间和结束时间都点击为当前时间，输入“发酵说明”可作为发酵备忘注解，最后点击“发酵”，发酵数据才能自动保存。

2.设定发酵过程参数及适宜的控制模式：

根据发酵工艺，设定具体参数和控制模式（温度、pH、转速、消泡控制、补料控

制、溶氧与转速关联、溶氧与补料关联、pH与补料关联等）

注意：1.控制器有三个用户名OPE、MON、SYS，其中OPE密码为111，可以修

改和设置一般的参数，如设定值和报警值等。MON、SYS享有所有操作权限，密码只对项目组长公开。

2.操作人员在控制器的查看、修改等工作结束后，必须注销用户，以防各种原因导致鼠标移动引起发酵参数的改变。

（四）补料

1.将经灭菌消毒的补料瓶及输液管放置于搁架上，用手动方式转动蠕动泵泵头，将输液管沿蠕动泵转动方向嵌入蠕动泵内。并用蠕动泵壳内的夹子夹紧软管。

2.旋下补料口上闷头，用酒精棉球对补料口内橡胶塞外表面消毒，然后将针头插入并穿透密封盖，并用补料针上的螺母锁紧。

3.打开蠕动泵手动开关，使输液管中充满料液。置蠕动泵开关于自动状态。根据发酵工艺要求设定控制方式及控制周期和脉冲。

4.酸碱液、消泡剂操作同补料操作

补料方式有多种,应根据工艺要求选用恰当的补料方式。

注意：

1.补料口内的橡胶塞最多使用两次以后更换。

2.取下的补料口闷头等配件及时放到指定位置，操作完成后清理好现场。

（五）取样

1.取样器消毒：半开出料阀，开蒸汽阀，，蒸汽进入取样器，消毒时间5-10分钟。

2.关蒸汽阀，全开出料阀，准备取样。

3.逆时针转动取样阀手柄，进行取样。回转手柄，取样结束。

4.开蒸汽阀，冲洗取样器，，关闭蒸汽阀。取样结束。

注意：开启蒸汽阀的时候，不要面对取样口，以免蒸汽被喷出的蒸汽烫伤。（六）放罐

放罐提前通知项目组长或管理员，项目组长将放料是通过底部放料口放料，转动手柄开阀P01即可放料。若需收集无菌料操作同取样操作。

发酵结束：发酵结束必须在控制器在控制器的发酵罐状态画面按“正在发酵”并“确认”后显示“发酵结束”，发酵数据将自动整理并保存。

注意事项：

发酵过程应经常开空气过滤器排水阀V12、V13排冷凝水，根据空气含水工况调整开阀的频率。

发酵结束后应及时关紧空气管线阀A13、A14,防止空气过滤器被污染.