微生物药物

微生物药物——抗生素

药物和保健品是人类战胜疾病和提高生活质量的重要物质资源。随着人类人口的急剧增长环境恶化和人类无知地滥用药物使病原微生物的抗药性空前提高，人类面对的疾病威胁、疾病种类都在日益增多，甚至许多疾病前所未有，对许多疾病甚至一无所知，且无药可治。原有效的药物急剧变得低效甚至无效，也无药可替。另一些原已基本消灭的疾病近年又卷土重来。因此利用微生物及其产物提高人类的生存质量，减少疾病，和开发微生物药物资源，用于各种疾病的治疗，对于推动人类社会的文明进步具有重大意义。目前，国内外都在利用现代生物技术尤其是微生物技术，或对已知的各种药物进行改造，以提高疗效或适应更为广泛的疾病治疗，或开发新的药物和保健品，扩大药物资源。

（一）、抗生素的特点

1 、抗生素作用的特点

抗生素是微生物的次生代谢产物，既不参与细胞结构，也不是细胞内的贮存性养料，对产生菌本身无害，但对某些微生物有拮抗作用，是微生物在种间竞争中战胜其他微生物保存自己的一种防卫机制。抗生素具有不同于化学药物的特点：

（ 1 ）抗生素则能选择性地作用于菌体细胞DNA 、RNA和蛋白质合成系统的特定环节，干扰细胞的代谢作用，妨碍生命活动或使停止生长，甚至死亡。而不同于无选择性的普通消毒剂或杀菌剂。抗生素的抗菌活性主要表现为抑菌、杀菌和溶菌三种现象。这三种作用之间并没有截然的界限。抗生素抗菌作用的表现与使用浓度、作用时间、敏感微生物种类以及周围环境条件都有关系。

（ 2 ）抗生素的作用具有选择性，不同抗生素对不同病原菌的作用不一样。对某种抗生素敏感的病原菌种类称为该抗生素的抗生谱（抗菌谱）。例如淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavadulae）产生的卮立霉素只对少数病毒有医疗作用，对细菌、真菌和其他多数病毒都没有作用。广谱抗生素对多种病原菌有抗生作用，例如青霉素对多种革兰氏阳性细菌都有良好药效，链霉素对多种革兰氏阳性和阴性细菌都有良好药效，对结核杆菌有特殊的疗效。

（ 3 ）有效作用浓度。抗生素是一种生理活性物质。各种抗生素一般都在很低浓度下对病原菌就发生作用，这是抗生素区别于其他化学杀菌剂的又一主要特点。各种抗生素对不同微生物的有效浓度各异，通常以抑制微生物生长的最低浓度作为抗生素的抗菌强度，简称有效浓度。有效浓度越低，表明抗菌作用越强。

有效浓度在100 mg/L以上的属作用强度较低的抗生素，有效浓度在l mg/L以下是作用强度高的抗生素。

2 、抗生素作用机制

据研究抗生素的作用位点大致有以下几种：有的抑制细胞壁的形成，有的影响细胞膜的功能，有的干扰蛋白质的合成，有的阻碍核酸的合成等。

（ 1 ）、抑制细胞壁的合成有些抗生素如青霉素、杆菌肽、环丝氨酸等能抑制细胞壁肽聚糖的合成。细胞壁肽聚糖的N-乙酰胞壁酸上的短肽链带有四个氨基酸（即L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-赖氨酸、D-丙氨酸）的一条四肽链。而青霉素的内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构很相似，从而能够占据D-丙氨酸的位置与转肽酶结合，并将酶灭活，肽链彼此之间无法连接，因而抑制了细胞壁的合成。又如多氧霉素（Polyoxin) 是一种效果很好的杀真菌剂，其作用是阻碍细胞壁中几丁质的合成，因此对细胞壁主要由纤维素组成的藻类就没有什么作用。

（ 2 ）、影响细胞膜的功能某些抗生素，尤其是多肽类抗生素如多粘菌素、短杆菌素等，主要引起细胞膜损伤，导致细胞物质泄漏。如在多粘菌素分子内含有极性基团和非极性部分，极性基团与膜中磷脂起作用，而非极性部分则插入膜的疏水区，在静电引力作用下，膜结构解体，菌体内的重要成分如氨基酸、核苷酸和钾离子等漏出，造成细菌细胞死亡。作用于真菌细胞膜的大部分是多烯类抗生素，如制霉菌素、两性霉素等。它们主要与膜中的固醇类结合，从而破坏膜的结构引起细胞内物质泄漏，表现出抗真菌作用。

（ 3 ）、干扰蛋白质合成能干扰蛋白质合成的抗生生种类较多，它们都能通过抑制蛋白质生物合成来抑制微生物的生长，而并非杀死微生物。不同的抗生素抑制蛋白质合成的机制不同，有的作用于核糖体30 S亚基，有的则作用于50 S亚基，以抑制其活性。

（ 4 ）、阻碍核酸的合成这类抗生素主要是通过抑制DNA或RNA的合成而抑制微生物细胞的正常生长繁殖。如丝裂霉素通过与核酸上的碱基结合，形成交叉连结的复合体以阻碍双链DNA的解链，影响DNA的复制。博莱霉素可切断DNA的核苷酸链，降低DNA分子量，干扰DNA的复制。利福霉素能与RNA 合成酶结合，抑制 RNA 合成酶反应的起始过程。放线菌素D能阻止依赖于DNA 的RNA合成。

3 、抗生素的分类

目前已知的抗生素种类很多，根据其化学结构可把抗生素分为以下九大类：①β-内酰胺类抗生素，其分子中含β-内酰胺环，如青霉素、头孢菌素C。②氨

基糖苷类抗生素，以氨基环醇为中心的衍生物，与氨基糖或戊糖组成聚三糖或聚四糖，如链霉素、卡那霉素、春雷霉素、井岗霉素。③大环内酯类抗生素，分子中含有一个大环内酯作为配糖体，以糖苷键和l~3个分子的糖相连，如红霉素、夹竹桃霉素、麦迪霉素、稻瘟霉素。④多肽类抗生素，由多种氨基酸经肽键缩合而成，如多粘菌素、杆菌肽。⑤多烯大环内酯类抗生素，分子中含3~7个双键的大环内酯，有的含糖，有的不含糖，如制霉菌素、两性霉素。⑥芳香族类抗生素，分子中含有苯环衍生物，如氯霉素、灰黄霉素。⑦蒽环类抗生素，这类抗生素是以蒽环酮为配基，在7或10位与一种或多种不同糖相连的糖苷类化合物。⑧四环素类抗生素，其分子中含四环结构，酸碱两性物质，这类抗生素是四环素、土霉素、金霉素等抗生素的总称。⑨其他抗生素，如放线菌酮、庆丰霉素、磷霉素等。

（二）、耐药性菌株及其产生

一种抗生素对它的敏感对象是通过一定的抗菌机制起作用的，但由于长期使用某一种抗菌药物，会使微生物产生对药物的适应性或称抗性。例如葡萄球菌的有些菌株能抗青霉素就是由于细菌的遗传变异，产生了能形成青霉素酶的突变株，青霉素可被青霉素酶（β-内酰胺酶）降解而失效。在青霉素G开始应用于医疗实践时，绝大多数葡萄球菌对它是敏感的，但现在几乎所有的医院里都能分离到抗青霉素的葡萄球菌。青霉素的用药剂量也从几个单位剧增到现在的80万甚至100万单位。

很多抗性菌株是由于带有特定抗性基因的质粒（R质粒）通过交配转移即基因的水平漂移而产生的，有的菌株可以接受多种R质粒而成为多抗性菌株，它们不仅会使抗生素医疗带来困难，而且有可能继而成为一种新的威胁即无药可治。

药品微生物限度检验方法标准操作规程

标准操作规程目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。责任者：QC主任、化验员。规程：本规程引至《中国药典》2000年版。 1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。 2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。 3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。 4. 检查： 4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。 4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。使用设备、仪器、人员及无菌操作室常用的消毒、灭菌方法见本文附录二。除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。标准操作规程

4.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25－28℃，控制菌培养温度为36±1℃，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。 4.4. 复检 4.4.1. 菌数测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。 4.4.2. 以复试项下不合格项目为准，作单项复试。复试需另取同批号样品，测定2次。 4.4.3. 复试报告，以3次测定结果的算术平均值报告。 4.5. 检验报告 4.5.1. 检验报告以1g、1ml或10cm2为单位。 4.5.2. 测定菌数报告，以每次测定结果全部平均值报告。 4.5.3. 控制菌按检验结果报告，如未检出控制菌时，报告为“按规定抽样检验结果未检出XX菌”，如抽样中任意一样品要检出控制菌时，报告为“按规定抽样，检出XX菌，不符合药品微生物限度标准。” 4.6. 培养基、试药及稀释剂的相关内容见本文件附录三。 4.7. 供试液的制备：按供试液的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。 4.7.1. 供试品的取样及注意事项供试品取样应有一定数量，以使检验结果具有代表性，正常的供试品一般每批应随机抽取两瓶或两盒以上的包装单位，检验时每次应分取两瓶(盒)以上的样品共10g或10ml。供试品在检验前，应严格保持包装的原有状态，不得启开，并放在阴凉干燥处，防止微生物再繁殖，以免影响检验结果，凡已将原包装启开，则无代表性应另取样。供试品稀释后须在1－2小时内操作完毕，防止微生物繁殖或死亡。供试品稀释成供试液后，应在均匀状态下取样，凡因抑菌或不溶于水的剂型，其供试品应作特殊处理后进行检验。 4.7.2. 液体供试品：取供试品10ml，加入稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。油剂可加适量聚山梨酯80，混匀，吸取相当于10g或10ml供试品，标准操作规程再稀释成100ml作为供试液；合剂（系指含王桨或蜂蜜者，下同）可用供试品作为供试液。 4.7.3. 固体、半固体或黏稠液供试品：称取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其他适宜的方法混匀后作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超过45℃。（1）非水溶性供试品：取供试品5g（5ml）加入含溶化的无菌司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的0.9%无菌氯化钠溶

药品微生物限度检验方法标准操作规程

标准操作规程目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。责任者：QC主任、化验员。规程：本规程引至《中国药典》。 1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。 2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药

品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。 3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。 4. 检查： 4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。 4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。使用设备、仪器、人员及无菌操作室常见的消毒、灭菌方法见本文附录二。除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。标准操作规程 4.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25－28℃，控制菌培养温度为36±1℃，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。 4.4. 复检

非无菌药品微生物限度检查指导原则

附录×××非无菌药品微生物限度检查指导原则为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（附录×××）、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（附录×××）及非无菌药品微生物限度标准(附录×××)，特制定本指导原则。非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低，甚至使药品丧失疗效，从而对患者健康造成潜在的危害。因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节中，药品生产企业应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。非无菌产品微生物计数法、控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非规定无菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。 1.非无菌药品微生物限度检查中，受控的洁净环境是指不低于GMP现行版要求的D级洁净环境。 2. 非无菌药品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外,还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出(即无毒性)，因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。 3.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法,同时,所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品,在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。 4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。 5.进行微生物计数方法适用性试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行,

药品微生物限度检查结果影响因素分析及控制方法

药品微生物限度检查结果影响因素分析及控制方法文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]

药品微生物限度检查结果影响因素分析及控制方法 blueski推荐?[2010-3-4] 出处：来自网上作者：房宇辉董艳丽 ? 摘要：微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查，是对生产单位所用的药品原料、器具设备、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生评价的综合依据。由于微生物限度检查程序繁琐，操作严格，检查周期长，干扰因素多等原因都会造成检验结果误差，这样难......微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的检查方法，包括染菌量及控制菌的检查，是对生产单位所用的药品原料、器具设备、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生评价的综合依据。由于微生物限度检查程序繁琐，操作严格，检查周期长，干扰因素多等原因都会造成检验结果误差，样难以对生产做出系统、科学的管理。现就微生物检查时，容易引起误差的几方面原因以及控制方法分析如下。 1 实验者主观因素及操作技能中的误差

1.1 无菌观念淡薄一些操作者认为，微生物限度范围定得宽，多几个、少几个菌对结果影响不大，因此操作马虎、随意，这样容易造成供试品的再次污染以及已污染菌的繁殖及死亡，从而不能真实的反映供试品的染菌情况。因此每一个检验者应明确的了解，在检验过程中的每一个环节，每个空间，每个操作，每个工具及材料，没灭菌者都是带菌者，都会对检验结果产生不确定影响，因而应牢固的建立无菌观念。 1.2 操作技能中误差一些操作者在操作不熟练，及实验条件控制不严格，细节不够注意，每次操作前的消毒处理必须彻底，不得留有死角，对实验所用器具根据材料的性质进行相应的灭菌;开启供试品包装的工具，如剪刀、砂轮等也应消毒，实验用的器具如吸管应清洗干净，灭菌，放液时不得接触液面，每ml样品必须放尽，否则影响细菌记数的准确性;这些细小环节都有可能污染供试品的可能，使平皿染菌数增多，导致实验误差，所以应该对实验每个环节都要考虑，分析，根据本单位具体情况建立个系统、科学的操作规范（SOP），正确熟练的掌握无菌技术及操作规范是准确完成检验结果、得出可靠结论的基本条件。 2 操作环境不符合要求带来的误差按无菌要求，无菌室应由无菌操作间和两个缓冲间组成，操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，操作间和缓冲间的门不应直对;操作间内不应安装下水道，无菌室的照明灯应嵌装在天花板内，室内六壁应光滑平整，能耐受清洗消毒;无菌室的温湿度和洁净级别应准确无误，并有相应的检测设备，由于条件限制，一些单位的无菌室在设计上不符合要求，

(2015版药典)非无菌药品微生物限度检查操作规程

1.目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确。 2.适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品。 3. 责任者：QC检验员、QC经理。 4. 正文： 4.1 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 4.1.1 简述微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 4.1.2计数方法

计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 4.1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。表1 试验菌液的制备和使用

微生物限度标准

药品微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。药品生产、贮存、销售过程中的检验，化学药品原料药、中药提取物及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。非无菌制剂的总需氧菌数、总霉菌及酵母菌数测定照附录×××检查；非无菌制剂的控制菌检查照附录×××检查。本限度标准解释如下： 101CFU：最大可接受限值＝20； 102CFU：最大可接受限值＝200； 103CFU：最大可接受限值＝2000。以此类推。 1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。 2.口服给药制剂 2.1 不含药材原粉的口服给药制剂需氧菌总数每1g不得过103cfu。每1ml不得过102cfu。霉菌及酵母菌总数每1g不得过102cfu。每1ml不得过101cfu。大肠埃希菌每1g或1ml不得检出。沙门菌含脏器提取物的口服给药制剂每10g或10ml不得检出。 2.2含药材原粉的口服制剂 2.2.1不含豆豉、神曲等发酵原粉的口服给药制剂需氧菌总数每1g不得过10000cfu。每1ml不得过100cfu。霉菌及酵母菌总数每1g或1ml不得过100cfu。大肠埃希菌每1g或1ml不得检出。沙门菌每10g或10ml不得检出。耐胆盐革兰阴性菌每1g应小于102个。每1ml应小于101个。 2.2.2 含豆豉、神曲等发酵原粉的口服制剂需氧菌总数每1g不得过100000cfu。每1ml不得过1000cfu。

霉菌和酵母菌总数每1g不得过500cfu。每1ml不得过100cfu。大肠埃希菌每1g或1ml不得检出。沙门菌每10g或10ml不得检出。耐胆盐革兰阴性菌每1g应小于102个。每1ml应小于101个。 3.局部给药制剂 3.1 用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。3.2 黏膜、齿龈、鼻及呼吸道吸入给药制剂需氧菌总数每1g、1ml或10cm2不得过102cfu。霉菌和酵母菌总数每1g、1ml或10cm2不得过101cfu。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、1ml或10cm2不得检出。大肠埃希菌每1g或1ml或10cm2不得检出。耐胆盐革兰阴性菌呼吸道吸入给药制剂，每1g或1ml不得检出。 3.3 耳、皮肤给药制剂需氧菌总数每1g、1ml或10cm2不得过102cfu。霉菌和酵母菌总数每1g、1ml或10cm2不得过101cfu。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、1ml或10cm2不得检出。 3.4 阴道、尿道给药制剂需氧菌总数每1g、1ml或10cm2不得过102cfu。霉菌和酵母菌总数每1g、1ml或10cm2应小于10cfu。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌每1g、1ml或10cm2不得检出。梭菌中药制剂每1g、1ml或10cm2不得检出。 3.5 直肠给药制剂需氧菌总数每1g不得过103cfu。每1ml不得过102cfu。霉菌和酵母菌总数每1g或1ml不得过102cfu。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g 或1ml不得检出。 3.6其他局部给药制剂 3.6.1不含药材原粉的其他局部给药制剂需氧菌总数每1g、1ml或10cm2不得过102cfu。霉菌和酵母菌总数每1g、1ml或10cm2不得过102cfu。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、1ml或10cm2不得检出。

非无菌药品微生物限度标准

2020版中国药典非无菌药品微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原料、辅料、中药提取物及中药饮片的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。 1.制剂通则、品种项下要求无菌的及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。 2.用于手术、严重烧伤、严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。 3.非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准见表1 。 4.非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准见表2。

5.非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准见表3。 6.中药提取物及中药饮片的微生物限度标准见表4。

7.有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准。 8.除中药饮片外，非无菌药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）”检查；非无菌药品的控制菌照“非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）”检查。各品种项下规定的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数标准解释如下：101cfu：可接受的最大菌数为20；102cfu：可接受的最大菌数为200；103cfu：可接受的最大菌数为2000；依此类推。中药饮片的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数及控制菌检查照“中药饮片微生物限度检查法”（通则1108）检查；各品种项下规定的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数标准解释如下：101cfu：可接受的最大菌数为50；102c￡u：可接受的最大菌数为500；103cfu：可接受的最大菌数为5000；104cfu：可接受的最大菌数为50000；依此类推。 9.本限度标准所列的控制菌对于控制某些药品的微生物质量可能并不全面，因此，对于原料、辅料及某些特定的制剂，根据原辅料及其制剂的特性和用途、制剂的生产工艺等因素，可能还需检查其他具有潜在危害的微生物。 10.除了本限度标准所列的控制菌外，药品中若检出其他可能具有潜在危害性的微生物，应从以下方面进行评估。药品的给药途径：给药途径不同，其危害不同；药品的特性：药品是否促进微生物生长，或者药品是否有足够的抑制微生物生长能力；药品的使用方法；用药人群：用药人群不同，如新生儿、婴幼儿及体弱者，风险可能不同；患者使用免疫抑制剂和甾体类固醇激素等药品的情况；存在疾病、伤残和器官损伤；等等。 11.当进行上述相关因素的风险评估时，评估人员应经过微生物学和微生物数据分析等方面的专业知识培训。评估原辅料微生物质量时，应考虑相应制剂的生产工艺、现有的检测技术及原辅料符合该标准的必要性。

非无菌药品微生物限度标准

附录×××非无菌药品微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原料、辅料及中药提取物的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。 1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。 2.用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。 3. 非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表1）表1 非无菌不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准给药途径需氧菌总数（CFU/g、 CFU/m 或CFU/10cm2）霉菌及和酵母菌总数（CFU/g、 CFU/m 或CFU/10cm2）控制菌口服固体给药制剂103102不得检出大肠埃希菌（1g）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10g）口服液体给药制剂102101不得检出大肠埃希菌（1ml）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10ml）口腔黏膜给药制剂齿龈给药制剂鼻用制剂102101 不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）耳用制剂皮肤给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）呼吸道吸入给药制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰阴性菌（1g或

1ml）阴道、尿道给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、梭菌（1g、1ml或10cm2）直肠给药固体制剂液体制剂103 102 102 102 不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g或1ml）其他局部给药制剂102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或 10cm2） 4. 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表2）表2非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准给药途径需氧菌总数（CFU/g、 CFU/mL 或CFU/10cm2）霉菌和酵母菌总数（CFU/g、 CFU/mL 或CFU/10cm2）控制菌固体口服给药制剂不含豆豉、神曲等发酵原粉含豆豉、神曲等发酵原粉104（丸剂3×104） 105 102 5×102 不得检出大肠埃希菌（1g）；不得检出沙门菌（10g）；耐胆盐革兰阴性菌应小于102 （1g）。液体口服给药制剂不含豆豉、神曲等发酵原粉含豆豉、神曲等发酵原粉 5×102 103 102 102 不得检出大肠埃希菌（1ml）；不得检出沙门菌（10ml）；耐胆盐革兰阴性菌应小于101 （1 ml）固体局部给药制剂用于表皮或黏膜不完整103 102 不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g或 10cm2）；阴道、尿道给药制

非无菌产品微生物限度标准

湖南湘大兽药有限公司工作标准文件题目非无菌产品微生物限度检查标准操作规程编号ZLJG F-048-00 修定质检部审核批准修定日期2016.12 审核日期批准日期颁发部门GMP办公室颁发数量 2 份生效日期分发部门质检部、档案室文件页数共13页一、目的：为规定非无菌产品微生物限度检查标准的检测方法和操作要求，特制定本操作规程。二、引用标准：中华人民共和国兽药典（2015年版一部附录P195）。三、适用范围：适用于本公司检品采用非无菌产品微生物限度检查标准的质量检测。四、责任者：理化分析员对本标准的实施负责。五、正文： 1 简介非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原料、辅料及中药提取物的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准（见表1）表1 非无菌兽药制剂的微生物限度标准给药途径需氧菌总数（cfu/g、cfu/ml 或 cfu/10cm2）霉菌和酵母菌总数（cfu/g、cfu/ml 或cfu/10cm2）控制菌口服给药① 固体制剂液体制剂103 102 102 101 不得检出大肠埃希菌（1g或1ml）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10g或10ml）

2010年版《药典》微生物限度标准

《中国药典》2010年版二部附录XI J （附录115页）《微生物限度检查法》微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者健康潜在的危害而制订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。 1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。 2.口服给药制剂细菌数每1g不得过l000CFU 。每lml 不得过100CFU 。霉菌和酵母菌数每lg或lml 不得过100CFU 。大肠埃希菌每1g 或lml不得检出. 3 ．局部给药制剂 3.1用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。 3.2 耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂细菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过100CPU 。霉菌和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过10CPU 。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml 或l0cm2不得检出。大肠埃希菌鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、lml 或l0cm2，不得检出。 3.3 阴道、尿道给药制剂细菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过100CFU 。霉菌数和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2应小于10CFU 。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌每1g、lml 或l0cm2，不得检出。 3 . 4 直肠给药制剂细菌数每1g不得过l000CFU。每lml 不得过100CFU 。霉菌和酵母菌数每1g 或lml 不得过100CFU 。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每lg 或lml 不得检出。 3.5 其他局部给药制剂

非无菌产品微生物限度检查标准

附录ⅪJ 非无菌药品微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。 1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。 2.用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。 3.非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准（见表1）表1 非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准给药途径需氧菌总数（CFU/g、 CFU/ml或 CFU/10cm2）霉菌及和酵母菌总数（CFU/g、 CFU/ml 或CFU/10cm2）控制菌口服固体给药制剂103102不得检出大肠埃希菌（1g）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10g）口服液体给药制剂102101不得检出大肠埃希菌（1ml）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10ml）口腔黏膜给药制剂齿龈给药制剂鼻用制剂102101 不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）耳用制剂皮肤给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）呼吸道吸入给药制剂102101 不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、

耐胆盐革兰阴性菌（1g或1ml）阴道、尿道给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌（1g、1ml或10cm2）直肠给药固体制剂液体制剂103 102 102 102 不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g或1ml）其他局部给药制剂102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或 10cm2） 4. 非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准（见表2）表2 非无菌药用原料及辅料微生物限度标准需氧菌总数（CFU/g 或 CFU/ml）霉菌和酵母菌总数（CFU/g或 CFU/mL）控制菌药用原料及辅料103102* 注*：限度未做统一规定。 5.有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准。 6.霉变、长螨者以不合格论。非无菌药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（附录ⅪM）检查；非无菌药品的控制菌照“非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”（附录ⅪN）检查。各品种项下规定的微生物限度标准解释如下： 101cfu：可接受的最大菌数为20； 102cfu：可接受的最大菌数为200；

微生物限度检查方法的验证

包括: 1.细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证——准确性（回收率） 2.控制菌检查法的验证——专属性 3.实例一、细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 1.验证的目的：确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定。照此检查法和检验条件进行供试品细菌、霉菌、酵母菌数检查能保证检验结果的准确、可靠。 2.验证的步骤： ?根据样品特性，制定检验方法和检验条件。 ?保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试验要求。 ?按制定的方法进行试验。 ?根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 3. 验证用菌株：细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。

菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌量:50～100cfu。 4.验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、中和法、离心沉淀法、联合方法。 5.样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。 6.培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。 7.菌液制备 (1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。 (2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。 (3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。 8.供试品的处理：固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml 抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或薄膜过滤。

非无菌药品微生物限度检查操作规程

本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 4.1.2 计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 4.1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。

四国药典有关药品微生物限度标准的比较

四国药典有关药品微生物限度标准的比较微生物限度规定的作用，是为药品生产提供一个标准或指导，以确保药品使用的安全。各国药典标准分为强制性的和非强制性的可达到的限度标准，这些指标正确、有效地规范了药品生产、检定和监督的程序。药品要能反映不引起生物降解物和没有药源性污染的微生物存在是必要的，严格控制条件致病菌及致病菌。一、CP、USP、BP、JP的微生物限度要求的特点及其发展趋势 ⒈各国药典收载微生物限度检查法的时间不同(见表1) 表1 各国药典收载微生物限度检查法的时间 *1978年颁布第一个药品卫生标准；1986年颁布了修改的药品卫生标准；1989年下发药品卫生标准补充规定和说明，1995年版中国药典收载微生物限度检查法（标准仅为少数剂型） **品种98版43个，其中原料药品种38个，制剂品种仅5个。 ***仅有6个品种。 ⒉品种不断扩大 *217种包括原料药品种72个（占1/3）；制剂品种（占2/3）。 ⒊活菌数要求各有特点活菌数（个/1g或1ml）CP BP JP USP

需气菌102~3×104102~107102~10310~104 真菌0~102102~1055×10~5×10210~103⒋控制菌的要求各有特点 CP BP JP USP 大肠杆菌+ b + b+ b+ a 沙门菌+ b+a + b+ a 铜绿色假单胞菌+b+ b+ b+a 金黄色葡萄球菌+b+ b+ b+ a 破伤风杆菌+ b 梭菌+c 肠道菌及其他某些革兰阴性杆菌+ c 支原体+ 分枝杆菌+ 病毒的其他因子+ 活螨+ d a 10g或10ml样品不得检出。 b 1g或1ml 样品不得检出。 c 仅为个别品种要求10~103/1g或1ml。 *d 不列在剂型项内而以说明提出，意即不作为常规检查，如有检出，以不合格处理的依据。水1000ml/L。溶解以上成份，加入1~10g 吐温-20或吐温-80。121℃高压蒸汽灭菌30min。作用：可调节供试液pH至近中性，其中蛋白胨对菌细胞有保护作用，有利于菌数及控制菌的测定。吐温加入对含油性供试品的助溶具有作用。 ** USP、BP微生物限度（污染）检查用稀释剂，除磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲胨水外，尚采用以上两种培养基，直接稀释供试品并作增菌培养.。三、稀释剂的用量

微生物限度方法学验证

微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。二、菌种、培养基及稀释液表2培养基

表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）pH6.8缓冲液取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。（2）0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。（3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 0.5ml，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸

20ml徐徐滴入。三、菌液的制备 1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。四、验证内容 1、计数方法验证将制备好的菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液以每10倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，利用血球计数板计数，确定具体菌悬液浓度，取接近于10cfu-100cfu的稀释浓度，选取各项试验项下的规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完成。经过验证当原液稀释至10-6时，菌液浓度接近100cfu/ml。 2、适用性检查 2.1细菌、霉菌、酵母菌取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml(内含菌约50～100cfu)，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照。其大小、形态应与对照培养基一致，且数量应不小于对照培养基的70%。