生物化学检验实验室基本知识
第二章生物化学检验实验室基本知识
掌握好临床实验室的基本知识，包括实验用纯水，实验室常用器材、试剂、
试剂盒，参考范围和医学决定水平，实验方法与参考物质，方法学评价试验，临床诊断性能评价等，才可能保证检测结果的准确度与精密度，能够促进实验室与临床的沟通，因此其对于从事生物化学检验的实验室工作者非常重要。
第一节实验用纯水
实验用纯水指天然水和自来水经过蒸馏、离子交换、活性炭吸附、超滤等处理后除去了杂质的水。其质量的高低直接影响到检测结果的准确度和精密度。
一、实验室用水等级
1985年美国国家临床实验室标准委员会（national committee for clinical laboratory standards，NCCLS）将实验用水分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级（表2-1）。中国国家技术监督局先后于1992年、2000年批准实施的《中国国家验室用水标准》（GB6682-92、GB6682-2000），也将分析实验用水分为三个等级（表2-2），两次
的区别主要是电导率的计量单位不同。
表2-1 美国NCCLS等级纯水的规定及用途(1985)
级别Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级pH 未定未定 5.0～8.0
电阻率(MΩ·cm, 25℃,最大量) 10 2.0 1.0
硅(mg SiO2/L,最大量) 0.05 0.1 1.0
微生物含量（每毫升最大菌落数）10 103 未定
硅（mgSiO2/L，最大量）0.05 0.1 1.0
微粒0.2μm微孔膜过滤未定未定
有机物质活性碳过滤未定未定
用途原子吸收，火焰光度，荧光，
电解质，酶，高效层析，电泳，一般实验室检
验，器皿冲洗。
器皿洗涤，要
求不高的定性
学习目标
掌握诊断试剂盒的选择与性能指标评价，实验方法与参考物质的分级，五种方法学评价试验的目的、原理、操作、计算及注意事项。
熟悉化学试剂的选择、保存与配制，常用临床实验室器材的使用及玻璃仪器的清洗，参考范围和医学决定水平，实验方法与参考物质的相关基本概念，实验方法的正确选择，诊断试验的性能评价。
了解实验用纯水。
参比液，缓冲液。试验。
表2-2 中国国家验室用水GB6682-2002标准
名称一级二级三级pH范围(25℃) －（未定）－ 5.0～7.5
电导率（25℃）ms/m ≤ 0.01 0.10 0.50
比电阻（25℃，MΩ·cm）≥10 1 0.2
可氧化物质（以O计）mg/L ＜－0.08 0.40
吸光度（254nm，1cm光程）≤ 0.001 0.01 －
蒸发残渣（105±25℃）mg/L ≤－ 1.0 2.0
可溶性硅（以SiO2计）mg/L ＜ 0.01 0.02 －
可见，Ⅰ级（一级）水最好。临床实验室一般选用Ⅱ级（二级）水即可。水越纯，所含离子就越少，则电阻越大，导电性越差，即电阻率（比电阻）越大，电导率越小。同时，水越纯，所含的SiO2、细菌数、有机物等越少。
二、纯水的制备方法
（一）蒸馏法
自来水(或天然水)在蒸馏器中进行加热气化，水蒸气经冷凝后得到蒸馏水（distiled water，DW）。
蒸馏水的电阻率约为0.1MΩ·cm（25℃）。
(二) 离子交换法
将自来水通过离子交换树脂以除去水中杂质离子，称为离子交换法。离子交换法制备去离子水（deionized water，DW）的原理是水中的杂质离子先通过扩散进入树脂颗粒的内部，然后水中的Na+、Ca2+等与阳离子交换树脂中的活性基团H+发生交换，水中的Cl-、SO42-等则与阴离子交换树脂中的活性基团OH-发生交换。由于树脂为多孔网状结构，具有非常强的吸附能力，可以同时除去颗粒杂质。
去离子水的电阻率约为5.0MΩ·cm（25℃）以上。
蒸馏水与去离子水的英文缩写均为DW。因蒸馏水里面有挥发性物质、有离子干扰，故临床实验室多用去离子水，或先蒸馏、后去离子的纯水。
(三)其他方法
在制备纯水时，还可采用超滤膜法（除细菌等），活性炭吸附法（除有机物）等，以及采用活性炭吸附法、去离子树脂、超滤膜法等步骤的混合纯化系统。与自动生化分析仪配套的纯水机一般采用混合纯化系统，要求其纯水电阻率大于2.0MΩ·cm（25℃）。
三、水的纯度检查
水的纯度检查首先测定电阻率或电导率，然后检测残留物含量。
1.电阻率利用电导仪或兆欧表测定。电导仪测得的电导率可与电阻率换算：电导的单位是西门子(S)，电导(S)与电阻(Ω)互为倒数。电导率为每cm长的电导(S/cm)，电导仪的表头读数单位为μS/cm，因此电导仪读数为1时，电阻率为1×106Ω·cm = 1MΩ·cm。
GB6682-2000规定的一级水电导率的最小值为0.01mS/m，即为0.01μS/mm = 0.1μS/cm，正好与GB6682-92规定的一级水电导率的最小值0.1μS/cm 相吻合。
2.可溶性硅限量试验取纯水10ml，加入15滴1%的钼酸铵溶液，8滴草酸、硫酸混合液(按4%草酸1份加4mol/L硫酸3份的体积比)，混匀置室温10min，加5滴1%硫酸亚铁溶液，摇匀以不呈蓝色为合格(≤0.05mg/L)（以上百分比均为W/V）。
3.细菌菌落计数按细菌常规菌落计数法进行检测。
实际工作中，除了要保证实验用纯水的制备质量外，还应重视纯水的贮存、运输以及使用过程的规范化，避免一切可能的污染，防止纯水等级的下降。
第二节常用临床实验室器材
常用临床实验室器材包括普通的玻璃器材以及非玻璃器材。普通的玻璃器材又分为量器类和容器类。量器用于计量溶液体积，如量筒、容量瓶、刻度吸管等，不能作为反应容器，更不能加热。容器则是物质反应或贮存的器皿如试管、烧杯等。非玻璃器材包括微量加样器，一次性注射器、采血器、塑料试管，塑料吸管、试剂瓶、洗瓶等，以塑料类为主。
一、微量加样器的使用
微量加样器又称微量移液器、微量进样器。其下端为可装卸、可更换的尖管形移液嘴（吸头），上方是控制采样的推进按钮。常用的有固定式和可调式两种类型，规格有μl级、ml级。其准确度和精密度均高于有被替代趋势的刻度吸管。
（一）工作原理
微量加样器利用排代原理由活塞的定程运动形成负压吸入定量的液体，其吸液量由活塞在活塞套内移动的距离来确定，再按下按钮使活塞向下移动，排出活塞腔内的气体而将吸头内的液体排出。
（二）操作方法
1.选择在移液范围内的加样器，若为可调式则先将容量调节到所需的容量上。
2.将吸头套在加样器的下端，轻轻转动后牢固地套上，确保密封。
3.正式使用前需连续按动数次（不吸液体），以保持腔内外气压一致。
4.用手垂直握住加样器，拇指将按钮压至第一停点（第一档位），并将吸头浸入到液面下1～3mm，再缓慢地放松按钮使之复位，等待1～2s后从液体中取出时拖靠掉吸头外部残液于被取出的容器内壁中。注意避免吸头与其他任何东西碰撞。
5.将吸头移到加样容器内壁上，轻轻地将按钮压至第一停点将液体排出，等待1～2s，再把按钮压至第二停点（第二档位），排尽全部液体后，吸头应沿容器壁向上滑动取出，此时拖靠吸头内部残液于加样容器内壁中。再放松按钮使之复位，卸下吸头，完成一次操作过程。
（三）注意事项
1.微量加样器属于精密量器，不能直接接触液体、异物，不用时应套上吸头保持管内的清洁，以免液体或杂质吸入导致阻塞。
2.吸头与微量加样器下端的连接必须密封。
3.对于可调式按钮上的标线应对准所需容量的刻度线。
4.当加样器中有溶液时必须垂直放置，不允许倒放，否则久后失准。
5.使用前应检查其准确度和精密度。
二、常用玻璃器材的使用与清洗
(一)常用玻璃器材的使用
1. 刻度吸管带有许多分刻度，用于准确量取刻度量以下的任意量溶液，又称为吸量管，简称吸管。
在使用时应保证其干燥清洁，并可采用欲量取的液体润洗2～3次以保证所量取的液体浓度不变。量取溶液时用大拇指与中指握住吸管的上方，下端垂直插入溶液中1～2cm，另一只手用洗耳球头对准、贴紧吸管上端后将液体缓慢吸入管内。当液面上升到所需刻度以上时，立即用食指按住管口，并将吸管的下端提出液面靠在盛装溶液的器皿内壁上，略为放松食指使液体流出，当管内液体的弯
月面（凹月面）平稳下降到与刻度标线相切时，立即用食指压紧管口不让液体流出。在即将取出吸管时将其末端外部的液体拖靠在盛装溶液的器皿内壁上，然后将其垂直靠在承接溶液器皿的内壁上，使承接的器皿倾斜，松开食指让管内的溶液自然地沿器壁流下，到达所需量体积时等待10～15s，取出吸管。注意若管口上未标示“吹”字（一般1ml及其以上的吸量管不吹），残留在吸管末端内的溶液，不可采用外力使其流出；若管口上刻有“吹”字，则必须将末端的溶液吹出。
使用吸管时应注意尽量避免采用管头自然流下后的残留量（欠准确）。比如用2.0ml吸管吸取1.5ml液体，应取满刻度2.0ml放至0.5ml间的液体（弯月面→弯月面），而不能先放走0.5ml、再取剩余量的1.5ml（弯月面→管头残留）。
移液管在管的中间有一膨大部，在顶端细部标有容量刻度线，用于一次性移取较大量的的溶液。使用方法同上。
2.容量瓶为一平底圆球状长颈瓶，具有磨口瓶塞，在使用中与磨口瓶塞配套使用。瓶颈上刻有一环形标线，表示在所指温度(一般为20℃)时的容积标线。主要用于将准确称量的物质配成准确浓度的溶液，或将准确容积及浓度的溶液稀释为准确容积及浓度的稀溶液。
3.量筒用于量取体积不甚准确的液体。化学清洁的量筒应倒挂存放。
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20℃时，玻璃量器的刻度才与实际容量相吻合。温度改变时应进行校正，参见《全国临床检验操作规程》。
常用容器类玻璃器材如试管、烧杯、烧瓶、漏斗、干燥器等的使用参见基础化学教材。
(二)玻璃器材的清洗
1.新购玻璃器材的清洗新购的玻璃器材都含有游离碱，可先用肥皂水或去污粉洗刷，自来水冲洗，然后浸泡在1%～2%的盐酸溶液中4h以上，再用流水冲洗，最后经蒸馏水冲洗2～3次，在100～130℃烘箱中烘干或晾干备用。
2.使用过的玻璃器材的清洗对于容器类玻璃器材，先用自来水洗刷后，用肥皂水或去污粉刷洗，再用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水淋洗2～3次，倒置干燥备用。量器类玻璃器材，使用后应立即浸泡于凉水中, 以防止物质的干
涸。然后用流水冲洗, 待沥干后, 用铬酸溶液浸泡数小时，再用流水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～4次，晾干备用。对于盛装过具有传染性样本的容器，应浸泡在杀菌剂如5%（V/V）煤酚皂溶液等中过夜消毒，再按上法清洗备用。
3.清洁液的配制和使用当玻璃器皿不能用肥皂水或去污粉洗净时，可用清洁液浸泡。清洁液的配方有多种（表2-3），可根据需要选用。
表2-3 清洁液的配方
配方ⅠⅡⅢⅣⅤ重铬酸钾（g）80 60 50 200 100
粗浓硫酸（ml）100 90 900 500 800 水（ml）1000 750 100 500 200 配制时，先将重铬酸钾溶于水中，可加热助溶，待冷。然后将粗浓硫酸缓缓加入上液中，边加边搅拌不可过快，以免产生的高热造成容器的破裂。切忌将重铬酸钾溶液向浓硫酸中倾倒。根据配制量的多少选择烧杯或陶瓷缸作为容器。由于清洁液的腐蚀性较强，用时切勿溅到皮肤和衣服上，同时由于它的吸水性较强，因而应加盖贮存。使用过程中若清洁液颜色变为绿色，提示效力降低，可加入适量的重铬酸钾和浓硫酸继续使用；若变为黑色则不能再用。另外还应注意清洁液适用于已经过清洗但未能洗净的玻璃器皿，对于未清洗、未消毒的器皿不要直接浸泡于清洁液中。
第三节生物化学检验试剂概述
生化检验实际工作中涉及到很多的检验试剂，包括常用化学试剂、试剂盒，其正确选择、保存与配制是实验室工作的基本要求。
一、化学试剂的种类与保存
（一）化学试剂的种类
化学试剂有不同的等级规格，各自的纯度和用途也不尽相同，参照进口化学试剂的质量标准，我国将化学试剂（通用试剂）分为四个常用等级。
1.一级优级纯（G.R）又称保证试剂，绿色标签，该级别纯度最高、杂质含量最低，适用于科研和配制校准溶液。
2.二级分析纯（A.R）又称分析试剂，红色标签，该级别纯度较高、杂质含量较低，适用于定性和定量分析。
3.三级化学纯（C.P），蓝色标签，该级别质量略低于二级品，适用于一般定量分析和定性试验。
4.四级实验试剂（L.R），黄色标签，该级别试剂质量较低、但比工业用高，适用于一般定性实验。
生化检验一般选择三级或三级以上的试剂，若需要准确的定量分析或配制校准溶液则必须选用二级以上的化学试剂。
另外，还有光谱纯试剂（S.P）、层析纯试剂（ch.p）等，指用光谱法、层析法等测不出杂质含量，主要作为相应分析的基准物质。
（二）化学试剂的保存
目前生化检验使用的化学试剂种类繁多，包括剧毒、麻醉、易燃易爆及强腐蚀品等。为了保证试剂的质量、延长使用期限，使用者和管理者必须了解各种化学试剂的性质，科学存放，以保证安全防止质变。
化学试剂的保存原则如下：①按液体、固体性状分类，同时按序排列并作好登记，贮于干燥阴冷处。②对于易燃、易挥发的药品应用蜡封瓶塞，贮于干燥阴冷处或冰箱内。③强酸、强碱试剂应分别存放。④剧毒药品则应由专人管理，每次使用应记录用量并做好登记。
二、化学试剂的配制
多数化学试剂只有配制成实验试剂后才能用于临床实验室。化学试剂的配制常根据需要分为两大类，直接配制法和间接配制法。直接配制法适用于校准液和一般试剂的配制。间接配制适用于不易恒重的固体试剂和含量不准的液体试剂，即先配制大概浓度，然后再用校准液标定出准确浓度。
配制中应注意：①固体试剂恒重后准确称量。称量是决定所配试剂浓度准确与否的关键，应采用称量瓶或玻璃纸盛装。②液体试剂取量时选择合适的量器准确吸取要求的体积。③试剂配制的溶剂一般为蒸馏水或去离子水，应注意对蒸馏水的要求，若需其他溶剂则需注明清楚。④各类试剂分别溶解后按要求顺序混合，最后稀释至刻度。⑤配制好的试剂应在其容器上注明名称、浓度以及配制时间。
配制过程中常用的计算方式包括：①百分浓度，如质量-质量百分浓度（W/W），体积-体积百分浓度（V/V）。②质量-体积浓度（W/V）。③物质的量浓度（摩尔浓度）。④百分浓度与物质的量浓度之间的换算。⑤稀释公式的应用等。详细计算参见分析化学教材。
实验2-1 磷酸盐缓冲液的配制
【原理】
酸碱缓冲液是一种能够抵抗外来少量酸、碱（或内部化学反应产生的少量酸、碱）或稀释而自身pH不会发生明显改变即具有缓冲作用的溶液。缓冲液一般由共轭酸及共轭碱所组成，其中酸性缓冲液一般为弱酸及其共轭碱，碱性缓冲液一般为弱碱及其共轭酸。它们对外来的OH-和H+具有双向调节作用，从而阻止pH 发生剧烈的变化。磷酸盐缓冲液（PBS）由Na2HPO4与NaH2PO4（其金属离子还可以是K+等）组成，其中Na2HPO4可缓冲H+，而NaH2PO4可缓冲OH-。
【试剂】
1.分析纯Na2HPO4或Na2HPO4· 7H2O
2.分析纯NaH2PO4 · H2O或NaH2PO4 · 2H2O
【操作步骤】
1. 0.2mol/L Na2HPO4贮存液（A液）称取Na2HPO428.39g或Na2HPO4 · 7H2O 53.62g置烧杯中，加入600 ml 蒸馏水，溶解后转入1 000ml 容量瓶，用少许蒸馏水清洗烧杯并转入容量瓶中，最后加蒸馏水至刻度。
2. 0.2mol/L NaH2PO4贮存液（B液）称取NaH2PO4·H2O 27.60g或NaH2PO4 · 2H2O 31.21g置烧杯中，加入600 ml 蒸馏水，溶解后转入1 000 ml 容量瓶，用少许蒸馏水清洗烧杯并转入容量瓶，最后加蒸馏水至刻度。
3. 配制pH 5.7～8.0的磷酸盐缓冲液，按表2-4操作：
表2-4 pH5.7～8.0的磷酸盐缓冲液A液、B液配方（ml）pH值A液B液pH值A液B液pH值A液B液
5.7
6.5 93.5 6.5 31.5 68.5
7.3 77.0 23.0
5.8 8.0 92.0
6.6 3
7.5 62.5 7.4 81.0 19.0
5.9 10.0 90.0
6.7 43.5 56.5
7.5 84.0 16.0
6.0 12.3 8
7.7 6.8 49.0 51.0 7.6 87.0 13.0
6.1 15.0 85.0 6.9 55.0 45.0
7.7 89.5 10.5
6.2 18.5 81.5
7.0 61.0 39.0 7.8 91.5
8.5
6.3 22.5 7
7.5 7.1 67.0 33.0 7.9 93.0 7.0
6.4 26.5 73.5
7.2 72.0 2
8.0 8.0 94.7 5.3
【注意事项】
1.所用试剂最好选择A.R或G.R，且需经过恒重后才能进行称量配制。（恒重：除了溶解性固体外系指连续两次灼烧或烘烤后的质量差异在0.2mg以下。）
2.所用器皿必须清洁干燥，容量仪器则应经过校正，以保证配制的准确。
3.A液、B液分别为碱性母液、酸性母液。所配缓冲液的pH值用酸度计测量后不达标时，一般采用适量的A液或B液进行调整，有时也用1mol/L的NaOH 或盐酸调整。
4.缓冲液的浓度越大缓冲容量越大，一般缓冲液总浓度为0.05～0.2 mol/L之间。前面所配的各pH值可在配制后再各加蒸馏水至200 ml，使其浓度为0.1 mol/L （对倍稀释）。
5.温度影响pH值，温度升高pH值下降。应在测定温度下根据标准缓冲液的的pH值对酸度计两点校准后，再准确测定所配缓冲液的pH值。
三、试剂盒的选择及评价
用于检验项目测定的含有使用说明书的所有配套试剂的组合，称为试剂盒（reagent kit，或kit）。生化检验试剂盒应用最广，商品化的试剂盒品种多样，应选择可靠、实用的试剂盒使用。
（一）试剂盒的选择
目前生化检验商品试剂盒常见的有液体、干粉（片）、冻干等包装类型。
液体型试剂盒均一性好、瓶间差异较小、重复性好、不需复溶而可避免外源
性水质的影响、测定结果较为准确等，其不足之处在于保存时间较短（特别是酶试剂）、不便于运输。在液体试剂中又分为单一试剂和液体双试剂两种，单一试剂简单但抗干扰能力差，液体双试剂则在保持了单一试剂优点的基础上增强了抗干扰的能力和试剂的稳定性，使酶与辅酶能够在水溶液中较长期的保存。
冻干型为试剂溶解后先分装成液体，再经冻干处理而成，其中各组份的混合相当均匀，但试剂中残留的含水量不易准确控制，易造成瓶间差。
干粉（片）型为各种干燥的化学试剂经粉碎混合（压片）而成，分装过程中的称量以及加工过程中的混合均易造成瓶间差。
冻干型与干粉（片）型均存在复溶的问题，而复溶对水的质与量要求较高，同时复溶后的保存期较短、稳定性较差，易造成浪费。故选择商品试剂盒时应结合本实验室的具体条件。
（二）试剂盒的评价
1.初步检查作为商品试剂盒首先必须具有完整牢固的内外包装、详尽明确的说明书和优良的试剂外观。
（1）内外包装应完整牢固，印有清晰的产品名称、生产批号、生产单位、保存条件及失效日期。
（2）说明书印刷应清楚、详尽，内容包括：名称、用途、测定原理和技术要求、适用的仪器、试剂内容（包括各组份浓度或比例、所附校准物、有无稳定剂、防腐剂、填充剂等）以及试剂使用方法、试剂应用液的具体配制方法与保存、样本要求、测定条件、校准物的选择及使用方法、标准曲线（校准曲线）的绘制、对干扰物样本的处理、结果的计算及解释、注意事项、参考范围、性能指标、失效指标、生产单位和地址等。
（3）试剂外观检查包括对试剂颜色、性状及溶解度的肉眼观察，可获得初步的评价结果。若色泽改变、出现凝块或异物、溶解时出现浑浊均说明试剂已变质或受到污染。
2.性能指标评价根据国家卫生部颁发的试剂盒质量检定标准对主要技术指标包括准确度、精密度、干扰、线性范围、稳定性及反应时间曲线等进行逐项检测评价。但应注意评价前要对所用的仪器、量器进行校正，同时严格控制实验条件，由熟练的技术人员操作。
稳定性试验是指试剂盒的不同状态在不同条件下贮存后所能保持测定准确
性的性能。状态：原包装及配制的工作液，条件：室温、冰箱温度，最终指标：有效期（一般指标为试剂空白和高值样本吸光度的变化范围等）。需要注意的是工作液的稳定性与使用过程中是否受到污染密切相关，因此要严防污染。
反应时间曲线（终点法、连续监测法）参见第五章、第六章相关内容。 其他性能指标的评价参见本章第六节中的方法学评价试验。
第四节 参考范围和医学决定水平
临床生化检验项目对于受试者有何临床意义，是正常还是异常，是否及如何给予医疗措施，疗效如何，等等，这便涉及到项目参考范围及医学决定水平。
一、参考范围 （一）参考范围的建立
参考范围的建立应包括参考个体、参考总体、参考抽样组（参考样本）、参考值、参考分布、参考值范围和参考值区间等。它们各自的意义及相互关系如下：
参考个体——按预定标准选择的个体。即界定了地区、民族、性别、年
龄段等条件的个体，包括排除标准，如不能有器质性疾病、乙肝阳性，近期的急性感染、输血或手术、服药、妊娠或哺乳等
↓组成
参考总体——所有参考个体的集合，其人数是估测的
↓选定
参考抽样组——从参考总体中抽样选择的一定数量的参考个体，其足以代表参考人群，又称参考样本
↓测定
参考值——每一个参考个体检测后的项目值为该个体的参考值 ↓集合
参考值范围——所有参考抽样组剔除离群值并补充数据后的各个参考值的集合范围，其分布可呈正态或偏态
↓计算（包含95％的参考总体的参考值范围）
参考值区间——（双侧时）正态：-x ±1.96s ，即（-x －1.96s ）～（-x ＋1.96s ）；偏态（百分位数法）：2.5％位数（P 2.5）的参考限～97.5％位数（P 2.5）的参考限
↓比较
将受试者检验结果与参考值区间进行比较
在建立参考范围时应该注意：①参考抽样组人数一般为100例以上，若为偏态分布（非正态分布）则应在120例以上，特殊情况时也至少在30例以上。②离群值的判断与处理：将疑似离群值和其邻近值相减后的绝对值除以极差（最大值－最小值），若≥1/3则为离群值。离群值必须剔除，再补足数据。③项目偏高、偏低均属异常的为双侧参考值区间，已如上述。项目只偏低或只偏高属异常的则取单侧参考值区间，正态： -x －1.65s 或-x ＋1.65s ；偏态：P 5或P 95的参考限。④参考值范围的含义指所有参考值剔除离群值并补充数据后的整个集合范围，参考值区间指所有参考值剔除离群值并补充数据后在95％的分布范围。显然参考值区间只是参考值范围的一大部分（95％），二者并不相等。现很多地方都将参考值区间简称为参考范围（reference interval ，参考区间），可见其所简称的参考范围并非参考值范围去掉“值”后的简称。本书亦将参考值区间引用为参考范围。⑤除受人群的影响以外（一般不特别指出时为成人），参考范围还随测定方法种类（测定原理）、试剂厂家与批号、仪器、测量程序等的不同而不同，并非一成不变，故不能机械地进行比较。
（二）参考范围概念的正确使用
参考范围曾被称为“正常值”、“正常值范围”、“正常范围”等，在20世纪80年代以前其概念的使用一度十分混乱。“正常范围”等使用不合理的原因在于：①“正常”是相对的。“正常”给人的感觉是健康，若检测值不在其范围内，照此理解即为“不正常”。实际上，绝对的健康是不存在的，在每个人身上都可能存在着某种程度的亚健康状态、病理状态。②是正常的人被判为 “不正常”。参
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中位数与百分位数
将一组观察值从小到大按顺序排列，位次居中的观察值就是中位数。百分位数
是一种位置指标，百分位数值即百分位数的参考限，可以由公式计算，具体参见马斌荣主编的《医学统计学》。
百分位数法既适用于偏态分布的计算，也适用于正态分布。
考抽样组即健康人群95％的分布范围以外另5％的正常人在此“正常范围”范围
之外，被定为患病，显然是错误的。若在规定的“参考范围”之外就好理解了。
③不正常的人被纳入“正常”。从疾病的发生发展过程来看，从早期的阴性到后
期的阳性，都有一个或长或短的过程，参考抽样组中可能存在患有某疾病早期的
受试者，或者患有与所检测项目无关或暂时无关的另一种疾病，所有这些情况都
不属于“正常”。
由于在使用过程中，“正常范围”的概念容易使人产生误解，在1969年由
Grasbeck等提出了用参考范围代替正常范围。1978年国际临床化学和实验室医学联合会（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，
IFCC，国际临床化学协会，国际临床化学联合会）作了正式推荐。现在医学界普遍主张使用参考范围这一概念。
二、医学决定水平
根据参考范围对某一诊断试验的结果进行解释时，有结果正常与异常之分，
但它不能说明或排除受检者是否有病，同时受检者处于疾病的不同时期其检测结
果也不相同。因此临床上需要一个确定病情、判断疗效和预后的一个临界值。1968
年Beknett首先提出了医学决定水平
概念：是指临床上按照不同病情给予不
同处理的指标阈值。DL（或用X C表示）
可以用来除外或确定某一临床情况或预
告将会出现的某一生理变化现象。
从健康与疾病两组人群的理论分
布可以说明医学决定水平与参考范围之
间的关系（图2-1）。A组为健康状态良
好的人群，两箭头之间表示其所得出的参考范围，B组则为某种疾病的患者。
DL1、DL2分别为低值、高值医学决定水平，DL1左侧的数值可除外B组疾病；DL2右侧的数值可确定患者存在B组疾病；DL1与DL2之间则表明健康与疾病存在交叉。
不同指标的医学决定水平的数量、数值不同（表2-5）。如血清清蛋白（Alb）
有三个DL，分别是20g/L、35g/L、52g/L。其中20g/L表示肝病患者的预后严重；35g/L为检查低清蛋白血症的界值；52g/L则稍高于参考范围上限，可除外许多假阳性。血清钙有三个DL，分别是 1.75mmol/L、2.75mmol/L、3.38mmol/L。
1.75mmol/L作为低血钙抽搐的第一个决定性水平值，等于或低于1.75mmol/L时，应加做其他检查以明确病人发生抽搐的可能性，并采取预防措施；
2.75mmol/L 作为观察副甲状腺功能是否亢进的血清钙低限值，等于或高于该值时，应加做其他检查以确诊或排除原发性副甲亢的诊断；若大于
3.38mmol/L则考虑为高血钙昏迷，应及时做出诊断，不得延误。
表2-5 临床生化检验指标的医学决定水平
血清指标（单位）参考范围* X C①X C②X C③
K+ mmol/L 3.7～5.3 3.0 5.8 7.5
Na+ mmol/L 138～146 115 135 150
Cl-mmol/L 98～109 90 112 —
总Ca mmol/L 2.25～2.65 1.75 2.75 3.38
Urea mmol/L 2.9～9.3 2 10 18
Cr μmol/L 62～133 50 140 530
UA mmol/L 0.15～0.41 0.12 0.47 0.63
TC mmol/L 3.90～6.50 2.4 6.50 10.4
TG mmol/L 0.22～1.98 0.22 2.0 4.4
Glu mmol/L 3.30～5.23 2.48 6.6 10.0
Bill μmol/L 1.7～20.5 25 40 350
Alb g/L 35～50 20 35 52
TP g/L 60～80 45 60 80
ALP U/L成人25～90 ———儿童50～350 50 135 400
ALT U /L 5～30 20 60 300
AST U /L 8～30 20 60 300
CK U /L 10～120 60 200 1500
LDH U /L 100～320 200 450 800
AMY U /L 110～330 90 225 370
GGT U /L 5～30 15 45 150 *参考范围：已如前述，不同实验室的范围略有不同，X C也是如此。
第五节实验方法与参考物质概述
实验方法（测量方法）产生测量程序，部分测量程序可溯源至国际单位制(SI)单位，测量程序为下一级参考物质定值，参考物质又校准下一级测量程序，直至常规样品（图2-2）。
一、实验方法的分级
（一）相关基本概念（ISO定义）
1．测量方法(method of measurement)进行测量时所用的、按类别叙述的逻辑操作次序。
2．测量程序(measurement procedure)用于特定测量的、根据给定的测量方法具体叙述的一组操作。
测量方法即为实验方法、分析方法，相当于操作原理，一个测量方法可以产生出多个测量程序，测量程序相当于具体操作步骤。通过测量程序可直接得到测量结果，而测量方法则不能。
测量程序有时也称为标准操作程序(standard operating procedure，SOP) 或分析方案(analytical protocol)，相当于临床检验操作规程。
3．真值与给定的特定量的定义一致的值称为真值(true value)。其特点：真值只有通过完美的测量才能获得（实际上除理论值外很难获得），真值按其本性是不确定的、可以有多个。在实际工作中经常使用的是约定真值。
4．约定真值对于给定的目的具有适当的不确定度，赋予特定量的值，有时它是通过约定而被采用的值，称为约定真值(conventional true value)，有时也称为定值、最佳估计值或参考值。常用某量多次测量的平均值来确定约定真值。
5．不确定度(uncertainty)与测量结果的分散性相联系的参数。
过去一直用一组重复测量的结果的标准差或变异系数来描述测量结果的分散性，但这只是结果的不确定性的一部分，只反映所使用的测量程序在规定条件下的随机不确定性，还有另外一些因素如仪器、方法、样本、试剂等非重复测量因素造成的结果不确定性。
不确定度可通过实验进行评定，称不确定度的A类评定；亦可根据实验以外的经验性信息或数据进行评定，称不确定度的B类评定。将所有不确定度合并得合成不确定度，将合成不确定度乘以一定系数得出一定置信水平下的扩展不确定度。
（二）实验方法的分级
根据分析方法的准确度与精密度的不同，IFCC将分析方法分为三级，ISO15189文件又将其具体细化为相应的一个或多个测量程序。
1．决定性方法（definitive method）其准确度最高，系统误差最小。经详细研究还未发现产生误差的原因，用该法测得的结果与“真值”最为接近。由于该法技术要求太高，费用昂贵，因此不直接用于鉴定常规方法的准确性，只用于产生一级参考测量程序和评价参考方法。国际上研究该类方法的实验室较少，主要在美国、法国、德国、丹麦等。其主要方法包括同位素稀释－质谱分析法（ID-MS）、中子活化法、重量法等（表2-6）。
决定性方法的测量原理等同于ISO的一级测量原理，由其产生的测量程序称为一级参考测量程序(primary reference measurement procedure)，是具有最高计量学特性的参考测量程序，主要由国家计量机构建立，其操作可被完全描述和理解，所有的不确定度可用SI单位表示，结果不用参考被测量的测量标准而被接受。一级参考测量程序为一级参考物质定值。
2．参考方法（reference method）指准确度与精密度已被充分证实，并且经公认的权威机构（包括国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）所颁布的方法。它的干扰因素少，系统误差小，且有适当的灵敏度、特异性以及较宽的分析范围和良好的线性。参考方法在条件优越的实验室可作常规分析。
参考方法可再分为两类：①公认的参考方法，已用决定性方法和一级参考物证实，作为参考方法已在学术界得到公认。②推荐的参考方法，分析原理合理，但还有待证实，或者待测物本身性质复杂或化学组成不清楚，没有决定性方法可以证实，因此仅被部分学术组织认可与推荐。
表2-6 生化检验项目的决定性方法、参考方法、常规方法
项目决定性方法参考方法常规方法
钾ID-MS、中子活化法火焰光度法火焰光度法、离子选择电极法钠中子活化法、重量法火焰光度法火焰光度法、离子选择电极法氯ID-MS、中子活化法库仑滴定法硫氰酸汞法、离子选择电极法
钙ID-MS 原子吸收分光光度法邻甲酚酞络合酮法、MTB法* 镁ID-MS 原子吸收分光光度法MTB法
磷ID-MS —米吐尔直接法、孔雀绿试剂法清蛋白—免疫化学法溴甲酚绿法
总蛋白—凯氏定氮法双缩脲法
肌酐ID-MS 离子交换层析法苦味酸比色法
尿素ID-MS 尿素酶法二乙酰一肟法、脲酶波氏法
尿酸ID-MS 尿酸酶法（紫外）磷钨酸比色法
胆红素—重氮反应法J-G法
葡萄糖ID-MS 已糖激酶法葡萄糖氧化酶法
胆固醇ID-MS Abell法L-B反应直接法、酶法
TG ID-MS Van Handel法酶法
AST —MDH-NADH法赖氏法
ALT —LDH-NADH法赖氏法
GGT —连续监测法r-L-谷氨酰-α萘酚比色法
CK —NAD+偶联法比色法
*MTB：甲基麝香草酚蓝
参考方法的主要用途：①鉴定常规方法，评价其偏差及干扰因素，并决定其是否可以被接受。②鉴定二级参考物质和为质控物定值。③评价商品试剂盒的质量。④产生二级参考测量程序。
按照参考方法的测量原理建立的测量程序称为二级参考测量程序(secondary reference measurement procedure)，在临床检验领域中发挥主要作用。它们被称作“二级”，只是计量学上的分级，因需一级参考物质校准。它们是高度特异、精
密，适合于分析复杂生物样品的方法，而一级参考测量程序在不少情况下只适合于一级参考物质（纯物质）的鉴定，不适合生物基质样品的分析。
如上所述的一个测量方法可以产生出多个测量程序，参考方法可以产生出厂家选定测量程序、厂家常务测量程序、用户常规测量程序，前两个程序为厂家工作校准物、厂家产品校准物定值。
还有一类比二级参考测量程序等级低的国际约定参考测量程序(international conventional reference measurement procedure)，它们得出的结果不能溯源至SI单位，但被广泛承认。其可以为厂家工作校准物定值。
一级、二级、国际约定参考测量程序可统称为参考测量程序。
3．常规方法（routine method）是指具有足够的精密度、准确度和特异性，且有适当的分析范围、经济实用以及性能指标符合临床检测的方法。根据准确度的确定与否又可分为偏差已知的常规方法、偏离未知的常规方法两种。
常规方法在做出评价后，经相关学术组织认可即可作为推荐方法。
与常规方法的测量原理相对应的测量程序是部分的用户常规测量程序，但部分用户即参考实验室可采用参考测量程序测定样品。
二、参考物质的分级
（一）相关基本概念（ISO定义）
1．参考物质具有一种或几种理化性质已经充分确定的特性，用以校准仪器、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质，称为参考物质（reference material，RM）。国内多称为标准物质、标准物、标准品。参考物质包括校准物质(calibration materia1，校准物)和正确性质控物质(trueness control material)。参考物质可以是纯的或混合的液体、固体（如镨钕滤光片）或气体（如标准的CO2气体）。
2．测量系统(measuring system)完成一个项目所涉及的仪器、试剂、校准物、测量程序、质量控制、保养计划等的组合。又称为检测系统（test system）。
3．溯源性(traceability)通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家或国际测量标准相联系起来的特性，称为溯源性。其不间断的比较链称为溯源链。
溯源性是测量结果（包括测量标准即校准物的测量结果）的属性，不宜用于
测量方法或测量程序。连续的比较链是指计量学级别由低到高的、交替出现的测量程序和校准物，如图2-2由下至上的链。
“测量标准”在检验医学领域可简单理解为参考物质或参考测量程序，与参考标准的联系可以是直接的，也可以通过中间测量程序和校准物间接进行，即溯源链可长可短，但理论上应使溯源链尽可能短，如图2-2中的二级参考测量程序可直接定值厂家工作校准物。溯源链的理想终点是SI单位的定义，但目前只有少部分检验项目可以溯源至SI单位，而多数项目只能溯源至国际约定校准物质或国际约定参考测量程序，甚至是厂家校准物和／或测量程序。
4．参考实验室参考测量实验室的简称，是运行参考测量程序、提供有给定不确定度的测量结果的实验室。参考实验室有很高的技术和管理要求，往往需要通过特定的程序才能成为参考实验室。对于同一检验指标，参考实验室最好形成国际网络，并定期进行测量比对，以保证参考测量的有效性。目前国际上有参考实验室网络的检验指标有胆固醇、酶催化活性、糖化血红蛋白等。
（二）参考物质的分类与分级
如上所述，参考物质分为校准物质和正确性质控物质。校准物质又称校准物(calibrator)，是在校准函数中其值被用作自变量的参考物质(对测量系统校准或对材料赋值)。正确性质控物质（国内多称为质控物、质控品、控制物）是用于评价一种测量系统的测量偏差的参考物质。
可见参考物质有校准和评价测量系统两个主要功能。一种参考物质在一个测量程序或测量系统中或用作校准物质，或用作正确性质控物质，但不可以同时用作校准物质和正确性质控物质。换言之，质控物不能当作校准物使用，校准物也不能当作质控物使用。
质控物用于控制病人样本检测的误差，即常规质量控制。根据有无测定值可分为定值和非定值定值血清两种，其值用适当的校准物以参考方法确定；根据物理性状又可分为冻干质控物（血清）、液体质控物（血清）和混合血清。
根据参考物质的校准性质一般可分为三级。
1．一级参考物质（primary reference material，一级校准物、原级参考物、一级标准品）是一种高度稳定而均一的物质，所含的杂质已经定量。具有最高计量学特性的参考物质，是测量单位的具体体现。其值由决定性方法产生的一级
参考测量程序确定。其用途是校准二级参考测量程序以及为二级参考物质定值。一级标准品均有证书，属于有证参考物质(certified reference material，CRM)，在美国由国家标准和技术研究院（NIST）颁发，并且指明了它的性质和相关数据。美国由于发现标准物质最早，又一直处于世界领先地位，至今仍将一级参考物质称为标准参考物质（standard reference material，SRM）。
2．二级参考物质（secondary reference material，二级校准物、次级参考物、二级标准品）由二级参考测量程序定值，可以是与实际临床样品基质相似的物质。其用途是为校准试剂盒厂家选定测量程序。在发达国家的二级参考物质通常是有证参考物质。有学者将二级参考物质称为主校准物（master calibrator）。
需要强调的是，只有对于可溯源至SI单位的小分子检验项目，才可分为一级参考物质和二级参考物质。
3．工作校准物(working calibrator)工作校准物可以分为厂家工作校准物、厂家产品校准物，分别由厂家选定测量程序、厂家常务测量程序定值。
一般的临床实验室对样本的常规测量程序使用的校准物为厂家产品校准物。
按定义，参考物质是一个较宽的概念，一级、二级校准物是参考物质（国内多称呼为标准物、标准液），试剂盒中的校准物也是参考物质，但一般情况下参考物质是指较高级别的参考物质，它们多数是有证参考物质。因此，试剂盒及临床实验室配制的校准液一般不能称为标准液。有证参考物质和一般参考物质的区别是前者有明确的溯源性和不确定度要求。
另外，还有一类重要参考物质是国际约定校准物质(international conventional calibration material)，它们的量值不能溯源至SI单位，但属于国际约定的，因而也被广泛承认。与其相对应的定值测量程序是国际约定参考测量程序(international conventional reference measurement procedure)。国际约定校准物可以校准厂家选定测量程序。
第六节实验方法的选择与评价
实验方法是否适合于临床，必须进行严格的选择与评价。选择实验方法的目的在于选择一个既符合本实验室条件、又有较好的性能特点的方法。方法性能由方法学评价试验得到。方法学评价指通过一系列的评价试验，对各项试验所得的结果进行统计学处理和分析，得出该方法能够达到的精密度、准确度、线性范围
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生物化学实验知识点整理 实验一 还原糖的测定、实验二 粮食中总糖含量的测定 1.还原糖测定的原理 3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕色的氨基化合物,在550nm 处测定光的吸收增加量，得出该溶液的浓度，从而计算得到还原糖的含量 2.总糖测定原理 多糖为非还原糖，可用酸将多糖和寡糖水解成具有还原性的单糖，在利用还原糖的性质进行测定，这样就可以分别求出总糖和还原糖的含量 3.电子天平使用 4.冷凝回流的作用： 使HCl 冷凝回流至锥形瓶中，防止HCl 挥发，从而降低HCl 的浓度。 5.多糖水解方法： 加酸进行水解 6.怎样检验淀粉都已经水解： 加入1-2滴碘液，如果立即变蓝则说明没有完全水解，反之，则说明已经完全水解。 7.各支试管中溶液的浓度计算 8.NaOH 用量：HCl NaOH n n = 9.不能中途换分光光度计,因为不同的分光光度计的光源发光强度不同 10.分光光度计的原理：在通常情况下，原子处于基态，当通过基态原子的某辐射线所具有的能量（或频率）恰好符合该原子从基态跃迁到激发态所需的能量（或频率）时，该基态原子就会从入射辐射中吸收能量，产生原子吸收光谱。原子的能级是量子化的，所以原子对不同频率辐射的吸收也是有选择的。这种选择吸收的定量关系服从式/E h hc νλ?==。 实验证明，在一定浓度范围内，物质的吸光度A 与吸光样品的浓度c 及厚度L 的乘积成正比，这就是光的吸收定律，也称为郎伯-比尔定律 分光光度计就是以郎伯比尔定律为原理，来测定浓度 11.为什么要水解多糖才能用DNS 因为DNS 只能与还原糖溶液在加热的条件下反应生成棕红色的氨基化合物，不能与没有还原性的多糖反应。 12.为什么要乘以0.9 以0.9才能得到多糖的含量。 13.为什么要中和后再测？ 因为DNS 要在中性或微碱性的环境下与葡萄糖反应 实验三 蛋白质的水解和纸色谱法分离氨基酸、实验四 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 1.纸色谱分离氨基酸分离原理 由于各氨基酸在固定相（水）和流动相（有机溶剂）中的分配系数不同，从而移动速度不同，经过一段时间后，不同的氨基酸将存在于不同的部位，达到分离的目的。 2.天然氨基酸为L 型 3.酸式水解的优点是：是保持氨基酸的旋光性不变，原来是L 型，水解后还是L 型，由于甘氨酸所有的R 基团是氢原子，所以它不是L 型
临床生化检验知识点
临床生化检验 1、糖酵解：指从葡萄糖至乳糖的无氧分解过程，可生成2分子ATP。是体内糖代谢最主要途径。最终产物：乳酸。依赖糖酵解获得能量：红细胞。 2、糖氧化——乙酰CoA。有氧氧化是糖氧化供能的主要方式。1分子葡萄糖彻底氧化为CO2和H2O，可生成36或38个分子的ATP。 3、糖异生：非糖物质转为葡萄糖。是体内单糖生物合成的唯一途径。肝脏是糖异生的主要器官。防止乳酸中毒。 4、血糖受神经，激素，器官调节。 5、升高血糖激素：胰高血糖素（A细胞分泌），糖皮质激素和生长激素（糖异生）,肾上腺素（促进糖原分解）。 降低血糖激素：胰岛素（B细胞分泌）（唯一） 6、糖尿病分型： Ⅰ型：内生胰岛素或C肽缺，易出酮症酸中毒，高钾血症，多发于青年人。 Ⅱ型：多肥胖，具有较大遗传性，病因有胰岛素生物活性低，胰岛素抵抗，胰岛素分泌功能异常。 特殊型及妊娠期糖尿病。 7、糖尿病的诊断标准：有糖尿病症状加随意血糖≥11.1 mmol/L；空腹血糖（FVPG）≥7.0 mmol/L；（OGTT）2h血糖≥11.1 mmol/L。初诊需复查后确证。
8、慢性糖尿病人可有：白内障（晶体混浊变形），并发血管病变以心脑肾最重。 9、糖尿病急性代谢并发症有：酮症酸中毒（DKA，高血糖，尿糖强阳性，尿酮体阳性，高酮血症，代谢性酸中毒，多＜40岁，年轻人），高渗性糖尿病昏迷（NHHDC，血糖极高，＞33.6mmol/L，肾功能损害，脑血组织供血不足，多＞40岁，老年人），乳酸酸中毒（LA）。10、血糖测定：葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法（GOD-POD法）。己糖激酶法（HK）：参考方法 （＞7.0mmol/L称为高血糖症。＜2.8mmol/L称为低血糖症。） 11、空腹低血糖反复出现，最常见的原因是胰岛β细胞瘤（胰岛素瘤）。胰岛B细胞瘤临床特点：空腹或餐后4—5h发作，脑缺糖比交感神经兴奋明显，有嗜睡或昏迷，30%自身进食可缓解故多肥胖。 12、血浆渗透压=2（Na+K）+血糖浓度。 13、静脉血糖〈毛细血管血糖〈动脉血糖。 14、血糖检测应立即分离出血浆（血清）尽量早检测，不能立即检查应加含氟化钠的抗凝剂。 15、肾糖阈：8.9—10.0mmol/L。 16、糖耐量试验：禁食10—16h，5分钟内饮完250毫升含有75g无水葡萄糖的糖水，每30分钟取血一次，监测到2h，共测量血糖5次（包括空腹一次）。
生化实验操作考核要点(新)
【实验操作考核要点】 一、目的要求 1．掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2．了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3．正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4．熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5．正确掌握溶液转移的操作。 6．正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1．吸量管操作（20分）； 2．可调式微量移液器操作（20分）； 3．溶液混匀操作（视具体情况，采用合适的混匀方法）（15分）； 4．溶液转移操作（10分）； 5．分光光度计比色操作（25分）。 6．整体表现（10分）。 三、操作考核标准 （一）吸量管操作（20分，每项操作5分） 1．执管 要求右手拿吸量管，左手拿橡皮球，只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度；吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2．坐姿 要求腰、背保持竖直，看刻度时眼睛保持平视。 3．吸取溶液 吸量管插入液面深度约0.5cm，不能一插到底，也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内；调控吸量管吸取液量的刻度时，吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4．排出液体
吸量管尖应靠上受纳容器内壁，让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压，而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。 （二）可调式微量移液器操作（20分，每项操作5分） 1．设定容量值 转动加样器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮，可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。 2．吸液 （1）选择合适的吸头安放在取液套筒上，稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙； （2）把按钮压至第一停点，垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮，吸入液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留2-3秒，使管尖外侧的液滴滑落。 3．放液 （1）将吸头口贴到容器内壁底部并保持100°~40°倾斜； （2）平稳地把按钮压到第一停点，等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体； （3）压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过，再松开按钮。按吸头弹射器除去吸头。 4．压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。取液器吸嘴为一次性使用。实验完毕，将取液器读数调至最大量程值，竖立放于支架上。 （三）溶液的混匀（操作流程中下划实线的三处，每项操作5分，共15分）1．肝糖原的提取与鉴定操作中，肝匀浆上清液中加5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2．肝糖原定量测定中，肝组织消化液沸水浴后全部转入100 ml容量瓶，加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。 3．肝糖原定量测定中，加蒽酮溶液后的混匀，可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。因蒽酮溶液（浓硫酸配制）比重大于样品水溶液很多，一加入便沉于管
生物化学实验内容
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
生物化学实验重点试题
一、解词 1、总氮量水中各种形态无机和有机氮的总量 2、酶的抑制作用是指在某个酶促反应系统中，某种低相对分子质量的物质加入后，导致酶活力降低的过程。 3、酶的最适温度酶催化活性最高时的温度 4、蛋白质的等电点每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零即等电点 5、盐析增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象 6、蛋白质变性蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失6、酶的专一性酶对底物及其催化反应的严格选择性通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应 7、激活剂能提高酶活性的物质大部分是离子或简单的有机化合物 8、抑制剂凡能使酶催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质 9、酶催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体 二、填空 1、球蛋白可在半饱和中性硫酸铵溶液中析出，清蛋白可在高盐浓度溶液中析出。 2、在PH3.0、和9.5时的电场中，卵清蛋白（PI4.6）移动方向分别为负移 动，正移动。 3、唾液淀粉酶的最适温度是37 4、还原糖与本乃狄试剂共热现象生成生成砖红色沉淀。 5、维生素C也称抗坏血酸，它具有很强还原性 6、用苔黑酚浓盐酸溶液可以鉴定核糖核酸 7、当溶液的PH低于蛋白质等电点时，蛋白质分子带正电荷；当溶液的 PH大于蛋白质等电点时，蛋白质分子带负电荷； 10．凯氏定氮法测定蛋白质含量消化终点颜色为清澈的蓝紫色色。 11．蛋白质变性的实质是空间结构被破坏。 12．常用的RNA提取方法有苯酚法、、高盐法等。 13、维持蛋白质亲水胶体稳定的因素是蛋白质颗粒表面的电荷层 和水化膜、 14、蛋白质在等电点时，主要以两性离子离子形式存在；当溶液的P H＞PI 时，蛋白质分子以负离子形式存在；当溶液的P H＜PI时，蛋白质分子带正离子形式存在。 15、蛋白质分子中氮的平均含量为 5.16% ，样品中的蛋白质含量常以测 氮量乘以 6.25 、即 6 。 三、选择 1、盐析法沉淀蛋白质的原理( ) A 与蛋白质结合成不溶性蛋白盐 B 次级键断裂蛋白质的构象改变 C 中和电荷，破坏水化膜 D 调节蛋白质溶液的等电点 2、以下哪项不是酶的特性（） A 酶是生物催化剂，催化效率极高 B 易受Ph，温度等外界因素的影响 C 能加速化学反应但不改变反应平衡点 D 有高度特异性 3、RNA和DNA的最大紫外吸收值是在（） A 280nm B 260nm C 510nm D 620nm 4、．凯氏定氮法使用的混合催化剂硫酸钾-硫酸铜配比为（） A 1:3 B 5:1 C 3:1 D 1:1
生物化学实验练习题及参考答案[1]
生物化学实验 一、名词解释： 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题： 1. 测定蛋白质含量的方法有，，和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2，其活性大小以来表示，当CAT与H2O2反应结束，再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳，这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶，其自由基的引发剂是，催化剂是______________；光聚合法适于制备大孔径的_________________胶，催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________，_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前，必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，表示E对S的亲合力愈，Km愈大，表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热，注意预热及样品槽空时必须_________（打开、合上）样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中，____________形成固定相，____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的，在具有自由基团体系时，两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种：和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________和________________。 三、问答题： 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些？ 参考答案： 生物化学实验 一、名词解释： 1、电泳：指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法：用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。
生物化学实验
生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部
实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理． 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、．抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计． 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95％乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL
4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、．乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)， 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。 5、准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)
得率： 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。
12级生物化学实验2期末复习题-考试
12级生物化学实验2期末复习题-考试
生物化学实验（2）理论习题 一、名词解释题 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。 2、电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳 3、层析分离技术：是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。 4、吸附色谱法：利用同一吸附剂对混合物中不同成分吸附能力的差异，从而使各成分达到分离目的的色谱法。 5、离子交换层析：以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。 6、分配层析：根据一种或多种化合物，在两种不相
融合的溶剂间的分配来分离物质的方法。 7、亲和层析：是利用生物活性物质之间的专一亲和吸附作用而进行的层析方法。是近年来发展的纯化酶和其他高分子的一种特殊的层析技术。 8、凝胶层析（凝胶色谱）：混合物随流动相经过凝胶层析柱时，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。 9、电渗作用：指在电场作用下液体(通常是水)相对于和它接触的固定的固体相作相对运动的现象。 10、担体：担体是一种化学惰性的，多孔性的固体微粒，能提供较大的惰性表面，使固定液以液膜状态均匀地分布在其表面。 11、死时间：从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间.。 12、保留时间：被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也即从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间。 13、高效液相色谱法：，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，
生物化学实验习题及参考答案
生物化学实验习题及参 考答案 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为（）
临床生化检验知识点
1、糖酵解：指从葡萄糖至乳糖的无氧分解过程，可生成2分子ATP。是体内糖代谢最主要途径。最终产物：乳酸。依赖糖酵解获得能量：红细胞。 2、糖氧化——乙酰CoA。有氧氧化是糖氧化供能的主要方式。1分子葡萄糖彻底氧化为CO2和 H2O，可生成36或38个分子的ATP。 3、糖异生：非糖物质转为葡萄糖。是体内单糖生物合成的唯一途径。肝脏是糖异生的主要器官。防止乳酸中毒。 4、血糖受神经，激素，器官调节。 5、升高血糖激素：胰高血糖素（A细胞分泌），糖皮质激素和生长激素（糖异生）,肾上腺素（促进糖原分解）。 降低血糖激素：胰岛素（B细胞分泌）（唯一） 6、糖尿病分型：Ⅰ型：内生胰岛素或C肽缺，易出酮症酸中毒，高钾血症，多发于青年人。 Ⅱ型：多肥胖，具有较大遗传性，病因有胰岛素生物活性低，胰岛素抵抗，胰岛素分泌功能异常。 特殊型及妊娠期糖尿病。 7、糖尿病的诊断标准：有糖尿病症状加随意血糖≥11.1 mmol/L；空腹血糖（FVPG）≥7.0 mmol/L；（OGTT）2h血糖≥11.1 mmol/L。初诊需复查后确证。 8、慢性糖尿病人可有：白内障（晶体混浊变形），并发血管病变以心脑肾最重。 9、糖尿病急性代谢并发症有：酮症酸中毒（DKA，高血糖，尿糖强阳性，尿酮体阳性，高酮血症，代谢性酸中毒，多＜40岁，年轻人），高渗性糖尿病昏迷（NHHDC，血糖极高，＞ 33.6mmol/L，肾功能损害，脑血组织供血不足，多＞40岁，老年人），乳酸酸中毒（LA）。 10、血糖测定：葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法（GOD-POD法）。己糖激酶法（HK）：参考方法（＞7.0mmol/L称为高血糖症。＜2.8mmol/L称为低血糖症。） 11、空腹低血糖反复出现，最常见的原因是胰岛β细胞瘤（胰岛素瘤）。胰岛B细胞瘤临床特点：空腹或餐后4—5h发作，脑缺糖比交感神经兴奋明显，有嗜睡或昏迷，30%自身进食可缓解故多肥胖。 12、血浆渗透压=2（Na+K）+血糖浓度。 13、静脉血糖〈毛细血管血糖〈动脉血糖。 14、血糖检测应立即分离出血浆（血清），尽量早检测，不能立即检查应加含氟化钠的抗凝剂。 15、肾糖阈：8.9—10.0mmol/L。 16、糖耐量试验：禁食10—16h，5分钟内饮完250毫升含有75g无水葡萄糖的糖水，每30分钟取血一次，监测到2h，共测量血糖5次（包括空腹一次）。
生物化学实验习题及参考答案
生物化学实验习题及参考答案
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI：指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的pH值，用符号pI表示。 2、层析：按照在移动相和固定相（可以是气体或液体）之间的分配比例将混合成分分开的技术。 3、透析：通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲 液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳：在去污剂十二烷基硫 酸钠存在下的聚丙烯酰氨凝胶电泳。SDS-PAGE 只是按照分子的大小，而不是根据分子所带的电荷大小分离的。 5、蛋白质变性：生物大分子的天然构象遭到破坏导 致其生物活性丧失的现象。蛋白质在受到光照，热，有机溶济以及一些变性济的作用时，次级键受到破坏，导致天然构象的破坏，使蛋白质的生物活性丧失。 6、复性：在一定的条件下，变性的生物大分子恢复成具有生物活性的天然构象的现象。
7、Tm 值：核酸分子变性过程中，紫外吸收达到最大增量一半时的溶解温度。 8、同工酶：能催发相同的反应类型但其理化性质及免疫学性质不同的酶。 9、Km值：反应速度为最大反应速度一半时的底物 浓度。是酶的特征物理学常数之一。近似表示酶与底物的亲和力。 10、DNA变性：DNA双链解链，分离成两条单链的现象。 11、退火：既DNA由单链复性、变成双链结构的过 程。来源相同的DNA单链经退火后完全恢复双 链结构的过程，同源DNA之间`DNA和RNA之 间，退火后形成杂交分子。 12、增色效应：当双螺旋DNA熔解（解链）时，260nm 处紫外吸收增加的现象。 二、基础理论单项选择题 1、A； 2、C； 3、B； 4、A； 5、A； 6、B； 7、B； 8、C； 9、D；10、A；11、A；12、D；13、A； 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键？（）
生物化学检验考试重点知识总结教学提纲
生物化学检验考试重点知识总结
临床生物化学与检验 第一章 临床生物化学的概念：临床生物化学与是在人体正常的生物化学代谢基础上，研究疾病状态下生物化学病理性变化的基础理论和相关代谢物的质与量的改变，从而为疾病的临床实验诊断，治疗监测、药物疗效和预后判断、疾病预防等方面提供信息和决策依据的一门学科。（选择题） 第二章 1.血浆蛋白质电泳区带顺序：前清蛋白、清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β1-球蛋白、β2-球蛋白、γ-球蛋白 2.急性时相反应：当人体因感染、自身免疫性等组织损伤（如创伤、手术、心肌梗死、肿瘤等）侵害，诱导炎症，使单核细胞和巨噬细胞等细胞释放紧急反应性因子，再经血液循环，刺激肝脏细胞产生Hp、Cp、CRP等，使其血浆中浓度显著升高，而血浆前清蛋白、清蛋白、转铁蛋白浓度则出现相应下降，此炎症反应过程，称之为急性时相反应(APR),该过程出现的蛋白质统称为急性时相反应蛋白（APP）。各APP升高的速度和幅度有所不同，C-反应蛋白首先升高，在12小时内α1-酸性糖蛋白也升高，尔后α1-抗胰蛋白酶、触珠蛋白、C4和纤维蛋白原升高，最后是C3
和铜蓝蛋白升高，通常在2至5天内这些APP达到最高值。 3.M蛋白→多发性骨髓瘤 4.清蛋白（Alb）的生理功能：①保持血浆胶体渗透压：以维持血管内外体液的平衡。②重要的营养蛋白：用于组织蛋白的补充和修复③血浆中主要的载体蛋白：许多水溶性差的物质，可以通过与Alb的结合而运输④具有缓冲酸碱的能力：蛋白质是两性电解质 5.CRP的临床意义： CRP是第一个被认识的APP。CRP是非特异性指标，主要用于结合临床检测疾病：①筛查微生物感染；②评估炎症性疾病的活动度；③检测系统性红斑狼疮、白血病和外科手术后并发的感染（血清中浓度再次升高）④新生儿败血症和脑膜炎的监测；⑤监测肾移植后的排斥反应等（简答题） 6.体液总蛋白测定的方法：凯氏定氮法是经典的蛋白质测定方法（参考方法）；双缩脲法是常规方法。 7.清蛋白可与阴离子染料溴甲酚绿（BCG）或溴甲酚紫（BCP）结合，而球蛋白基本不结合这些染料。 8.前清蛋白（PA）：在正常血清蛋白电泳（SPE）中显示在清蛋白前方故而得名，生理功能：PA为运载蛋白和组织修
生物化学实验复习题库
生物化学实验复习题库 1、卵磷脂的提取原理： 卵磷脂在脑、神经组织、肝、肾上腺和红细胞中含量较多，蛋黄中含量特别丰富。卵磷脂易溶于醇、乙醚等脂溶剂，可利用这些脂溶剂提取。本实验用95%乙醇提取卵磷脂，用蒸汽浴分离乙醇和卵磷脂 2、卵磷脂的提取原理鉴定新提取得到的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后因所含不饱和脂肪酸被氧化而呈褐色。卵磷脂中胆碱基在碱性条件中分解成三甲胺，三甲胺有特异的鱼腥臭味，可鉴别。 3、糖的颜色反应莫氏试验： 糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与а-萘酚生成紫红色缩合物。因为糠醛或糠醛衍生物对此均呈阳性反应，故不是糖类的特异性反应，但可用来鉴定糖的存在。 4、糖的颜色反应塞氏试验： 酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。此反应是酮糖的特异性反应，醛糖在同样条件下成色反应缓慢，只有在糖浓度高或煮沸时间长时，才微弱的阳性反应。在实验条条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。塞氏试验可鉴别酮糖的存在。 5、何谓纸层析法？ 纸层析是最简单的液一液相分配层析。滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。 因为不同的氨基酸在相同的溶剂中溶解度不同,所以利用在滤纸上迁移速度不同分离氨基酸 6．何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么
Rf为氨基酸的比移值。Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶液前沿的距离 影响纸层析迁移率Rf值的主要因素：1、样品本身的性质和结构；2、溶剂的性质；3、PH 值；4、温度；5、滤纸性质。 7．怎样制备扩展剂？ 8．层析缸中平衡溶剂的作用是什么？ 9．牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成分。蛋白质中的酪蛋白通过等电点沉淀，再通过离心而获得，糖类小分子由于处于清液中而分离，沉淀物中所含有的脂肪通过有机溶剂抽提而去除，最终得到纯白色、晶状酪蛋白。 方法：取新鲜牛乳，加入PH4.7的醋酸缓冲液，40度下沉淀析出酪蛋白，然后洗涤，醇醚吸水至干燥得粉末称重，计算提取率。步骤：保温→调PH→沉淀→离心→洗涤→干燥→称量 10．何谓蛋白质的等电点？有何实用意义？ 蛋白质的等电点：指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的pH值，用符号pI表示。 蛋白质同氨基酸一样为两性电解质，调节蛋白质的PH可使蛋白质带正电或带负电；在pI 时溶解度最低，在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动。 11、蛋白质变性与沉淀的关系。 沉淀可以是由蛋白质变性从而产生沉淀，也可以是由于盐析。蛋白质变性是指光照，热，有机溶济以及一些变性剂（如重金属盐）的作用时蛋白质的空间结构被破坏，使得蛋白质丧失活性，该过程不可逆。盐析是指向蛋白质的溶液中加入轻金属盐，使得蛋白质沉淀析出，这是由于加入盐降低了蛋白质得溶解度而析出，该过程可逆，加水蛋白质又会溶解。二者本质上是不同的。
生物化学实验
生物化学实验 一、糖的颜色反应及还原作用 实验一：糖的颜色反应 实验1.1 莫氏实验 一、目的 掌握莫氏（molisch）实验鉴定糖的原理和方法。 二、原理 糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与α-萘酚生成紫红色缩合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称“紫环反应”，其反应如下图： 利用这一性质可以鉴定糖。 三、实验器材 1、棉花或滤纸。 2、吸管1.0ml(*4)、2.0ml(*1)。 3、试管1.5*15cm(*4)。 四、实验试剂 1、莫氏试剂：称取α-萘酚5g，溶于95%乙醇并稀释至100ml。此试剂需新鲜配置，并贮于棕色试剂瓶中。 2、1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 3、1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml. 4、1%淀粉溶液：讲1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混合溶液合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅。最后以沸蒸馏水稀释至100ml。 五、操作 于4支试管中，分别加入1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少1，摇匀，讲试管2滴1ml水中）。然后各加莫氏试剂许纤维素（棉花或滤纸浸在倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5ml(切勿振摇！)硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。 六、注意事项 1、试管中加入各种糖后，应做好标记，浓硫酸加入的方式应保持一致。 2、莫氏反应非常灵敏，所用的试剂应洗净，不可再样品中混入纸屑等杂物。 3、当糖浓度过高时，由于浓硫酸对他的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈现紫色，需稀释后再做。 思考题： 1、解释α-苯酚反应的原理。 2、用莫氏试验鉴定糖时需注意哪些？ 试验1.2 塞氏试验
临床生化检验基础知识培训教材
临床生化检验基础知识培训 一、生化基础知识 二、生化仪器基础知识 三、部分生化项目的临床意义 本文档仅供生化应用工程师参考阅览，更多专业知识请查阅后附参考文献。 肖自强 2014-3-19
一、生化基础知识 1.1生化诊断试剂盒为由一定的化学品或者酶类组成的多成分混合试剂（Reagent），最终以水溶液的方式与待测物发生一系列化学或者生化反应，通过生成物或反应物中某物质的吸光度变化，测量待检测物中某种特定物质的含量。 1.2生化诊断试剂用于检测样本，包括：人体血清（主要）、血浆及尿液中的各种酶类和代谢产物，用于预测，诊断以及治疗监测，协助临床医生诊治疾病提供数据参考。 1.3按功能分为：肝功、血脂、肾功、心肌、代谢、免疫&风湿、离子&其他。 1.4试剂性能评价指标： 1 试剂外观 2批间差 3准确度 4精密度 5线性（灵敏度） 6抗干扰能力（特异性） 7稳定性 1.5试剂检测原理（朗伯比尔定律）：A=Kbc
式中，A 为吸光度;K 为吸收系数，是与入射辐射的波长及吸收物质的性质有关的常数;b为液层厚度，单位为cm;c 为吸收物质的浓度。当浓度的单位为mol/L 时，K 的单位为L/mol·cm，称为摩尔吸收系数，通常用ε表示。摩尔吸收系数ε表示物质对某一波长的辐射的吸收特性。ε愈大，表示物质对某波长辐射的吸收力愈强，因而分光光度法测定的灵敏度就愈高. 1.6理论值与实测值偏差的解释：实测值偏离了朗伯比尔定律。 偏离Lambert-Beer定律的因素： 1复合光对Beer 定律的偏离：吸收定律要求入射光为单色光，而分光光度计单色光的纯度主要决定于色散元件及光路设计，即使高精度的仪器，也得不到纯单色光，而是波长宽度的复合光，其结果导致偏离Lambert Beer 定律。 2杂散光的影响：杂散光(stray light) 是进入检测器待测波长以外的光。主要来源于仪器色散元件表面的散射、单色器内壁尘埃等。 3狭缝宽度的影响：单色器设有进、出口狭缝，狭缝愈窄，单色光愈纯，吸光度增加，但辐射能减小，对弱吸收带的测量有一定影响。定性分析时，为提高分辨能力常采用较小的狭缝，而定量分析时，在灵敏度允许的情况下，宜采用较大狭缝。当出、入射狭缝宽度相等时，狭缝宽度引起的误差最小。 4非吸收作用引起的误差： 1.散射效应：光吸收定律只适用于均匀的吸收体系，如待测溶液是混浊的，当 光通过时，将产生散射效应。其结果使光通过吸收物质的光程不固定，散射光的一部分和透射光一起进入检测器，导致偏离Beer 定律。因此，免疫比浊法常用多点校准来做标准曲线。 2. 荧光效应：分子吸收辐射能后产生的激发态分子以重新发射辐射的方式回 到基态而发射荧光。由于多数显色体系荧光效应很小，而且荧光发射是各向同性，只有一部分沿透射光方向进入检测器，使测量吸光度偏低。一般情况下，荧光效应对分光光度法产生的影响较小。目前，多数光度计设有两个样品室，对有荧光试样可置于离检测器较远的样品室，或在光路中插入适当的滤光片以消除荧光效应。 5测定过程中产生的误差：化学反应引起的误差，人为的误差等，在此不作详细解释。 1.7生化测定方法：临床化学自动分析仪所涉及的测定方法包括终点测定法、连续监测法、固定时间法等。 1.8.1生化分析基本术语概述： 1双波长：由主波长和副波长构成的两个波长，测定样品采用双波长可以消除对实验的影响。主波长是指测定某物质时，生成的产物颜色对光吸收的特有波长。副波长是指测定某物质时，为消除其他干扰物质在主波长造成测定干扰所设定的波长。 2反应杯空白：在特定波长下，光通过以蒸馏水或空气为反应体系所测得的吸光度值。 3试剂空白：在各特定波长下，光通过以蒸馏水或生理盐水为样品和相应测定项目
生物化学实验考题及答案[1]
生物化学实验考核试题库 要求：参加考核的每位学生须从1－6号题中随机抽1题，从7－12号题中随机抽1题，从13－37号题中随机抽1题，从38－46号题中随机抽1题，共计4道考核题进行考核，总分为60分。 一、理论考核题 1盐析和盐溶（3分）2电泳（3分）3层析（色谱）（3分）4酶的活力单位（3分）5比活力（3分）6分子筛效应（3分）7电泳的原理（4分） 8离子交换层析的原理（4分）9亲和层析的原理（4分） 10凝胶过滤层析的原理（4分） 11吸附层析的原理（4分） 12透析技术的基本原理及其应用（4分） 13聚丙烯酰胺凝胶电泳的主要优点及用途（6分） 14按层析过程的机理，层析法分哪四类？按操作形式不同又分哪三类？（7分） 15普通离心机的使用注意事项？（6分） 16可见分光光度计的使用注意事项？（6分） 17蛋白质含量测定的常用方法有那些？（6分） 18粗脂肪的提取和含量测定的基本原理（6分） 19索氏提取器是由哪几部分组成的？（6分） 20粗脂肪的提取和含量测定的简要操作步骤（6分） 21粗脂肪的提取实验中如何减少误差？（6分） 22凯氏定氮法测定总氮量的基本原理（6分） 23凯氏定氮实验中用到的主要器材有哪些？（6分） 24核酸的含量测定常用的方法有哪些？（6分） 25双倒数法测定米氏常数的基本原理（6分） 26双倒数法测定米氏常数的实验中，决定实验成败的因素有哪些？关键因素是什么？（7分） 27生物细胞的破碎的常用方法有哪些？（6分） 28酶的制备及提取过程中常注意哪些事项？（6分） 29蛋白质的分离常用的方法有哪些？（6分） 30甲醛滴定法测定氨基酸的基本原理（6分） 31为什么SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来测定未知蛋白质的相对分子质量？（6分）32连续聚丙烯酰胺凝胶电泳与不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么不同？（6分） 33聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点？（6分） 34琼脂糖凝胶电泳的优点？（6分） 35提取某种植物组织中的总DNA时，使用的细胞提取液中的主要试剂成分是什么？各有什么作用？（7分） 36如何证明提取到的某种核酸是DNA还是RNA？（6分） 37聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白时，使用的电泳缓冲液PH＝8.3，那么样品应点在哪端？为什么？（6分） 二、技能或实验操作考核题 38说明纸层析和离子交换层析分离氨基酸混合物的方法是根据氨基酸的什么性质? 列出纸层析和柱层析的一般操作步骤。（10分） 39凝胶电泳的一般操作步骤（11分） 40普通离心机的使用操作（示范）（10分）
生化检测基本常识
生化检测常识
目录 第一章生化检测基本常识 1.1标本的获得 (2) 第二章常规生化检测项目简介 2.1生化项目的临床意义 (2) 第三章生化仪参数测量原理 3.1自动生化仪的分类 (3) 3.2分立式生化仪结构 (5) 3.3生化检验的原理和方法 (6) 3.4生化分析仪测定方法的分类及应用度的计算 (9) 3.5.测定值计算方程 (10) 3.6 定标参数和浓度的计算 (17) 第四章几个重要概念 5．1试剂空白 (21) 5．2样本空白 (21) 5．3水空白 (21) 5．4样本 (21) 5．5质控物质 (21) 5．6底物控制 (21)
第一章生化检测基本常识 生化检测是医院检验科（或化验室）常用的检测手段，通常以人的血清为标本，通过测量血清中各生化成份的含量，为临床诊断提供依据。 1.1标本的获得 一般要求病人空腹时采静脉血（全血）。全血经过离心机离心，分层为血清和血细胞，正常情况下，上层颜色浅且透明（血清），下层颜色深且不透明（血细胞）。有的血清较为特殊，或分层不明显（融血），或血清不透明（脂血，呈牛奶状）。 第二章常规生化检测项目简介 2.1生化项目的临床意义 ◆丙氨酸氨基转移酶（ALT）：又称为谷丙转氨酶（GPT）是衡量肝功能的重要指标，许多低端医 疗机构在做体检时仅测此一项生化项目。正常人一般在40U/L以内。干粉试剂复溶后为单试剂，液体试剂一般为双试剂，应用动力学法可计算结果。 ◆蛋白：通常测白蛋白（ALB）和总蛋白（TP），终点法。一般用单试剂，有的TP试剂为双试剂， 可用两点终点法测。蛋白质是血清的主要成份，大部份由肝细胞合成。通过蛋白的测定可以协助某些疾病的诊断。 ◆血糖：血液中的葡萄糖简称血糖（GLU）。常用于糖尿病的诊断。正常人空腹血糖一般为3.9～ 6.1mmol/L。市场上单、双试剂的商品化试剂盒都有，可用终点法（单试剂）或两点终点法测量 （双试剂）。 ◆门冬氨酸氨基转移酶（AST）：又称为谷草转氨酶（GOT），主要用于心肌和肝胆疾病及骨骼肌病 的诊断。是肝功能测试的常用指标之一。正常人一般在40U/L以内。同ALT一样，无论单、双试剂，用动力学法可计算结果。 ◆碱性磷酸酶（ALP）：主要用于肝胆疾病及骨骼病的诊断。是肝功能测试的常用指标之一。正常 人一般在240U/L以内。用动力学法计算结果。 ◆γ-谷氨酰转移酶（GGT）：主要用于肝胆疾病诊断。是肝功能测试的常用指标之一。正常人一般 在50U/L以内。用动力学法计算结果。 ◆胆红素（BiL）：胆红素的测定，能准确反映黄疸的程度，判断黄疸的类型。一般测量总胆红素（TBil） 和直接胆红素（DBil）。 ◆甘油三酯（TG）：其含量测定是血脂分析的重要内容之一。 ◆总胆固醇（CHOL）：是游离胆固醇和胆固醇酯的总称，其测定对高脂蛋白血症和冠心病的诊断 及发病机理的研究有一定意义。 ◆高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）：主要在肝脏中合成，是血清中颗粒数最多的脂蛋白。其含量是 冠心病诊断的重要依据之一。 ◆肌酐（CREA）：是肌酸代谢的最终产物，由肾脏排出。是肾功能的重要指标之一。 ◆尿素（Urea）：是蛋白质分解代谢的终产物。血尿素测定是肾功能的最敏感指标。 ◆载脂蛋白A1(APOA1):是高密度脂蛋白的主要组成成分，临床上主要用于脑血管病风险度的估 计。 ◆载脂蛋白B(APOB):是低密度脂蛋白的主要组成成分，临床上主要用于冠心病的风险度的估计。 ◆肌酸激酶（CK）：肌酸激酶通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是 一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。可用于早期诊断急性心肌梗，常见肌病(如进行性肌营养不良发作期、病毒性心肌炎、多发性肌炎、挤压综合征等严重肌肉损伤)及脑血管疾病的诊断。
生化实验知识点汇总整理
百分吸光系数：指在一定波长下，吸光物质的溶液浓度为1g/100ml，光程为1cm 时的吸光度，单位是ml/(g·cm)。 标准曲线：指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性质的数值曲线。 层析：指利用各组分物理性质的不同，随流动相通过固定相时分离速度不同将多组分混合物进行分离及测定的方法。 层析法：混合物中各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开。分离开的色素形成不同的色带而易于区分，由此得名为色谱法（Chromatography），又称层析法。 重组子：两个突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位，即不能由重组分开的基本单位。重组子另一定义是指，含有重组DNA分子的转化细胞 电泳：带电粒子在直流电场中向着所带电性相反的电极移动的现象。 电渗：电动现象之一，指在电场作用下液体(通常是水)相对于和它接触的固定的固体相作相对运动的现象。 等电点：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。（pH大于等电点时蛋白质带正电，小于带负电） 分配系数(Kd)：物质在两种不相混的溶剂中平衡时的浓度比。反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能是衡量溶质分子被阻滞程度的一个特征性常数 分光光度法：根据物质对光的吸收特性和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法。是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。 分子筛：狭义上讲分子筛是结晶太的硅酸盐或硅铝酸盐，由硅氧四面体通过氧桥键相连而成，广义上讲，结构中有规整而均匀的孔道，孔径为分子大小的数量级，它只允许直径比孔径小的分子进入，因此能将混合物中的分子按大小加以筛分 GOD法测定血糖：葡萄糖氧化酶（GOD）利用空气和水催化葡萄糖分子中的醛基氧化，生成葡萄糖糖酸和过氧化氢；过氧化氢经过氧化物氧化酶（POD）氧化成水和氧；氧将4-氨基安替吡啉和酚氧化成红色的醌化合物，醌和葡萄糖成正比。将醌与标准液比色，算出血糖的含量。 感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。 聚丙烯酰胺凝胶浓度（T％）：每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr,a）和交联剂（Bis,b）总克数称为凝胶浓度，用T％表示 聚丙烯酰胺凝胶交联度（C％）：凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数称为交联度，用C％表示 竞争性抑制：抑制剂的结构域底物结构相似或部分相似，可与底物共同竞争与酶的活性中心结合而抑制酶的活性。这种抑制使得Km增大，而Vmax不变。碱裂解法：是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。 交联度：用C%表示，表示交联剂克数占凝胶总克数的百分数。交联度过高不仅凝胶变脆缺乏弹性且透明度降低交联度过低凝胶聚合不良呈糊状。 拷贝数：就是指某基因（可以是质粒）在某一生物的基因组中的个数.