脂肪酶发酵工艺
湖北大学
发酵工程与设备课程设计
题目脂肪酶的发酵工艺
专业年级08级生物工程
学生姓名文乐雷
学号2008221107100075
指导老师……..
2011 年 5 月 24 日
目录
1.脂肪酶的简介 (2)
1.1脂肪酶的定义 (2)
1.2脂肪酶催化的反应 (2)
1.3脂肪酶的结构特点 (2)
1.4脂肪酶的特性 (2)
1.5脂肪酶的来源 (2)
2.产脂肪酶菌株的筛选方法 (2)
2.1筛选路线 (2)
2.2初筛方法 (2)
2.3复筛方法—摇瓶培养 (3)
3.脂肪酶活力的测定 (3)
3.1酸碱滴定法 (3)
3.2对硝基苯酯法 (3)
4.产脂肪酶微生物的培养基及培养条件 (3)
5.脂肪酶生产的基本工艺流程图 (4)
6.南极假丝酵母生产脂肪酶 (4)
6.1菌种、培养基及试剂仪器 (4)
6.2发酵过程 (4)
6.3 脂肪酶的热稳定性和 pH稳定性测 (4)
6.4南极假丝酵母生产脂肪酶发酵条件研究 (4)
7.脂肪酶发酵生产过程 (5)
7.1分批发酵 (5)
7.2反复分批发酵 (5)
7.3补料分批发酵 (5)
7.4连续发酵 (5)
8.脂肪酶的固定化 (5)
8.1固定化脂肪酶的优、缺点 (5)
8.2脂肪酶固定化方法 (5)
9.双水相体系提取脂肪酶 (6)
9.1材料 (6)
9.2分析内容 (6)
9.3硫酸铵的定量分析 (6)
9.4试剂配制 (6)
9.5相图节线制作 (6)
9.6双水相体系制备 (6)
10.脂肪酶在食品工业中的应用 (6)
10.1三酰甘油水解 (6)
10.2 三酰甘油的改性 (7)
10.3催熟和发酵 (7)
10.4脂类合成 (7)
11.脂肪酶在其他方面的应用 (7)
11.1脂肪酶在纺织物中的应用 (7)
11.2脂肪酶的医学应用 (7)
11.3脂肪酶在生物柴油中的应用.....................................。7 11.4脂肪酶在生物传感器中的应用. (7)
11.5在环境保护中的应用 (8)
1、脂肪酶的简介
1.1脂肪酶的定义[1]
脂肪酶(EC3．1．1．3，Lipase) ,又称甘油酯水解酶 , 是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶。脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，只作用于异相系统，即只在油水界面上作用，而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或呈乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。
1.2脂肪酶催化的反应
反应方程式
酯的水解RCOOR’+H2O → RCOOH+R’OH
酯的合成RCOOH+R’OH←→ RCOOR’+H2O
酯交换反应RCOOR’+R”COORR”←→ COOR’+RCOOR
醇解反应RCOOR’+R”OH ←→ RCOOR”+R’OH
酸解反应RCOOR’+ R”COOH ←→ R”COOR’+RCOOH
1.3脂肪酶的结构特点
脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成，活性中心靠近分子疏水端。脂肪酶结构有 2个特点：( 1 )脂肪酶都包括同源区段：His—X—Y—Gly—Z ,Ser—W—Gly或Y—Gly—His—Ser—W—Gly(x、Y、w、Z是可变的氨基酸残基)；( 2 )活性中心是丝氨酸残基。
1.4脂肪酶的特性
位置专一性：是指酶对底物甘油三酯Sn-1(或3)和Sn-2酯键的识别和水解。
立体专一性一般是指酶对底物甘油三酯中立体对应结构的1位和3位酯键识别和选择性水解。如猪胰脂肪酶水解甘油三酯时没有1和3位立体选择性;人奶和牛奶中脂蛋白脂肪酶优先水解1位酯键。
1.5脂肪酶的来源[2]
脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中而微生物脂肪酶种类最多,广泛存在于细菌、酵母和霉菌中,最易获得和大规模生产,且具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性,因此是工业用脂肪酶的重要来源。
细菌脂肪酶细菌脂肪酶大多数是胞外酶易于液体深层发酵,生产比较容易。细菌脂肪酶大多数是碱性脂肪酶,且在pH4~11、温度30℃~60℃间具有良好的稳定性。假单胞菌属的细菌脂肪酶应用最为广泛。
真菌脂肪酶真菌脂肪酶具有温度和pH稳定性、底物特异性以及在有机溶剂中具有高活性，且提取成本比较低等优点，因而发展迅速。商业化的真菌脂肪酶主要有:黑曲霉,米曲霉等。
2.产脂肪酶菌株的筛选方法
2.1筛选路线
采样→富集培养→初筛→复筛→检测酶活→鉴定菌种→保藏菌种
2.2初筛方法
可淘汰85％一90％不符合要求的微生物，利用平皿的生化反应进行分离。
①Rhodamine B 平板筛选法
筛选原理：脂肪在脂肪酶的催化作用下水解生成甘油和脂肪酸，脂肪酸能与RhodamineB 的阳离子发生作用，生成黄色的荧光物质，所以用紫外灯的观察，产脂肪酶的菌株周围会出现荧光圈，依据荧光圈的大小进行菌种的筛选。
②溴甲酚紫平板筛选法
筛选原理：溴甲酚紫作为一种显色剂，其pH变色为5.2—6.8，在碱性条件下显紫色，在酸性条件下显黄色，脂肪在脂肪酶的催化作用下生成的脂肪酸会使培养基的pH降低，产脂肪酶菌株的周围会出现黄色的透明圈，根据透明圈的有无和大小来筛选产脂肪酶的菌株，透明圈越大说明产脂肪酶活力越强。
③琼脂块培养法
将分离培养基用灭菌的打孔器制作成许多单个的直径约0.6 cm 的小琼脂块, 排放在干净的培养皿内, 将挑选的菌株接种在这些小琼脂块上培养,让其充分生长, 然后依次再将长
满菌的小琼脂块放到酶活测定板上, 28℃培养1～ 3 d, 观察各菌落周围油脂水解圈的大小, 水解圈越大，酶活越强，将水解圈大的菌株纯化后保存在斜面培养基上。
2.3复筛方法—摇瓶培养
种子培养基→发酵培养基→收集菌体和上清液，分别测酶活。
3.脂肪酶活力的测定
3.1酸碱滴定法
反应体系：橄榄油聚乙烯醇乳化液，0.025M、pH7.5的磷酸缓冲液，0.05NNaOH标准液，1%酚酞指示剂酶液。
步骤：
①加5ml缓冲液+4ml乳化液于三角瓶中，40℃水浴中保温10min；
②加1ml酶液，40℃反应15min；
③15min后立即加入15mL95%的乙醇终止反应；
④加酚酞指示剂2-3滴后用NaOH滴定到微红色，在30s内不消失为滴定终点，记下碱的消耗量，重复两次取平均值；
⑤作对照：加缓冲液、底物后先加乙醇，在加酶液。
结果计算：单位/克=(A-B)*n*f/t*w
3.2对硝基苯酯法
反应体系：25mmol/L对硝基苯辛酸酯-异丙醇溶液，异丙醇-DMSO混合液，异丙醇：DMSO=2:1，100mmol/LTris-HCL缓冲液80mmol/LCaCL2溶液，酶液及灭活的酶液1%SDS 步骤：
①在试管中加入75ul异丙醇-DMSO、25ul底物、0.9ml缓冲液，100ulCaCL2溶液，37℃保温5min；
②五分钟后加入0.5ml酶液反应10min；
③10min后加入1ml1%SDS终止反应；
④作对照；
⑤用分光光度计测定OD；
⑥计算酶活。
4.产脂肪酶微生物的培养基及培养条件[3]
产脂肪酶微生物的培养基主要由碳源、氮源和无机盐离子组成。到目前为止，据有关文献报道，用作脂肪酶发酵的碳源通常为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、糖蜜、麦麸皮、小麦粉等碳水类化合物。当然也有例外，有报道称菌株 Acremonlum strictum的最佳碳源是木糖(Okeko，1990)，另有Geotrichum sp菌是利用油脂或者脂肪酸作为碳源；同时，大量研究表明：不同的微生物种类，在发酵生产脂肪酶时对碳源的选择存在明显的差别(陈守文，1998)(黄家岭，2008)。
Yoshitaka的研究表明，Fe2+、Fe3+能促进Alcaligenes sp产酶，而Ba2+、C02+则对其产酶活性则没有任何影响；据朱明华报道，无机离子K+、Na+、Mg2+、ca2+等对假单胞茵产脂肪酶活性具有促进作用，而Mn2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+、C02+、Cu2+等则对该菌产脂肪酶活性具有抑制作用(朱明华，1991)。另外，同种微量元素，不同浓度对菌株产酶活性的影响也不同，陶文沂报道称微量Ca2+可促进地霉产酶活性增强，而高浓度时则表现为抑制作用(陶文沂，1990)。
产脂肪酶微生物的常用氮源为黄豆饼粉、蛋白胨i牛肉膏、酵母粉、尿素、硝酸钠等。与碳源类似，不同的氮源适用于不同微生物。通常情况，复合氮源比单一的无机氮或有机氮作为氮源，更有利于提高微生物发酵产酶活性。不同的菌株对氮源的要求不同：Tsujisaka 认为对于霉菌，发酵生产脂肪酶受氮源的影响比其它菌种要高；而菌株Mucorlipolytica、Aapergillus niger发酵产脂肪酶活性则受氮源的影响较小，动植物有机氮或尿素都能够满足其发酵产酶对氮源的要求。
发酵培养基起始pH对微生物脂肪酶产量有着显著影响，多数菌株最适pH为7-8。Pal 等通过对菌株Aspergillus niger的研究发现，始终保持pH7.0的发酵条件，该菌株产脂肪酶的量达到最大。施巧琴通过对霉菌和细菌产碱性脂肪酶的研究发现，大部分霉菌在pH7.0培养基中产酶量最大而细菌则不同，多个种在发酵培养基pHl0条件下脂肪酶产量达到最大。
在具体的研究实践中，根据具体情况可加入一些特殊诱导物实现微生物产脂肪酶活性的提高。常见的诱导物有甘油三脂、长链脂肪酸、游离脂肪酸以及他们的某些结构类似物如司班、聚乙二醇单油酸酯等表面活性剂。对于诱导剂的选择，谢舜珍、陶文沂等研究表明，不饱和脂肪酸对脂肪酶的形成有明显的促进作用，而饱和脂肪酸则作用不明显。另外有研究报道表明，脂肪酸酞基酯(吐温80，85 作用效果最好)对菌株风纵面聊伽甜aeruglrosa EF2具有强烈的诱导作用，而油酸则起阻遏作用(谢舜珍，1986)；吴松刚报道，聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯十六烷基醚和土温40均能够不同程度地提高脂肪酶的产量，而咪唑则抑制脂肪酶的产生。
5. 脂肪酶生产的基本工艺流程图
6.南极假丝酵母生产脂肪酶[4]
6.1菌种、培养基及试剂仪器
菌种为南极假丝酵母 C.antarctica DMS2 3855(本实验室保存)。
培养基组成:(1)斜面培养基: 蛋白胨 6 g·L- 1,酪蛋白水解物 4g·L- 1,酵母膏 3g·L- 1,牛肉膏1.5g · L - 1,葡萄糖1g·L-1,琼脂20g·L-1(2) 种子培养基 :除去琼脂 ,其它成分同斜面培养基。(3) 发酵培养基: Pharmamedia 40 g·L – 1，酵母膏5g ·L-1,蔗糖3g·L- 1,豆油30 mL·L- 1,K2 HPO44g·L-1,MgSO4·7H2O 1g ·L- 1,聚醚 0186 mL·L- 1, pH6.2。
试剂和仪器:聚乙烯醇 (平均聚合度 1750 ±50) ,分析纯 ,上海埃波化学试剂厂生产;摇床ZD285 型恒温振荡器 ,常州国华电器有限公司;DS2Y215L 型发酵罐 ,镇江达森发酵设备有限公司;alp ha2DO1000 型溶氧电极; alpha2p H800 型pH电极 ,万通电子仪器有限公司。
6.2发酵过程
摇瓶培养: 50mL发酵培养基装于500mL的三角瓶中 ,回转式摇床,200r·min- 1, 24℃下 ,培养54h ,接种量10%。发酵罐培养:10L的发酵培养基装于15L的发酵罐中 ,转速 250r·min- 1,通气量为10L·min- 1接种量10 % ,24℃培养54h。
6.3脂肪酶的热稳定性和 pH稳定性测定
南极假丝酵母在优化后的培养基中生长 54h ,取培养液在4℃下 , 5000r·min- 1离心5min ,除去菌体和培养基中其它不溶物。在上清液中加入体积比为1∶1的冷的无水乙醇,充分搅拌后在4℃下5000r·min- 1离心10min除去杂蛋白。所得上清液中再加入体积比为215∶1 的冷的无水乙醇 , 搅拌 ,4℃下 ,5000r·min- 1离心10min ,将沉淀溶解于合适的缓冲液中 ,用来分析酶的一些性质。将酶液和pH 范围为3.0～9.0的各种缓冲液按体积比1∶5的比例混合 ,在室温下放置 24h ,然后回调酶的最适反应pH ,测定残留酶活。在测定酶的热稳定性时 ,将酶液分别放置在 30～80 ℃段不同的温度下60min ,取出后冷却 ,然后在40℃下测定酶活。
6.4南极假丝酵母生产脂肪酶发酵条件研究。
刘均洪（2005.4青岛科技大学学报）等对南极假丝酵母生产脂肪酶发酵条件研究结论：用南极假丝酵母进行脂肪酶生产 ,最优的培养基组成为:豆粉40 g·L - 1,淀粉15g·L- 1,豆油5mL·L-1,K2PO4 4g·L - 1, MgSO4 ·7H2O 1g ·L- 1,吐温 - 80 0.1%,酵母膏5g·L- 1。操作条件为:温度24℃,初始pH6.0 ,通气量为10.0L ·min- 1。在此培养条件下,发酵周期缩短到54 h。
由15L发酵罐生产酶液的酶活达到19.2 U ·L - 1。酶液在pH为4.0～6.0和 7.5～9.0段较稳定 ,其最适pH范围为6～8.5。
7.脂肪酶发酵生产过程
脂肪酶液态发酵可采用分批发酵,补料分批发酵,连续发酵,反复分批发酵;而固态发酵一般只见于分批发酵。
7.1分批发酵
大多数文献中多采用摇瓶发酵,另外,也可采用鼓泡式,气升式,搅拌式发酵罐.例如使用20L的分批生物反应器来研究Y. lipolytica胞外的影响因素(油酸甲酯在发酵液的分散度,溶解氧的变化,pH值的变更),以在实验条件下模仿自然环境.这一系统能够模拟水压条件下大规模培养对微生物的生长,胞外酶的生产以及基因LIP2对脂肪酶的诱导作用.通过实验发现,溶解氧的变化对其生理效应有显著影响,而降低了基因LIP2的表达水平.油酸甲酯和pH 值的变更仅对微生物体的产量及脂肪酶比生产率略有影响[5]。
7.2反复分批发酵
反复分批发酵同时具有分批发酵和补料分批发酵的优点,通过长周期控制生产过程,比分批发酵具有更高的效率.通过对R.arrhizus的液态反复分批发酵,实验中对培养基更换时间,体积以及最佳的组分进行了研究,其中九批在烧瓶中发酵140小时,六批在5L的生物反应器中进行.结果显示脂肪酶的产率在分批发酵中仅为3.1U(mL*h) ,而采用反复分批发酵可提高到17.6U/(mL*h)[6]。
7.3补料分批发酵
补料分批发酵是指在发酵过程中加入一种或多种营养素以维持生物反应器中的生产.这种发酵降低了细胞新陈代谢对生产的影响,可避免酶作用底物和代谢产物对生产的抑制.Zhao等对皱褶假丝酵母进行高细胞密度发酵,在5L和800L下分别实验.在小试条件下,可通过指数加料及pH控制完成反应;而中试条件则需要两个阶段的发酵,在48小时处需微调培养温度和pH.结果在800L反应器中脂肪酶活性可达14,000 U/mL ,细胞湿重为500g/L [7].
7.4连续发酵
连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基,同时以相同速度流出培养液,从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程.通过对皱褶假丝酵母胞内,胞外脂肪酶生产的连续发酵,实验者发现:与分批发酵相比,连续发酵脂肪的产量提高了50%,并且在缺少氮源的条件下,脂肪酶活性将受到抑制[14].与分批发酵和补料分批发酵相比,连续发酵具有一定优势,产业化应用的潜力很大;可以通过多种方式实现连续发酵;应用连续发酵的前提是必须充分研究出发菌株的连续发酵特性;连续发酵理论与代谢工程理论等理论的结合是必须的;继续发展和完善连续发酵分子水平上的理论解释是下一步努力的方向[8]。
8.脂肪酶的固定化
8.1固定化脂肪酶的优、缺点
脂肪酶的固定化技术开始发展于20世纪后半期，与其它许多固定化酶一样，与游离酶相比，固定化脂肪酶也具有普通固定化酶的如下优点：①生产实践中，固定化酶容易与底物、产物分开；②固定化酶可以实现在较长时间内进行的反复分批反应和装柱连续反应；③固定化酶的反应过程能够加以严格控制；④多数情况下，固定化能够提高酶的稳定性；⑤催化产物中没有酶的残留，简化了提纯工艺；⑥固定化酶可以增加产物的收率，提高产物的质量；
⑦固定化酶较游离酶更适合于多酶反应体系；⑧固定化使得酶的使用效率提高，降低了生产的成本。
尽管有许多游离酶无法比拟的优点，但是固定化酶仍然存在一些不足：①在固定化处理时，会引起酶活力部分丧失；②固定化处理增加了酶的制备成本，使得工厂初始投资加大；
③固定化酶只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适合；④与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；⑤胞内酶必须经过酶的分离手续(袁勤生，2005) [9] (罗贵民，2003)。 [10]
8.2脂肪酶固定化方法
传统脂肪酶的固定化方法主要包括物理吸附(曹国民，1997)、包埋以及交联法和共价固定法四种，其中物理吸附、包埋法(鲁玉侠，2001)[11]为物理法，该法不但操作简单、成本低，
而且由于酶分子与固定化载体间没有发生化学反应，所以对酶活性的影响较小；可美中不足的是，物理固定法不能有效地实现酶分子与载体牢固的结合，以至于酶分子容易脱离载体，从而严重影响固定化酶的稳定性。交联法和共价固定法(杨永梅，2003)同属化学法，与物理法相比，化学法有效解决了酶分子与载体之间结合不够牢固的问题，但不幸得是，由于化学固定法是通过酶与载体之间发生化学反应而实现的，所以固定的过程往往造成对酶分子活性中心的破坏，从而严重影响酶的催化活力。
随着酶工程研究的不断深入，脂肪酶的固定化方法也不断得到发展和更新。目前主要有交联酶晶体法(CLECs)(张虎，2000)[12]、CLAs固定化法、脂质包被固定化法(Lipid—coating)和硅基质包埋法(Sol—gel process)(Reetz，1995)(Reetz，1995)等。其中脂质包被固定化法和交联酶晶体法，在有效增强脂肪酶的水解和酯化活性(Khalaf,1996)(Lalonde，1995)的同时，还有效地保证提高了脂肪酶的旋光选择活性和酶催化活性的立体选择特异性(Okahata，1995)；另外虽然硅基质包埋法脂肪酶回收率低，但相对于交联酶晶体法(CLECs)和脂质包被固定方法，该方法制备容易，并且能够提高酶的化学和热力学稳定性，还可以提高酶的立体选择性(张虎，2000)。
9.双水相体系提取脂肪酶
9.1材料
酶粉: 真菌(Geotrichum candida) S56 脂肪酶，PEG1000、PEG4000、PEG6000、PEG 10000 均为化学纯, 实验中所用其他试剂均为市售。
9.2分析内容
脂肪酶活力测定：测定方法见参考文献〔 13〕.总蛋白含量测定：测定方法见参考文献〔 14〕由于蛋白质280nm波长有吸收峰, 与Folin2酚法相比, 简单方便用此法测定, 蛋白质在10～ 100 mg.mL-1范围内符Beer定律本实验以牛血清白蛋白为标准。
9.3硫酸铵的定量分析
(NH4 )2SO4与HCHO (甲醛) 作用, 生成N4(CH2 )6和H2SO4以及H2O , 其反应式为:
2(NH4)2SO4+ 6HCHO——N4(CH2)6+ 2H2SO4+ 6H2O；
H2SO4+ 2NaOH= Na2SO4+ 2H2O。用标准浓度的NaOH 溶液滴定H2SO4,可用所耗NaOH 的体积求得H2SO4的量, 进而得出(NH4)2SO4的量计算公式:W2 = 0.66*V *C
式中:W2: (NH4)2SO4在两水相中的量(g)；
V:所耗NaOH 标准溶液体积(mL )；
C:NaOH 标准溶液浓度(mol·L-1)。
9.4试剂配制
NaOH 溶液的标定见参考文献[7] .
20%酶液制备：准确称取10.00g酶粉, 先用少量pH 8. 5 的磷酸缓冲液溶解,以 2 000 r·min -1离心, 再用上述磷酸缓冲液洗涤2 次以上, 然后于50mL容量瓶定容
其余试剂①40% PEG1000、40% PEG4000、 40%PEG 6000、 40% PEG1000溶液; ②40%(NH4)2SO4溶液; ③25%PEG 10000溶液④其余试剂参照文献[7]
9.5相图节线制作
从 PEG量和(NH4)2SO4的量可得出其百分浓度,由此可得到两个点,这两个点与加料点的边线即为节线(Tie line),得到一系列的点和节线即可连结各点作出一条曲线——双节曲线(binodal) 。它与节线构成一个体系相图[14 ]
9.6双水相体系制备[15]
实验在室温下进行按分配系数公式 , 相比R如下: R = Vt/Vb，则物质在上相的提取率便为:Yt = R K/(1 + R K ) 。
V t、 V b 分别是上相和下相的体积K 若分别用酶的分配系数Ke或总蛋白的分配系数Kp 代替,则可以分别求得酶和总蛋白的提取率。
10.脂肪酶在食品工业中的应用
10.1三酰甘油水解
水解三酰甘油的常规方法是利用高温、高压水解的方法产生脂肪酸，此法能耗高，投资大，所得脂肪酸的质量较差。脂肪酶水解法可以克服以上缺点且可以防止食品变质，因此备
受人们青睬。另外，由于脂肪酶的作用条件温和，专一性强，避免了常规法中极易出现的副反应，而且脂肪酸和甘油的颜色也不会发生改变。脂肪酶酶促水解三酰甘油法可为食品工业提供优质的原料。另一方面，脂肪酶作用下释放出的短链脂肪酸还可以改善食品的风味和香味。恻如；用短链脂肪酸增香后的黄油具有一定的奶香味，可用来制造巧克力、奶糖、冰淇淋、糕点等。还可以利用脂肪酶分解乳脂，用来制造脱脂炼乳。
10.2 三酰甘油的改性
脂肪酶催化油脂改性，由一种甘油酯生成另一种甘油酯。这对改善食用油的质量，开发食用油的品种，提高食用油的营养价值有很大的作用。目前主要用于非水介质中脂酰残余物的选择怪替代以提高食用油的等级。例如，脂肪酶催忧棕桶油莉硬脂酸发生反应生成的可可脂已广泛用于糖果工业。据报道，英国有一家半工业化实验厂用此法生产可可脂，年产22700~其价格仅为天然可可脂的一半。日本也发表过类似的专利。用脂肪酶还可催化碳水化合物(如蔗糖)和三酰甘油生成广泛用于咖啡制品中曲蔗糖脂肪酸酯。脂肪酶用于磷脂的改性可提高它的乳化稳定性和水分散性。另有德专利报道，用脂肪酸和甘油脂再加德氏根霉脂肪酶，可以制得合成脂苗。
10.3催熟和发酵
脂肪酶在奶酪加工过程中选择性地水解牛奶中的脂份而生特定的香味，从而催化食品的老熟。脂肪酶催化形成的风味物质已经象天然风味物质一样被广大消费者所接受。将一定量的脂肪酶加到黄油和奶油中可产生出象酸奶一样的香味组分，脂肪酶加到奶酪中可以增加其香味。据报道，美国和欧洲一些国家里有些奶酪就是这样生产的。脂肪酶的催化作用可以提高发酵速度，缩短生产周期。
10.4脂类合成
脂肪酶还可以催化甘油脂的合成。因此，除如前所述的用于某些食品中增香外，还可以用它来合成食用香料脂，为食品工业提供一种新型的天然食品添加剂。近几年，有些人在这方面做了大量的工作，并提出了相应的合成机理。
11.脂肪酶在其他方面的应用
11.1脂肪酶在纺织物中的应用
织物表面脂质影响织物的柔软度、光亮度和着色与手感。传统脂处理法是用化学品脱除，效果不理想，且污染环境，成本高。脂肪酶能将织物表面脂质水解成易溶于水的脂肪酸，易于脱除。E1一Syed[16]等研究了酶处理羊毛毯的防缩性能，比未处理的羊毛缩水性有明显改善。用脂肪酶和淀粉酶协同处理棉布纤维，棉布白度提高，染色瑕疵少，更柔软、舒适[17]。
11.2脂肪酶的医学应用
脂肪酶是一种重要的药物靶或中间体标记酶。作为诊断工具，脂肪酶可预测疾病。测定脂肪酶催化甘油三酸酯产生的甘油可间接获得血清甘油三酸酯的含量，血清中脂肪酶还可用于检测急性胰腺炎和胰腺损伤。Ah med研究了脂肪酶和血清淀粉酶测定胰腺炎的特异性，结果表明，胰腺炎病发后血脂肪酶明显升高，诊断有特异性，结果比血清淀粉酶更可靠。
研究发现，从蜡蛀虫中提取的脂肪酶或酯酶，对分生杆菌属结核杆菌( Myc0bacteriumf6rcfD )H37Rv 有杀灭作用。
提取植物脂肪酶制成的药物，可改善患者的消化吸收功能。美国俄勒冈州健康护理专业研究中心已有脂肪酶类药品上市，用于治疗胃肠紊乱、消化不良等疾病。
在手性药物合成中，用脂肪酶制备单异构体手性药物可提高转化率、减少环境污染。
11.3脂肪酶在生物柴油中的应用
生物柴油是碳链长度16 -19的脂肪酸和甲醇或乙醇形成的酯类化合物的总称。近年用脂肪酶催化合成生物柴油，代替石化能源成为研究热点。用物理吸附法将假丝酵母脂肪酶( Candida sp。99 —125 )固定于大孔树脂，可催化大豆油制造生物柴油研究。表明，粗酶，树脂重量比为1.92： 1 ，水，油重量比为 3 ；17 ，4O℃，pH 7.4时，脂肪酶活性较高，转化率97．3％。用固定化南极假丝酵母脂肪酶催化泔水油，可制造生物柴油。
11.4脂肪酶在生物传感器中的应用
用脂肪酶的催化特性研制生物传感器逐渐受到关注。固定在pH或氧化电极的脂肪酶联合葡萄糖氧化酶可作为脂质生物传感器，测定甘油三酯、血胆固醇含量。
11.5在环境保护中的应用[18]
脂肪酶生物技术应用于被污染环境的生物修复以及废物处理是一个新兴的领域。脂肪酶的最大商业应用领域是作为家庭或工业用清洁剂的添加物。脂肪酶可用来处理油脂加工过程中产生的含脂废物及饮食业产生的食用油等; 脂肪酶还可用于制造液体肥皂, 提高废脂肪的应用价值, 处理废水及清理排水管, 去除造纸用白水及冷却水系统中的生物膜沉积物等。
参考文献
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发酵工程与设备课程设计成绩评定表
成绩评定内容及要求：
①课程设计格式符合要求程度（10分）。（）
②参考文献格式及是否全面（5分）。（）
③课程设计内容达到要求程度：（65分）：（）
前言（10）
发酵机制（5）
发酵工艺及特点（15）
菌种的制备及种子的扩大培养（10）
培养基的组成及制备（15）
酶的固定、双水相提取、酶的应用（10）
④答辩情况：汇报情况、是否能回答所提问题（20），（）
总分：（）总成绩：
指导教师签名：
答辩小组教师签名：
年产1000吨酸性蛋白酶的生产工艺设计
1. 前言 酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5?5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 ?40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。细菌未发现产酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。 国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。 与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生
微生物发酵培养基的优化方法
工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法
脂肪酶产生菌发酵条件的优化
绵阳师范学院 本科生毕业论文（设计） 题目脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化专业生物技术 院部生命科学与技术学院 学号0811420218 姓名杜长蔓 指导教师李俊刚 答辩时间2012年5月 论文工作时间：2011 年7 月至2012 年5 月
脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化 学生：杜长蔓 指导老师：李俊刚 摘要：本文对绵阳师范学院微生物实验室筛选和鉴定的产脂肪酶细菌 M-6-2的生长动力学和产酶动力学进行了研究；通过单因素实验和正交试验，对脂肪酶产生菌M-6-2 摇床发酵产脂肪酶的培养基组成和培养条件进行优化，得出较佳的产酶培养基组成配方为：1.5%淀粉+0.5%酵母膏为碳源、4.5%豆饼粉 +1.5%硝酸铵为最佳的氮源、0.05%磷酸氢二钠和0.15%硫酸镁；最优的发酵条件为：初始pH7.5，接种量1.5 %，装液量20ml/250ml，发酵温度35℃，在转速180r/min 下，培养16h，经过优化后发酵液脂肪酶酶活力最高可达到15.60 U/ml,较优化前提高了49.57%。脂肪酶产生菌M-6-2与国内文献报道的产脂肪酶细菌相比产酶活力高。对该菌株发酵条件进行优化后，为生产性试验打下了基础。 关键词：脂肪酶产生菌M-6-2；脂肪酶；发酵条件；优化；正交试验；
Lipase to produce bacteria M-6-2 Optimization of fermentation conditions Undergraduate: Du Changman Supervisor: Li Jun Gang Abstract: In this paper, Laboratory screening and identification of lipase production by bacteria in the M-6-2 growth kinetics and enzyme production kinetics were studied; through single factor experiments and orthogonal test, the lipase to produce bacteria M-6-2 shaker fermentation lipase medium composition and culture conditions were optimized to come to a better enzyme production medium composition formula: 1.5% starch and 0.5% yeast extract as carbon source, 4.5% of the soybean powder and 1.5% ammonium nitrate for the best source of nitrogen, 0.05% disodium hydrogen phosphate and 0.15% magnesium sulfate. Optimal fermentation conditions were: initial pH 7.5, 1.5% of the inoculum size, liquid volume 20ml/250ml, fermentation temperature 35 ° C, in the speed 180r/min next, cultured 16h After optimization of the fermentation broth lipase activity can reach 49.57% to 15.60 U / ml, compared to before optimization. Lipase to produce bacteria M-6-2 and reported in China in the production of lipase bacteria compared to the high activity of enzyme production. Of the strain fermentation conditions optimized, laid the foundation for the production of test. Key words: Lipase producing strain M-6-2；lipase ；fermentation conditions； optimization ；orthogonal test
酸性蛋白酶生产工艺
第六节酸性蛋白酶生产工艺 07040642 47 李继江 1 蛋白酶、蛋白类酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3 蛋白类酶 蛋白类酶主要是指由蛋白质组成的酶（P酶）；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R酶）。 蛋白类酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（或称连接酶）。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5 酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）
3吨碱性蛋白酶课程设计--年产3吨碱性蛋白酶发酵工艺设计
年产3吨碱性蛋白酶发酵工艺设计 摘要 在现代食品工业中, 酶的应用几乎涉及到食品加工的各个领域。随着酶制剂日益广泛的应用,经济效益显著。蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称, 而碱性蛋白酶则适宜在碱性条件( pH9——11) 下水解动植物蛋白质, 广泛存在于动植物及微生物中。设计中首先根据参考资料选定了碱性蛋白酶发酵生产的具体工艺流程，通过物料衡算确定需要立方米发酵罐台和立方米种子罐台，在此基础上得出发酵工段所需要的各种原料量，通过能量衡算确定水、无菌空气和蒸汽等的消耗量。然后对主要设备进行计算和选型，得出发酵罐、种子罐及通用设备、非标准设备等的结构尺寸、冷却装置、传动装置，根据工艺要求确定罐的附属设备和辅助设备以及发酵过程中的优化控制。 根据计算结果，设计了两张图纸，分别为发酵罐装配图、工艺流程图。 关键词：碱性蛋白酶发酵罐种子罐物料衡算
1绪论-------------------------------------------------------------- 1 1.1碱性蛋白酶概述---------------------------------------------- 1 1.2碱性蛋白酶的性质-------------------------------------------- 1 1.3碱性蛋白酶的使用条件---------------------------------------- 1 1.4碱性蛋白酶的保存-------------------------------------------- 1 1.5注意事项---------------------------------------------------- 1 1.6碱性蛋白酶的主要应用---------------------------------------- 2 1.6.1在洗涤剂中的应用-------------------------------------- 2 1.6.2在皮革中的应用---------------------------------------- 2 1.6.3在饲料添加剂中的应用---------------------------------- 3 1.6.4在纺织行业的应用-------------------------------------- 3 1.6.7在玉米深加工中的应用---------------------------------- 3 1.7碱性蛋白酶的发展前景---------------------------------------- 4 2设计任务---------------------------------------------------------- 4 2.1设计内容---------------------------------------------------- 4 2.2设计要求---------------------------------------------------- 4 3碱性蛋白酶生产工艺选择-------------------------------------------- 5 3.1生产工艺的选择---------------------------------------------- 5 3.2工艺流程图-------------------------------------------------- 5 3.3工艺流程图说明---------------------------------------------- 6 3.3.1菌种的制备-------------------------------------------- 6 3.3.2孢子的制备-------------------------------------------- 6 3.3.3种子的制备-------------------------------------------- 6 3.4菌种的改良-------------------------------------------------- 6 3.5培养基的制备------------------------------------------------ 8 3.6灭菌的方法-------------------------------------------------- 8 3.6.1湿热灭菌---------------------------------------------- 8 3.6.2培养基的连续灭菌-------------------------------------- 9 3.6.3空气除菌---------------------------------------------- 9
发酵工艺优化
发酵工艺优化 发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统
发酵工艺优化
发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统 至于装液量的问题，应该从以下几个方面考虑： 1、保持在你所需要的转速培养情况下（尤其是在后期，菌丝很多时，转速很高时），不能让发酵液把你的塞子湿掉，容易造成染菌。 2、装液量的体积在消毒过程中，不能因为沸腾把塞子湿掉，或者跑出三角瓶，装液量太多会出现这样的情况。很容易染菌。 3、根据你的菌种的情况和发酵液的粘度，需要的混匀程度等等方面也要考虑。 4、建议你做一个梯度试验（40－50－60－70－80等）就可以找到你所需要的装液量。 关于剩余空气的排除在灭菌完毕后（100度左右），立刻用盖子或者其他的用品把你的培养摇瓶盖好，有时候这么点空气根本对兼性厌氧发酵没有什么影响，如果你的菌种要求很严的话，最好用干冰加入已经灭菌的空摇瓶后，立刻用其他的样品培养基分装即可。当然也可以用氮气。最好是二氧化碳。 你可以再查查看是否有其他的方法，我说的也不完全。！！
年产1000吨酸性蛋白酶的生产工艺设计
1. 前言 酸性蛋白酶是一类最适pH值为的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。细菌中尚未发现产酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。 国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。 与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白.近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它们的突变株。李永泉等，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究.戚淑威等对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等，采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋
发酵工艺条件的优化修订稿
发酵工艺条件的优化集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]
发酵工艺条件的优化 发酵优化对于搞发酵的工作者而言是非常必需的，下面结合其他战友的一些经验之谈引出此专题，希望大家踊跃讨论，以其提高发酵水平和解决实际问题。 发酵工艺的优化在发酵行业起到很大的作用,尤其是在发酵生产中,它是提高发酵指标的一项非常,有用的技术手段.同时也是搞发酵行业的人的必备知识要求之一,借此我想通过和大家交流共同提高发酵方面的知识水平.发酵工艺优化方法与思路:发酵工艺优化的方法有很多,它们之间不是孤立的,而是相互联系的。在一种发酵中,往往是多种优化方法的结合,其目的就是发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率,在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。 注意:大家可以从以下各个方面进行交流.尽量能够分类进行叙述,我总结了以下几累,也不是很全,当然从其他的方面进行交流也可以,但是希望你注明附加说明!!!谢谢大家的参与!!!!!!!!!一. 好氧发酵1. PH 工艺的优化2. 溶氧工艺的优化3.原材料工艺的优化4.消毒(灭菌)工艺的优化5.菌种制备工艺的优化6.小试到中试,中试到生产等扩大实验的工艺优化7.成本工艺优化8.种子罐工艺的优化9.发酵罐工艺参数控制的优化10.仪表控制的工艺优化11.环境的工艺优化12.染菌处理的工艺优化13.紧急情况处理的工艺优化(停电\停水\停气\停汽等)14.补料工艺的优化15.倒种工艺的优化16发酵设备的工艺优化17.其他的工艺优化 二. 厌氧工艺的优化三.固体发酵的工艺优化四.其他1. PH工艺的优化A.配料中的PH 很重要,其中有配前PH,配后PH,消前PH,消后PH,接种前PH,工艺控制PH等,配前PH,配后PH,可以用来检测厡材料的质量,初步估计配料的情况,如果出了错误,有时候可以从PH中的变化看出来,能够减少错误的发生.B.另外,每次有新的配方我们总是要用PH方法检测其中的每种厡材料是否会和其他的发生反应,可以互相两两混合,检测PH的变化,也可以用来作为配微量元素的检测.C.消前PH可以用来减少消毒过程对培养基的破坏,因为培养基在消毒中会有PH的变化,在不同的PH条件下对培养基破坏也不一样,因此可以在消毒的时候选择合适的PH,消毒完后可以调节过来,这样一来可以对PH敏感的一些原材料减少破坏,这种方法在生产中已经取得了初步的成绩,提高了指标.D.工艺控制的PH,在发酵的产抗期间,通过在不同的发酵时间调整不同的P H,可以减少杂质的产生,同时还可以缓解溶氧,比如在头孢发酵中,通过在后期调整PH可以减少DCPC的含量,给提取工序带来很大的好处,E.补料罐通过PH的调节可以更好的通过流加物料而不影响发酵.(部分发酵在不同时期的PH有所不同,所以通过补料罐的调整可以对发酵指标有所提高)F.发酵过程中的PH调节可以通过各种方法,不一定要添加氨水和氢氧化钠,可以添加玉米桨等其他的物料来进行调节.G.控制放罐时的PH可以对后面的过滤有所影响,所以一定要控制好放罐前的PHH.绘制种子瓶和种子罐以及发酵罐等整个发酵过程的PH生长曲线,可以用来参考控制工艺,检测无菌情况的发生.A. 华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化
实验二、细菌蛋白酶的发酵制备
实验二、细菌蛋白酶的发酵制备 一、实验目的原理 了解气升式发酵罐的结构及特点，学会使用该类型的发酵罐培养微生物。本实验在5L 发酵罐中进行细菌培养。通过测定菌体浓度了解细菌的生长规律，通过测定蛋白酶活力了解产物生成，分析菌体生长与产物生成的关系。同时检测发酵过程中的溶氧、pH等。 二、材料与方法 1.实验用培养基 LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠10g/L，卡那霉素5mg/L，pH7.4。 0.5mg/mL抗生素溶液：称取 0.05g 卡那霉素溶于 100ml 无菌水。小管分装后置-20℃冻存备用。 斜面培养基：配方同 LB 液体培养，调pH至7.4后添加琼脂15g/L。 三、实验过程 1.种子制备 250mL锥形瓶装培养基50mL，接种斜面菌种一环，于旋转摇床37℃培养12h 转速150-200转/分。 2.发酵前准 1).清洗。发酵罐培养前后进行清洗（空气分布器、管内壁、顶板放零件的小间隙），外壁、底板、顶板擦干净。 2).连接。进行发酵之前要对发酵系统（蒸汽发生器管路、空气压缩系统、冷却系统、发酵流加系统及在线控制系统）进行调试。主要工作是检查通气与通水管道的连接正确与否、管道是否破损、空压机能否正常工作、在线控制系统能否正常工作。发酵罐中配置用于供给冷却水、循环水及排水的管子。空压机空气供给的配管。连接发酵罐、PH 控制器、DO 控制器等电源。注意不漏电和接错线。 3).试剂。配置培养基、酸碱平衡液、消泡剂等。 3.电极标定 3.1 pH 电极标定 pH 电极零点和斜率要在进行灭菌以前进行，电极在使用前先用蒸馏水清洗并检查电极信号有无故障，然后再进行标定。一般而言如果发酵液偏酸性我们用6.86 和4.00 的缓冲液，如果偏碱性则配制6.86 和9.18 的缓冲液。 点击控制器屏幕画面下方的“标定”，弹出标定菜单，选择相应罐（F1-F4）下的“pH 电极”，弹出相应的pH 电极标定界面。先进行零点标定，以酸性为例，将pH 电极联好电极线用蒸馏水洗净后插入pH6.86 的标准液中，点击“零点值”，输入6.86，然后点击“开始”，待采样值完全稳定后点击“结束”。然后用蒸馏水清洗电极探测头后插入pH4.01 的标准液中，同样方法输入斜率值 4.01 来标定斜率。 接下来将PH 电极插在发酵罐上与培养基一起进行灭菌，并用纱布和牛皮纸将电极的金属头包住，以免接触到水。实消后，冷却下来，连上电极线，接到灌上，这时PH 电极将信号传给控制系统并显示发酵罐内发酵液的PH 值。在发酵控制台上设定需要控制的PH，控制系统会通过流加酸碱控制PH。也可不控制PH，通过电极对发酵过程的PH 变化进行检测。
发酵工艺优化
发酵工艺优化---现代发酵工业调控策略 发布日期：2010-04-10 来源：[标签:来源] 作者：[标签:作者] 浏览次数：716 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH 值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率。在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。基于此，华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化的有关现象，研究细胞代谢物质流与生物
蛋白酶的工厂设计
年产1500m3蛋白酶的工厂设计 摘要 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。酸性蛋白酶是一种羧基蛋白酶，它的分子质量为30-40kD，等电点（pH3.0-5.0） 酸性蛋白酶现已广泛应用于食品、饲料、酿造、毛皮与皮革、医药、胶原纤维等各个行业之中。本设计采用豆饼粉、玉米粉、淀粉为主要的培养基原料，并选用黑曲霉（Aspergillus niger ）3.350菌种发酵。其中豆饼粉3.75%，玉米粉0.625%，鱼粉0.625%，氯化铵1%，氯化钙0.5%，磷酸氢二钠0.2%。 本设计利用通风搅拌式发酵罐进行发酵，同时利用离子交换树脂对母液进行提取，提高了酸性蛋白酶的生产效率，减少了生产成本。设计还包括发酵罐，全厂平面图，车间平面布置图，工艺流程图。 关键词：酸性蛋白酶发酵工厂设计
The Process Design of the Protease used for Section with the Capacity of 1500m3 Annually Abstract protease is a kind of Peptone and peptide. It has been discover across in animal giblets ,the stem of plant,fruit , microbial and so on.Most of the Microbial protease are ectoenzyme .According to its best Optimum pH function ,Microbial protease Can be divided into Acid protease ,Neutral protease and alkaline protease .Acid protease is a kind of Carboxyl protease , Its molecular weight is 30-40 kd, lower isoelectric point (pH3.0-5.0) Acid protease in food, medicine, textile, leather, feed, cosmetics, washing industries have applications, natural health, avirulent and harmless, quite safe. So in this paper the basic content of more acid protease, production process and application development were introduced. This design USES the bean cake powder, corn flour, starch as the main medium of raw materials, and selects the Aspergillus Niger, Aspergillus Niger) 3.350 bacterial fermentation. With bean cake powder 3.75%, corn flour 3.75%, 0.625% fish meal, 1% ammonium chloride, calcium chloride 0.5%, disodium hydrogen phosphate 0.2%. This design using the ventilation agitator in fermentor, using ion exchange resin in mother liquid was extracted at the same time, improve the efficiency of the acid protease production, reduce the production cost. The design also includes Fermentor, The factory plan, Shop floor plan, Flow Chart. Key Words: Acid protease ; fermentation; plant-design;
酸性蛋白酶的作用机理(仅供参照)
酸性蛋白酶与碱性蛋白酶生产工艺的不同之处？ 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下（pH 2.5-4.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。可用于毛皮软化，酒精发酵，啤酒、果酒澄清，动植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加剂等等。本品在酸性条件下有利于皮纤维松散，且软化液可连续使用，是当前理想的毛皮软化酶制剂；在酒精发酵中，添加酸性蛋白酶，能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒粒间细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用碳源增加，从而可提高原料出酒率；另一方面，蛋白质的水解提高了醪液中α-氨基态氮的含量，促进酵母菌的生长与繁殖，提高发酵速度，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。 碱性蛋白酶碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶,不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点。1945年瑞士M等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶。 碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分
子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。 1、碱性蛋白酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，应用在食品行业可水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液。 2、碱性蛋白酶成功应用于洗涤剂用酶工业，可添加在普通洗衣粉、浓缩洗衣粉和液体洗涤剂当中，既可用于家庭洗衣，也可用于工业洗衣，可以有效的去除血渍、蛋类、乳制品、或肉汁、菜汁等蛋白类的污渍，另外也可作为医用试剂酶清洗生化仪器等。 3、在生物技术领域，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，而对DNA无降解作用，避免对DNA 完整性的破坏。 酸性蛋白酶如何灭活第一种方法几乎所有酶都适用，就是加热。第二种，既然是酸性酶，加入强碱应该也是可以的。 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研
蛋白酶活力测定方法
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。