分子标记种质资源鉴定和分子标记育种
Scientia A gr icultur a Sinica
分子标记种质资源鉴定和分子标记育种
贾继增
(中国农业科学院作物品种资源研究所,北京 100081)
提要 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记形式,近年来发展非常迅速。本文就以下6个方面讨论了分子标记的最新进展及存在
问题:(1)用于种质资源鉴定及植物育种的主要分子标记,如限制性片段长度多态性(R FL P)、随
机扩增多态性D NA(RA PD)、简单重复序列D NA(SSR)、扩增片段长度多态性(A FL P)以及染
色体原位杂交等;(2)分子标记遗传图谱;(3)分子标记在植物种质资源研究上的应用;(4)质量
性状基因的分子标记;(5)数量性状基因位点(Q T L)的分子标记;(6)分子标记育种目前存在问
题。
关键词 分子标记;植物遗传资源;育种
遗传标记(genetic markers)是基因型的特殊的易于识别的表现形式。理想的遗传标记主要应具备以下4条标准:(1)具有较强的多态性;(2)表现为共显性(codominance),因而能够鉴别出纯合基因型或杂合基因型;(3)对主要的农艺性状没有影响;(4)经济方便,容易观察记载。当前遗传标记主要有4种类型,即形态标记(m orpho logical marker s)、细胞标记(cytolo gical markers)、生化标记(biochemical mar kers)和分子标记(m olecular markers)。形态标记即植物的外部特征特性,如株高、穗长、粒色、千粒重等。此种形态标记简单直观,长期以来作物种质资源鉴定及育种材料的选择通常都是根据形态标记来进行的。但是形态标记数少、多态性差、易受环境条件影响。人为地通过诱变等方法培育形态标记材料不仅所需周期长,而且许多形态标记还对重要的农艺性状产生不利的影响。细胞标记主要是染色体核型(染色体数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(C带、N带、G带等),显然,这类标记的数目也很有限。生化标记主要包括同工酶和贮藏蛋白。生化标记具有经济方便的优点,但其标记数有限,不能满足种质资源鉴定和育种工作的需要。
近10年来,在人类基因组研究计划(Human Geno me Initiative,简称H GI)的推动下,分子标记的研究与应用得到了迅速的发展。与上述3种标记相比,分子标记具有以下优越性:(1)直接以DNA的形式表现,在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到,不受季节、环境限制,不存在表达与否的问题;(2)数量极多,遍及整个基因组;(3)多态性高,自然存在着许多等位变异,不需专门创造特殊的遗传材料;(4)表现为“中性”,即不影响目标性状的表达,与不良性状无必然的连锁;(5)有许多分子标记表现为共显性(codominance),能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型,提供完整的遗传信息。当前,分子标记已开始应用于作物遗传资源及育种研究,分别被称为分子种质资源鉴定(m olecular germplasm diag no stics)〔3〕和分子标记育种(molecular plant breeding〔4〕或mo lecular-assisted breeding)。
收稿日期 1995-06-06
2中 国 农 业 科 学29卷
1 用于作物种质资源鉴定及作物育种的分子标记
目前,用于作物种质资源鉴定及育种的分子标记主要有限制性片断长度多态性(restrictio n fragm ent length po lymo rphism,简称RFLP)、随机扩增多态性DNA(random amplified poly morphic DNA,简称RAPD)、扩增片断长度多态性(amplified fragm ent leng th polym orphism,简称A FLP)、微卫星DNA(microsatellite DNA)又称简单重复序列(sim ple sequence r epeat,简称SSR)以及原位杂交(in situ hy bridization)等。
1.1 RFLP
这是一项利用放射性同位素(通常用P32)或非放射性物质(如地高辛等)标记探针,与转移于支持膜上的总基因组DNA(经限制性内切酶消化)杂交,通过显示限制性酶切片段的大小,来检测不同遗传位点等位变异(多态性)的一种技术。用作RFLP的探针有cDNA探针(即互补DNA,用RN A作模板通过反转录合成的DN A)与基因组DNA(g DNA)探针两种。cDNA探针的保守性较强,许多禾本科植物(如小麦、水稻、玉米、甘蔗等)的cDNA探针都可以通用,因此这类探针是研究作物起源演化的较好探针。但是这类探针检测的多态性频率较低,在育种上应用可能会较少。gDN A探针是从植物总基因组DNA中克隆出来的,这类探针检测的多态性频率较高,但不同种属特异性较强。RFLP标记具有共显性的特点,它可以区别纯合基因型和杂合基因型,能够提供单个位点上的较完整的资料。RFLP的探针极多,目前各种主要作物上筛选的探针均有数千个,因而它检测的遗传位点也非常之多。RFLP标记主要应用于各种作物遗传连锁图的绘制和目标基因的标记,迄今为止,各种作物(如水稻、小麦、玉米、棉花、大豆、油菜等)的连锁图主要都是由RFLP标记来绘制,其中包括一些重要农艺性状基因。但是由于RFLP标记对DNA的需要量较大(5～10L g),需要的仪器设备较多,技术也较为复杂,因而目前尚难直接用于育种。为了解决这一问题,Talbert 等(1995)〔5〕提出将RFLP标记转化成共显性的PCR标记,以便在育种上加以利用。
1.2 RAPD
它是以基因组DNA为模板,以一个随机的寡核苷酸序列(通常为10个碱基对)作引物通过PCR扩增反应,产生不连续的DNA产物,用以检测DNA序列的多态性。该方法与经典的PCR反应的区别主要有3点:(1)引物,经典的PCR反应所用的是2个(一对)引物,长度通常为20bp(碱基对)左右,RAPD所用的引物为一个,长度仅10个bp。(2)反应条件,经典的PCR的复性温度较高,一般为60℃左右,而RAPD的复性温度仅为36℃。(3)扩增产物,经典PCR产物为特异扩增,而RAPD产物为随机扩增。该方法的优点主要是简单易行、需要的DNA量极少(15～25ng)、无放射性、实验设备简单、周期短,因此受到研究者的普遍欢迎。目前该方法已广泛用于种质资源鉴定与分类、目标性状基因的标记等研究上,也有人利用RAPD标记来绘制遗传连锁图。该方法的缺点主要有两点:(1)多数位点的标记带表现为显性的特点,因此不能提供完整的遗传信息。(2)更主要的是该方法在一些作物上扩增产物的稳定性差。解决这一问题的办法之一是通过控制模板DNA和M g++浓度及严格保证反应条件来解决;二是将RAPD作为初步筛选鉴定的一种方法,一旦发现所需要的DNA扩增产物之后,再用等位特异性PCR(AS-PCR)〔6〕或特殊序列扩增(SCAR)〔7〕的方法,将RAPD转变成经典的PCR的方法。
1.3 SSR
在人类及动植物的基因组中,均存在着许多由1～4个碱基对组成的简单重复序列,如(GA)n,(AC)n,(GAA)n(其中n 为重复次数)等。在植物中,Akkaya 等(1992)和M org ante 等(1993)〔8〕
发现AT 重复较AC 重复更为普遍。在人类基因组中,这些重复序列分布遍及所有的染色体及染色体的各个区段,在植物上也很可能如此。目前SSR 标记已被广泛用于资源鉴定、连锁图绘制及目标性状基因的标记等研究上。与RFLP 标记相比,SSR 检测的多态性频率要高很多,如Greg an(1994)〔9〕在96份大豆资源中,发现了多达29个SSR 的等位变异,而通常利用RFLP 技术,仅能发现2～3个等位变异。SSR 除用作探针外,还可通过PCR 扩增植物基因组中所含的重复序列区域,因此它具有PCR 方法的优点。但是要克隆足够数量的SSR,并对其进行测序和设计引物,没有足够的投资、人力和时间,是不可能实现的。
1.4 AFLP
这是一种利用PCR 技术检测DNA 多态性的方法,是由Zabean 〔10〕等人发明的一项技
术。其基本原理是选择性扩增基因组DNA 的酶切片段。由于不同材料的DN A 的酶切片段存在差异,因而便产生了扩增产物的多态性。由此可见,AFLP 实际是RFLP 与PCR 相结合的一种产物。AFLP 标记的多态性强,利用放射性标记在变性的聚丙烯酰胺凝胶上可检测到100～150个扩增产物,因而非常适合绘制品种的指纹图谱及进行分类研究。该项技术的另一个特点是稳定性、重复性强。Zabean(1994)等人已进行了一百万个反应,足以证明了这一点。该项技术的缺点是需要用同位素检测,同时成本也较高。另外,该项技术已申请专利。目前人们可以自由地利用该项技术用于非赢利性的科学研究,但如果用于育种,可能就要购买专利了。
1.5 染色体原位杂交
这是一项利用标记的DNA 探针与染色体上的DNA 杂交,在染色体上直接进行检测的分子标记技术。该项技术在研究内容、研究方法上将传统的细胞遗传学与现代分子遗传学结合起来,形成了一门新的交叉学科分子细胞遗传学(mo lecular cy togenetics)。原位杂交的最大优点是准确、直观。目前该技术主要用于检测外源染色体,研究物种的起源、演化,构建染色体的物理图谱等。由于研究的目的不同,使用的探针也不相同。基因组总DNA 和基因组特异重复序列主要用来鉴定外源染色体和研究起源演化;低拷贝和单拷贝探针主要用来构建染色体物理图谱。由于标记技术的改进(如采用荧光标记、直接标记、原位PCR 等)及标记探针的增加,这项技术已引起越来越多研究者的兴趣,并取得了许多很好的、新的研究结果。
除了上述5种主要的分子标记外,还有小卫星DNA (minisatellite DNA)、简单重复序列间扩增(ISSR)等。现代分子标记技术发展非常迅速,随时都会有新的标记技术被发明、被利用。我们应密切注视这方面的发展动向,特别是人类基因组研究的动向。因为植物研究上所用的分子标记几乎都是从人类研究上移植过来的,谁移植成功得早,谁就可能在植物研究上领先。2 分子标记遗传图谱
遗传图谱既是遗传研究的重要内容,又是作物资源、育种及分子克隆等许多应用研究的理论依据和基础。数十年来,许多遗传学家利用形态标记、生化标记和传统的细胞遗传学方3
4期贾继增:分子标记种质资源鉴定和分子标记育种
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法,为构建各种主要作物的遗传图谱进行了大量工作,并取得了一定的进展。但是由于形态标记和生化标记数目少,特殊遗传材料培育困难及细胞学工作量大,因而除极少数作物(如玉米)外,在分子标记出现之前,大多数作物还没有一个较为完整的遗传连锁图,极大地限制了遗传学理论研究与应用研究的进展。
进入80年代以来,分子标记的迅速发展大大促进了遗传连锁图的构建。目前各主要作物RFLP遗传连锁图构建已基本完成。水稻的连锁图上标记最多,饱和度最高。在日本水稻基因组研究项目(RGP)绘制的12条水稻染色体图谱上,仅cDNA标记的位点就多达1100多个(Sasaki等,1995)〔11〕,平均每条染色体上有近100个,即不到2cM就有一个标记。由于还有不少基因组DNA(gDNA)标记也已绘制在该图谱上,因此该图谱的标记数目已远超过1100个。小麦的RFLP连锁图目前主要有两套:一套为英国剑桥实验室所绘制,到1992年底,该图谱上的标记数有520余个,平均每条染色体上为25个。另一套为美国康耐尔大学与法国等合作绘制,其标记数多达850个(Nelso n,1995)〔12〕,已较为“饱和”。玉米连锁图绘制进展也很快,如在美国密苏里大学绘制的玉米连锁图谱上,其标记数已大于600个,平均每条染色体上有60余个。目前,就连许多小作物如谷子、高粱、甘薯等的连锁图也都已完成或即将完成。在连锁图的绘制上,目前的主要工作有两项:一是填补连锁图上较大的间隙,使其更加“饱和”。二是用更易为育种家们接受的经济、实用的分子标记(如SSR,RA PD等)来构建新的连锁图,或者利用STS(sequence tag ed site)-PCR的方法,将RFLP连锁图中的RFLP标记转换成PCR标记。
遗传图谱的绘制使作物遗传研究取得了重大进展,并对未来的分子标记育种将产生巨大的推动作用。
小麦的RFLP连锁图揭示了在小麦的进化过程中,有多条染色体发生过易位,如染色体7B短臂上的一个片段和5A长臂上的一个片段易位到了染色体4A上;4A长臂的片段易位到了染色体5A上;而染色体5A长臂末端的一个片段则易位到7B的短臂上(Liu等, 1992)〔13〕;染色体6B短臂的末端易位到染色体2B短臂的末端(贾继增,1994)〔2〕。研究证明,上述易位发生在早期的四倍体小麦中,并且在之后形成的六倍体小麦中这种易位的情况依旧保留着。在黑麦中,染色体的重排就更复杂了。Devos(1992)〔14〕等人在黑麦的RFLP连锁图上发现,除1R染色体未发生易位外,其余6条染色体均发生了易位,并且易位还相当复杂。有趣的是,我们在进行小麦-多枝赖草(Ley mus m ulticalis)的部分同源关系鉴定时,在所鉴定的附加系中,多枝赖草的染色体也只有第一部分同源群未发生易位〔15〕。小麦、黑麦、多枝赖草的RFLP标记证明在小麦族的进化过程中,似乎第一部分同源群更稳定些。
RFLP连锁图揭示的另一个重大的遗传现象是禾本科植物基因组的保守性。以前,人们通过小麦非整倍体等研究已经发现,小麦的A、B、D三个基因组的功能有相同之处,可以互相补偿。现代的RFLP连锁图则进一步证明,这三个基因组之间不仅基因数目、而且基因在染色体上的排列位置也都非常一致。之后,这一发现扩大到包括小麦、大麦、黑麦在内的整个小麦族。近年来,小麦、水稻、玉米等禾本科作物的比较遗传作图(com parative g enetic mapping)的研究取得了较大的进展。现已证明,整个禾本科作物均存在着相当强的遗传保守性,并且已发现了不同作物染色体间的部分同源关系。如小麦的1、2、3、4、5、6、7七个染色体部分同源群分别与水稻的第5、第4和第7、第10、第3、第9、第2以及第6和第8具部分同源关系〔16〕;玉米的第2条染色体与水稻的第4条染色体具部分同源关系〔17〕。目前的基因
组研究揭示,禾本科许多作物之间的差异不是由于功能基因的差别引起的,而是由于大量的重复序列的差异引起的。不同作物间部分同源关系的研究不仅在起源演化研究上具有重要意义,而且在分子标记育种及基因克隆等方面也有重要的作用。如果几种作物具有部分同源关系,那么这几种作物的遗传信息(含连锁图)及探针就可以共享。在进行基因克隆时,就可以挑选基因组较小的作物(如水稻)来进行,而在进行染色体物理图谱绘制时,则可挑选基因组较大的作物(如小麦)来进行。最近,美、英等国正在发起一个国际禾本科植物基因组研究计划(IGGI)〔18〕,旨在对禾本科植物基因组的关系进行更探入的研究,预计在该领域近年内将会有较大的进展。
此外,近年来利用分子标记在进行染色体物理图谱的绘制、物理图谱与遗传图谱的比较(Gill,1994;Gustafson,1992)〔19〕、染色体不同部位的遗传重组值的差异(Devos,1992)〔14〕等研究方面,也均取得了较大的进展。
3 分子标记在作物种质资源研究上的应用
分子标记在与育种有关的种质资源研究中主要有以下4方面的用途:(1)绘制品种(品系)的指纹图谱(fingerpr inting );(2)种质资源的遗传多样性及分类研究;(3)种质资源的创新与鉴定;(4)绘制目标性状基因连锁图。此处主要举例说明三个方面的用途,第四方面的应用将在后面着重叙述。
3.1 绘制品种、品系的指纹图谱
指纹图谱是鉴别品种、品系(含杂交亲本、自交系)的有力工具。它具有迅速(数小时至数天)、准确等优点。在目前市场经济迅速发展的形势下,指纹图谱技术在监测良种质量(真伪、纯度),防止伪劣种子流入市场,保护我国名、优、特种质及育成品种的知识产权和育种家们的权益等方面,均具有重要的意义。
指纹图谱技术主要应满足两方面的要求:一是分辨率高,多态性强;二是重复性要强,即稳定可靠。作物品种指纹图谱目前主要有两种类型:一类是蛋白质电泳指纹图谱,其中包括同工酶和贮藏蛋白(如谷蛋白、醇溶蛋白)。这类指纹图谱在90年代以前研究较多,目前仍不失其利用价值。另一类为DNA 指纹图谱,该项技术主要是90年代之后发展起来的。当前用来作DNA 指纹图谱的标记主要有RFLP 、小卫星DNA 、微卫星DNA 、AFLP 及RAPD 、REPAIR 等。Liu(1992)〔20〕在小麦基因文库中筛选到了一个4.1Kb 的DNA 克隆pTag 546。用该克隆作探针能够检测小麦10条染色体上12个位点的等位变异,区分出全部参试的56个普通小麦品种,可见pTag 546是绘制小麦指纹图谱的非常有用的探针。Weising (1992)发现微卫星DNA(GATA )4是一个多态性高、稳定性好的探针。用该探针可以检测出15个栽培番茄品种的差异。M ilgr oom (1993)的研究发现,(GA TA )4在油菜上也表现出非常高的多态性,它不仅能够检测出油菜品种间的差异,而且可以检测出同一品种内不同单株间的细微差异。Zhu(1995)〔21〕发明了一种新的绘制DNA 指纹图谱的方法,称为随机末端引物重复序列间扩增(random end primer amplification of interspersed repeats,简称REPAIR)。用该方法仅需2～3个引物就可以鉴别出50个水稻品种中的大多数,并能识别其中三个人为设置
的重复。在品种鉴定中,杂交种子的鉴定更具有重要的经济价值。M arshall(1994)〔22〕等利用RAPD 技术来检测油菜杂交种的纯度取得了成功,他们用该方法对两个油菜自交不亲和(self -incom patibility )雄性不育基因S 1和S 3的作用效果进行了检测,结果发现这两个基因54期贾继增:分子标记种质资源鉴定和分子标记育种
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在控制自花授粉的作用上差异明显。S1无论在温室或田间条件下均表现稳定,但S3在大田的表现远不如温室,其杂交种的比例仅为18.1%～43.9%。
3.2 种质资源遗传多样性研究
分子标记是检测种质资源遗传多样性(g enetic div er sity)的有效工具,目前主要用于以下4方面的研究:(1)研究种质资源考察时取样量的大小、取样点的选择;(2)保护种质资源遗传完整性的最小繁种群体和最小保种量的确定;(3)核心种质(core collection)筛选;(4)种质资源(含亲本材料)的分类。目前有关此类研究已有不少报道,并在某些方面取得了新的进展。例如,玉米传统的鉴定自交系的方法是靠配制大量的杂交组合,根据杂种F1的表现来评价自交系和确定杂交组合。以前人们也曾试图利用同工酶标记来预测杂种产量,但结果都不理想,其主要原因可能是因为同工酶的位点有限,而且其中有些位点还与产量性状无关或关系不大。Sm ith(1989)为了探讨不同位点等位变异与杂交种产量的关系,他们用37个优良自交系配制310个杂交组合,并用230个RFLP探针来对这些玉米自交系等位变异进行检测,结果发现杂交种杂合位点的数目(即自交系等位变异数目)与产量的决定系数(r2)竟高达0.87,说明根据亲本自交系的等位变异来预测杂交种的产量是非常有效的。
分子标记技术不仅能够检测物种内的遗传多样性,而且可以对物种间的遗传多样性进行比较。例如,用近年来发展起来的RFLP、RAPD、AFLP、SSR等分子标记技术对小麦、水稻、玉米、大豆等作物进行研究的结果,均发现普通小麦品种间的多态性(即等位变异)比其它作物要小得多,说明普通小麦的遗传基础更为狭窄,这可能也是杂交小麦比其它作物更难取得突破的一个原因。
3.3 种质资源的创新与鉴定
许多研究都证明,现代栽培作物的遗传基础狭窄是作物改良的一个主要障碍。通过远缘杂交导入外源遗传物质,是扩大遗传变异的一条重要途径。但是在这个过程中有两个问题需要解决:第一,在外源染色体上,既有对作物改良有利的基因,也存在着大量的对作物改良不利的基因,这就需要一种准确有效的识别方法对其进行鉴定。RFLP、PCR、原位杂交、RAPD 等技术,均可能有效地解决这一问题,特别是把原位杂交技术与RFLP等项技术结合起来效果更好。第二,栽培作物都是经过千百万年的漫长岁月进化而来的,外源染色体导入栽培作物后,存在着一个遗传平衡问题。近年来绘制的小麦族RFLP连锁图揭示,尽管小麦族的不同属间(如小麦、大麦、黑麦等)的染色体都存在着部分同源关系,但是各染色体组中,染色体的重组情况是不完全相同的。小麦-黑麦1B/1R代换(易位)系之所以能在全世界小麦育种上广泛地利用,其主要原因应归功于黑麦染色体1R上所携带的抗病基因。但今天我们回过头来看,这可能还应该归功于被代换的小麦染色体1B与黑麦染色体1R的高度部分同源,因而在其代换(易位)系中,达到了遗传平衡。小麦-黑麦1B/1R的成功利用,极大地鼓舞了利用远缘杂交进行外源基因转移的工作。迄今为止,全世界共育成小麦的异源附加、代换、易位系400个左右,然而绝大多数未能有效地得到利用,除了别的原因之外,遗传不平衡可能也是主要原因之一。因此利用分子标记进行检测,选育出具有外源目标性状基因、尽可能不带或少带不利基因、且遗传达到平衡的新种质,对现代作物改良将是十分重要的。
4 质量性状基因的分子标记在育种上的应用
许多重要的农艺性状都表现为质量性状遗传的特点,如抗病性、抗虫性、育性、某些抗逆
性(抗盐、抗旱)和部分株高的特性等。质量性状一般有显隐性,因而在分离世代无法通过表型来识别目的基因位点是纯合还是杂合。在几对基因作用相同时(如某些抗病基因对病菌的不同生理小种反应相同),无法识别哪些基因在起作用。此外,质量性状虽然受少数主基因控制,但其中的许多性状仍受遗传背景、微效基因及环境因素的影响,表现出某些数量性状的特点。此外,某些病害的发病条件很难创造;某些病虫害为检疫对象,不允许引进;多种病害在接种时有可能产生拮抗作用等,所有这些都给依靠表型选择造成了困难。
利用与目标质量性状基因紧密连锁的分子标记,是进行质量性状选择的有效途径。标记
目标性状基因的方法目前主要有两个:一是利用M ichelmor e 等(1991)〔23〕提出的分离群体
分组分析法(bulked segr eg ant analysis ,简称BSA )。该方法是将F 2分离群体中研究的目标性状根据其表型(如抗病、感病)分成两组,将两组单株的DNA 混合提取,并用作模板进行RAPD 分析。如果某一引物扩增的两个群体的DNA 表现出多态性,则表明该引物的扩增产物与目标性状基因连锁(其连锁距离在15cM 以内),然后再用筛选出的有连锁关系的几个引物对分离群体的单株DNA 进行扩增,找出其中连锁关系更密切的分子标记。由于RAPD 标记稳定性较差,因此一般在发现连锁紧密的RAPD 标记带后,都要将该标记带克隆、测序,并设计出一对新的引物(20bp 左右),用这样的引物进行PCR 特异扩增,结果更可靠。由于该方法简便易行,因而得到广泛应用。二是根据已有的连锁图进行标记。一旦发现目标基因被定位在某一染色体上,就可选择分散在染色体上不同位点的标记,逐渐逼近,这样很快便可找到该基因的分子标记。近年来,各主要农作物上均有许多重要的质量性状基因被标记。如水稻上的抗稻瘟病基因、光敏不育基因、矮秆基因等(朱立煌等,1994),小麦上的抗白
粉病基因(贾继增,1993)〔1〕、抗叶锈基因(Schachermay r,1995)〔24〕、春化反应基因(N elson
等,1995)〔12〕及耐盐基因(Deal,1995)等〔25〕。
分子标记目前已开始用于育种,其优越性开始在实践中表现。例如,Deal 等(1995)〔25〕发
现普通小麦的抗盐基因位于染色体4D 长臂上,利用该抗盐基因的分子标记,他们将其转移到硬粒小麦的4B 上,大大地提高了硬粒小麦的抗盐性。孢囊线虫是甜菜的一种重要病害,Hallden(1995)〔26〕
找到了与抗病基因紧密连锁的PCR 标记,并设计了自动化操作设备,每天可对4800个样品进行分析,大大提高了育种效率。通过回交培育近等基因系是作物遗传育种上常用的一种方法。传统的方法培育一个近等基因系一般需要6～8代回交,Rom ero -
Sev erson 等(1995)〔27〕利用分子标记的方法,将一个玉米抗虫基因Cr y 1A(b)通过回交转移
到一个栽培品种中,他们用19个DNA 标记对回交一代的78株进行了检测,结果发现有2
株上的16个标记都与回交亲本相同,且带有目标抗病基因。T anksley 等(1989)〔28〕通过计算
机模拟计算,在番茄上利用分子标记进行回交选择,仅需30株单株进行3代回交,便可选到回交亲本类型的材料,而常规方法则需要数百株单株,回交6～8代。5 数量性状基因位点(QTL )的分子标记及其在育种上的应用
大多数重要的农艺性状均表现为数量性状的遗传特点,如产量性状、成熟期、品质、抗旱性等。数量性状易受外界环境条件影响,因此选择效果不好。传统育种方法周期长,主要就是由数量性状造成的。以前,由于缺乏足够的遗传标记,影响了数量性状研究的进展,以致长期以来有关数量性状基因的数目、基因位点、作用效果都不清楚,更无从谈起指导育种实践。近年来,由于分子标记技术的发展,人们已可能将复杂的数量性状进行分解,像研究质74期贾继增:分子标记种质资源鉴定和分子标记育种
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量性状基因一样对控制数量性状的多个基因分别进行研究。数量性状基因位点作图的方法最近几年发展很快。常用的主要有区间作图法(Lander和Botsein,1989)〔29〕、多元回归法(Cow en,1992;Bridgesm,1993)〔30〕、精确作图法(Zeng,1993、1994)〔31,32〕、标记回归法(Kearsey,1994)〔33〕以及我国学者提出的用已知完整连锁图作图法(Wu,1994)〔34〕。利用这些作图方法,一些数量性状基因已被绘制在连锁图上,并找到了与其紧密连锁的分子标记,有些已开始用于育种实践。如Xu(1995)〔35〕利用RFLP标记,发现了一个优良的高粱抗旱品种的抗旱性是由3对主基因控制的,并将这3对基因定位在染色体上,找到了与其连锁的分子标记。Autrique等(1995)〔36〕研究发现了一个与小麦产量有关的基因,与位于染色体2D上的光周期反应基因密切连锁。有关玉米产量性状的QTL研究较多,结果发现其产量性状的QT L位点分布在多条染色体上,但各位点的作用大小不同。如Veldboom(1994)〔37〕的研究指出,位于染色体6L上的一个位点npi286与产量性状的关系最为密切,约占产量总变异的35%。特别令人鼓舞的是,Stuber(1995)〔38〕等人已利用分子标记将玉米高产基因从自交系TX303转移到B73中,从Oh43转移到Mo17中,育成了新自交系“增强”B73和“增强”M o17,用这两个“增强”自交系配制的杂交种在1993、1994两年的实验中,较对照增产15% (约合1500kg/hm2),证明通过标记技术可以对像产量这样复杂的遗传基因进行操作。Edw ards和Page(1994)〔39〕使用计算机模拟来评价遗传标记对数量性状进行选择的效果。研究结果指出:(1)利用遗传标记在早代(第三代之前)进行选择效果较好。(2)标记与QT L的遗传距离是影响选择效应的主要因素,当遗传标记与QT L位点连锁不紧密时(重组值为20%),使用位于QTL两侧的两个遗传标记较使用一个遗传标记的遗传进度要大38%;当遗传标记与QT L位点紧密连锁时,利用两个标记仅比一个标记大11%。(3)当目标性状由少数几个基因控制时,利用标记选择,对发掘其遗传潜力非常有效。然而当目标性状由多个基因控制时,由于需要选择世代较多,因而使标记与QT L位点的重组更加复杂。
6 分子标记育种目前存在的问题及建议
6.1 分子标记育种需要以下3方面技术的支撑
(1)用多态性高的分子标记绘制的遗传图谱,其中标记间的遗传距离不应大于20cM。
(2)与目标农艺性状基因紧密连锁的经济有效的分子标记。
(3)高效的自动化技术。
6.2 尚待解决的问题
(1)目前各主要农作物的遗传图谱已经绘制,图中标记的“饱和”程度也已经或基本满足育种工作者的需要。但目前的连锁图都是以RFLP标记绘制的,在育种上不易利用,因此应设法将图中的RFLP标记转化成PCR标记(如RAPD、SSR、STS等)。
(2)已发现了不少与育种目标性状紧密连锁的分子标记,其中一部分为RFLP标记。需要将此类标记转变为PCR标记。另外,在某些作物(如小麦)中,标记的多态性频率仍然较低。因此应该研究提高标记的多态性、稳定性,降低标记成本,并随时注意发现新的标记。
(3)在遗传标记自动化方面也取得了较大的进展。如一些实验室已在DN A提取、定量、PCR扩增反应操作及数据的分析处理等方面实现了自动化或半自动化,但多数仪器设备价格昂贵,有些还需不断改进。
最后需要强调指出的是,以前的许多研究都是将目标基因的标记与育种分开进行的。今
后应使两者结合起来,同时进行。并要特别注意利用分子标记向栽培作物中引入新的等位变
异,以丰富作物的遗传基础(Tanksley ,1995)〔40〕。
6.3 对开展分子标记育种的建议
分子标记育种是一项非常有希望的育种新技术,对我国农作物产量的提高将产生巨大的推动作用,当前我们在开展此项研究工作时建议注意以下两点:
(1)分子标记技术与常规育种经验相结合。分子标记育种技术目前尚不成熟和完善,因此还不能作为一种育种方法单独应用。我国传统育种经验丰富,因此,应注意将分子标记这一先进技术与育种家的丰富经验相结合,尽快使其在我国产生效益。
(2)国外一些发达国家从事此项研究起步较早,又有雄厚的经济基础,在此研究领域已取得了许多研究成果。我国在这方面研究起步较晚,财力有限,因此要充分利用国外已有的研究成果(如连锁图、探针等),在国外研究的基础上,根据我国的实际情况,把研究重点放在对我国主要粮食产量影响较大、而又可能通过分子标记方法解决的一些问题上。
参 考 文 献
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40 Tanks ley S D.Ab stract of Plant GenomeⅢ.San Diego.U SA.1995:14
Molecular Germplasm Diagnostics and Molecular
Marker-assisted Breedin g
Jia Jizeng
(I ns titute of Cr op Ger mp lasm Resources,CA A S,Beij ing 100081)
Abstract M any of the problems asso ciated with plant germplasm diag nostics and breeding pr ogram s based o n the phenotypic estimatio n of ag ronomic traits,such as major enviro mental effects on quantitative inheritance can be elim inated by using of DNA markers.T he progr ess and problem s w ere discussed in the follow ing six aspects:(1)DNA marker system s used in plant breeding and plant germplasm.(2)Genetic m aps co nstr ucted by molecular m ar kers.(3)Application of molecular markers to plant germ plasm diagnostics.(4)Application o f molecular markers to tag the qualitative trait genes.(5)Application o f molecular markers to tag the quantitative trait g enes.(6) Present problems and per spectiv es of m olecular marker-assisted br eeding.
Key words M olecular m arkers;Plant germplasm resour ces;Plant breeding
分子标记辅助选择育种
分子标记辅助选择育种 传统的育种主要依赖于植株的表现型选择 (Phenotypieal selection)。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。 育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选
择(molecular marker-as—sisted selection，MAS)育种更受到人们的重视。 第一节分子标记的类型和作用原理 一、分子标记的类型和特点 按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。PCR是Mullis等(1985)首创的在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促反应，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性(annealling)、延伸(exten—sion)三步(图17—1)。变性指的是通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程；复性(又称退火)是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互补的模板在局部形成杂交链；延伸是指在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始点的5'-3'的DNA链延伸。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经25～30个循环后，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2×106-7拷贝。按照PCR所需引
分子标记辅助育种技术
分子标记辅助育种技术 第一节 分子标记的类型和作用原理 遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。 在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。 在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。 在遗传学研究中，遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。 在作物育种中，通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。 在现代分子育种研究中，遗传标记主要用来进行基因定位和辅助选择。 1、形态标记 形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状。如、株高、穗型、粒色等的相对差异。 形态标记数量少，可鉴别标记基因有限，难以建立饱和的遗传图谱。 有些形态标记受环境的影响，使之在育种的应用中受到限制。 2、细胞学标记 细胞学标记是指能够明确显示遗传多态性的细胞学特征。如染色体的结构特征和数量特征。 核型：染色体的长度、着丝粒位置、随体有无。 可以反映染色体的缺失、重复、倒位、易位。 染色体结构特征 带型：染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄 和位置顺序,可以反映染色体上常染色质和异染 色质的分布差异。 染色体数量特征—是指细胞中染色体数目的多少。染色体数量上的
遗传多态性包括整倍体和非整倍体变异。 细胞学标记 优点：克服了形态标记易受环境影响的缺点。 缺点： （1）培养这种标记材料需花费大量的人力物力； （2）有些物种对对染色体结构和数目变异的耐受性差，难以获得相应的标记材料； （3）这种标记常常伴有对生物有害的表型效应； （4）观察鉴定比较困难。 3、蛋白质标记 用作遗传标记的蛋白质分为酶蛋白质和非酶蛋白质两种。 非酶蛋白质：用种子储藏蛋白质经一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据显示的蛋白质谱带或点，确定其分子结构和组成的差异。 酶蛋白质：利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色检测，根据电泳谱带的不同来显示酶蛋白在遗传上的多态性。 蛋白质标记的不足之处： （1）每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术； （2）某些酶的活性具有发育和组织特异性； （3）标记的数量有限。 4 、 DNA标记 DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映。 DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸系列的任何差异，包括单个核苷酸的变异。 二、分子标记的类型及作用原理
分子标记的发展及分子标记辅助育种
分子标记的发展及分子标记辅助育种 分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。 分子标记辅助育种示意图 DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的类型 分子标记按技术特性可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指
纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。 分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。 各种分子标记的原理和优缺点 第一代分子标记：RFLP RFLP在20世纪70年代已被发现，是发现最早的一种分子标记。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。 RFLP标记的原理：植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶(restriction enzymes，简称RE)酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个DNA／RE组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一DNA 所特有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素(如P32)或非放射性物质(如生物素、地高辛等)标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交(即Southern杂交)，若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况。对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异，就不需Southern杂交。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(Random Genome克隆，简称RG克隆)和PCR克隆。 优点: RFLP标记具有共显性的特点。共显性(co-dominant)标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。
分子标记在番茄抗性育种研究进展
分子标记在番茄抗性育种中研究进展 摘要：本文综述了近年来RFLP RAPD SSA AFLP CAPS和SNP分子标记技术在番茄抗性育种上的应用，分析了目前的研究进展，对今后研究的重点进行了讨论。 关键词：分子标记；番茄；抗性；进展。 Molecular marker in tomato resistance breeding research progress in Abstract: This paper reviewed recent RFLP RAPD SSA AFLP CAPS and SNP in the application of tomato resistance breeding, analysis of the current research progress, the focus of the future research are discussed. Key words: Molecular markers; tomato; resistance; progress. 番茄既是蔬菜也是水果, 其中含有丰富的维生素C对心血管有良好的保护作用；番茄红素具有良好的抗氧化作用,能清除体内废物,增加免疫力。它也是营养师大力提倡的减肥食品。它早已成为人们日常生活中的不可缺少的食物。 随着遗传学的发展,遗传标记的种类和数量也在不断增加。形态标记、细胞学标记、生化标记都是以基因表达的结果(表现型)为基础,是对基因的间接反映;而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。与表型标记相比,DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限制;数量丰富;遗传稳定;对生物体的影响表现“中性”以及操作简便等特点。分子标记的所有这些特性,奠定了它具有广泛应用性的基础。本文在介绍一些常用的DNA分子标记技术基础上,综述分子标记应用于番茄遗传育种研究的新进展,并就我国今后番茄分子育种主要研究方向进行讨论。 分子标记的介绍 分子标记的概念:广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 在番茄遗传育种研究工作中使用的DNA分子标记主要涉及基于Southern杂交的限制性片段长度多态性标记( RFLP)、基于PCR技术的DNA扩增方法的随机扩增多态性DNA标记( RAPD),简单重复序列标记(SSR)、以及基于PCR与酶切相结合的扩增片段长度多态性标记(AFLP)、切割扩增的多态性序列标记(CAPS)和单核苷酸多态性(SNP) 等。 2.分子标记基本原理 RFLP(限制性片段长度多态性, restriction fragment length polymorphism,简称RFLP)基本原理是:植物基因组DNA经限制性内切酶酶切后,通过电泳将大小不同的酶切片段按照各自的长度分离,通过Southern吸印与标记的探针杂交,放射自显影检测酶切片段的多态性,此方法稳定可靠。 RAPD(随机扩增的DNA多态性，random amplified polymorphic DNA,简称RAPD)是以基因组总DNA为模板,利用随机引物对模板进行PCR扩增得到多态性DNA片段,然后通过电泳检测片段的多态性,以此来诊断生物体内在基因排布与外在性状表现规律的技术。它基于PCR,无需预先知道DNA序列信息。 简单重复序列(simple sequence repeats,简称SSR)又叫微卫DNA( microsatellite DNA)。所谓微卫星是由2~ 6bp的重复单位串联而成,一个微卫星长度一般小于100bp,不同品种或个体核心序列的重复次数不同,但重复序列两端序列多是保守的单拷贝序列,通过PCR扩增其间的核心微卫星DNA序列,利用电泳分析不同基因型个体在每个SSR位点上的多态性。 AFLP (扩增片段长度多态性，amplified fragments length polymorphism,简称AFLP)原理是把限制性酶切片段通过PCR反应进行扩增,再把扩增好的酶切片段通过聚丙烯酰胺凝胶等高分辨率的分析胶电泳,最后检出片段的多态性。
第十七章 分子标记辅助选择育种
目录 第一节分子标记的类型和作用原理 第二节重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术 第三节作物分子标记辅助育种 第一节 分子标记的类型和作用原理 遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。 在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。 在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。 在遗传学研究中，遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。 在作物育种中，通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。 在现代分子育种研究中，遗传标记主要用来进行基因定位和辅助选择。 1、形态标记 形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状。如、株高、穗型、粒色等的相对差异。 形态标记数量少，可鉴别标记基因有限，难以建立饱和的遗传图谱。 有些形态标记受环境的影响，使之在育种的应用中受到限制。 2、细胞学标记 细胞学标记是指能够明确显示遗传多态性的细胞学特征。如染色体的结构特征和数量特征。 核型：染色体的长度、着丝粒位置、随体有无。 可以反映染色体的缺失、重复、倒位、易位。 染色体结构特征 带型：染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄
和位置顺序,可以反映染色体上常染色质和异染 色质的分布差异。 染色体数量特征—是指细胞中染色体数目的多少。染色体数量上的 遗传多态性包括整倍体和非整倍体变异。 细胞学标记 优点：克服了形态标记易受环境影响的缺点。 缺点： （1）培养这种标记材料需花费大量的人力物力； （2）有些物种对对染色体结构和数目变异的耐受性差，难以获得相应的标记材料； （3）这种标记常常伴有对生物有害的表型效应； （4）观察鉴定比较困难。 3、蛋白质标记 用作遗传标记的蛋白质分为酶蛋白质和非酶蛋白质两种。 非酶蛋白质：用种子储藏蛋白质经一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据显示的蛋白质谱带或点，确定其分子结构和组成的差异。 酶蛋白质：利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色检测，根据电泳谱带的不同来显示酶蛋白在遗传上的多态性。 蛋白质标记的不足之处： （1）每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术； （2）某些酶的活性具有发育和组织特异性； （3）标记的数量有限。 4 、 DNA标记
分子标记种质资源鉴定和分子标记育种
Scientia A gr icultur a Sinica 分子标记种质资源鉴定和分子标记育种 贾继增 (中国农业科学院作物品种资源研究所,北京 100081) 提要 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记形式,近年来发展非常迅速。本文就以下6个方面讨论了分子标记的最新进展及存在 问题:(1)用于种质资源鉴定及植物育种的主要分子标记,如限制性片段长度多态性(R FL P)、随 机扩增多态性D NA(RA PD)、简单重复序列D NA(SSR)、扩增片段长度多态性(A FL P)以及染 色体原位杂交等;(2)分子标记遗传图谱;(3)分子标记在植物种质资源研究上的应用;(4)质量 性状基因的分子标记;(5)数量性状基因位点(Q T L)的分子标记;(6)分子标记育种目前存在问 题。 关键词 分子标记;植物遗传资源;育种 遗传标记(genetic markers)是基因型的特殊的易于识别的表现形式。理想的遗传标记主要应具备以下4条标准:(1)具有较强的多态性;(2)表现为共显性(codominance),因而能够鉴别出纯合基因型或杂合基因型;(3)对主要的农艺性状没有影响;(4)经济方便,容易观察记载。当前遗传标记主要有4种类型,即形态标记(m orpho logical marker s)、细胞标记(cytolo gical markers)、生化标记(biochemical mar kers)和分子标记(m olecular markers)。形态标记即植物的外部特征特性,如株高、穗长、粒色、千粒重等。此种形态标记简单直观,长期以来作物种质资源鉴定及育种材料的选择通常都是根据形态标记来进行的。但是形态标记数少、多态性差、易受环境条件影响。人为地通过诱变等方法培育形态标记材料不仅所需周期长,而且许多形态标记还对重要的农艺性状产生不利的影响。细胞标记主要是染色体核型(染色体数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(C带、N带、G带等),显然,这类标记的数目也很有限。生化标记主要包括同工酶和贮藏蛋白。生化标记具有经济方便的优点,但其标记数有限,不能满足种质资源鉴定和育种工作的需要。 近10年来,在人类基因组研究计划(Human Geno me Initiative,简称H GI)的推动下,分子标记的研究与应用得到了迅速的发展。与上述3种标记相比,分子标记具有以下优越性:(1)直接以DNA的形式表现,在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到,不受季节、环境限制,不存在表达与否的问题;(2)数量极多,遍及整个基因组;(3)多态性高,自然存在着许多等位变异,不需专门创造特殊的遗传材料;(4)表现为“中性”,即不影响目标性状的表达,与不良性状无必然的连锁;(5)有许多分子标记表现为共显性(codominance),能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型,提供完整的遗传信息。当前,分子标记已开始应用于作物遗传资源及育种研究,分别被称为分子种质资源鉴定(m olecular germplasm diag no stics)〔3〕和分子标记育种(molecular plant breeding〔4〕或mo lecular-assisted breeding)。 收稿日期 1995-06-06
分子标记辅助选择
第十七章分子标记辅助选择育种 分子标记：以DNA多态性为基础的遗传标记 分子标记的特点：1、遗传多态性高；2、在基因组中大量存在且均匀分布；3、稳定性、重现性好；4、信息量大，分析效率高 第一节 分子标记的类型及原理 一、分子标记的类型 1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记技术：限制性片段长度多态性标记，简称RFLP标记；可变数目串联重复序列标记，简称VNTR标记；原位杂交，简称ISH 2、基于PCR的DNA标记：1）单引物PCR标记；2）双引物选择性扩增的PCR标记；3）通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记。 3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合的DNA标记。分为两类：限制性酶切片段的选择性扩增，如AFLP；PCR扩增片段的限制性酶切，如CAPs 4、基于单核苷多态性的DNA标记：单核苷酸多态性，简称SNP 二、主要分子标记 1、RFLP（Restriction Fragment Length po1ymorpams）限制性片段长度多态性 1980，Bostein用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。 （1）RFLP标记的原理 基因组DNA序列上的变化：碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶（restriction enzymes ）酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段变化 （1）RFLP标记的分析步骤 （2）RFLP分析探针 单拷贝或寡拷贝 探针来源：cDNA克隆；基因组克隆（Random Genome）；PCR克隆（3）RFLP标记的特点 优点：①数目几乎无限；②共显性；③可以利用现有探针，具有种族特异性；④RFLP标记遍及全基因组；⑥重复性好 缺点：成本较高;一个探针只能产生一个多态位点；需要许多克隆探针；所需DNA量大(5～15μg)；易造成环境污染 2、RAPD（Random Amplification Polymorphism DNA）随机扩增多态性DNA 1990,Williams通过PCR扩增染色体组DNA所获得的长度不同的多态性
分子标记辅助选择 (MAS) 的发展策略
分子标记辅助选择(MAS) 的发展策略 Molecular-assisted-selection 作者: jdt5155873(站内联系TA)收录: 2006-02-25 发布: 2006-02-25 分子标记辅助选择(MAS) 的发展策略 在表型选择有效的情况下，MAS 更适用于隐性，限性，测定困难或费用昂贵以及未成熟期鉴定性状。在实际运用过程中应用一定策略，降低应用成本，MAS 的作用将可得到更大发挥。 1.1 定位作图与育种同步进行 育种群体与定位群体之间的重组频率是有变化的，不一定相同，在不同群体中QTL 检测一致性低，而在同一群体不同世代中较高(Bohn et al.，2001)。研究者对目标基因进行定位是为了利用这些基因，一个重要途径就是进行MAS 提高种育种效率，为大规模培育优良品系或品种创造条件，而MAS 希望使用在育种群体中与目的基因重组率仍旧较低的标记。方宣钧等(2001)建议选择杂交亲本时尽量使用与育种直接有关的材料，所构建群体应尽可能做到既是遗传研究群体，又是育种群体，这样定位与MAS 同步进行可缩短基因(QTL) 定位研究与育种应用的距离，提高育种效率和MAS 效益。 1.2 选择合适标记类型 适合于MAS 的分子标记必须符合如下几个条件：检测手段简单快捷，易于实现自动化；DNA 质量要求不高，用量少，可以同时分析大量样品；信息量大，分析效率高；多态性好，在基因组中大量存在而且分布均匀；开发成本和使用成本低。目前已经发展出十几种标记技术，比较常用有RFLP、RAPD、SSR、AFLP (amplified fragment length polymorphism)、SCAR、STS 和CAPS 等。 理想分子标记应该是建立在PCR 技术基础上，重复性高，在广泛基因背景下都能表达，在不同研究者中能相互交换使用，并能有效跟踪目标基因的标记，如水稻抗白叶枯病基因Xa21 标记pTA248。而选用何种分子标记来进行MAS 选择，直接关系到选择效果。对于前景(目标基因)选择，所有标记技术都可以采用，但PCR 标记最佳，共显性SSR、CAPS 和STS 是首选标记，其次是SCAR。至于背景选择，应根据情况灵活选用，目前在低世代最合适的是RAPD、AFLP 和SSR 等，但在高世代AFLP 由于可检测到更多多态位点而优于其他标记。 夏军红等(2000)比较AFLP 和SSR 两种标记背景选择的相关性，发现达显著水平，结果具有同一性。因此，在实际应用过程中，选用一种标记类型进行背景选择即可。
分子标记辅助选择复习资料(GAU)
分子标记辅助选择复习资料（GAU） 第一章 1.DNA变性：在高温或某些化学试剂作用下双链DNA分子的两条互补的单链会相互分开的过程。 2.DNA复性：当变性的外界条件消除后，互补的单链DNA又可恢复双螺旋结构的过程。 3.基因组：是指一种生物或个体细胞所具有的一套完整的基因及其调控序列。 4.显性标记：是指F1的多态性片段与其亲本之一完全相同。如RAPD, AFLP等。 5.共显性标记：是指双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现，如RFLP, SSR,SCAR, ISSR, CAPs。 6.琼脂糖凝胶电泳：分离，纯化和鉴定长度为0.2—50Kb的DNA片段。应用于RAPD,RFLP,ISSR,SCAR等。 7.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：分离，纯化和鉴定长度为5—500bp的DNA 长度。 非变性PAGE:应用于SSR等 变性PAGE:应用于AFLP等 8.纯化后DNA浓度的确定： OD260∕OD280=1.8 纯DNA OD260∕OD280<1.8 有蛋白污染 OD260∕OD280>1.8 有RNA污染 OD260∕OD280=2.0 纯RNA OD260∕OD280<2.0 有盐，多糖等污染 9.理想分子标记需达到的要求： ①具有高的多态性 ②共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和純合基因性 ③能明确辨别等位基因 ④除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组 ⑤选择中性（即无基因多态性） ⑥检测手段简单，快速 ⑦开发成本和使用成本尽量低廉 ⑧在实验室内和实验室间重复性好 10.分子标记优越性 ①直接以DNA的形式表现 ②数量多，遍及整个基因组，检测位点近于无限 ③多态性高，不需要专门创造特殊的遗传材料 ④不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁 ⑤有许多分子标记表现为共显性 11.分子标记类型 1）以分子杂交为基础的DNA标记技术 ①限制性片段长度多态性（RFLP） ②可变数目串联重复序序列（VNTR） ③染色体原位杂交（In situ Hybridization）
分子标记辅助选择实验方法
分子标记筛选实验 DNA提取的实验仪器与耗材准备：水浴锅，高速冷冻离心机，小型离心机，预冷的异丙醇，1.5ml的灭菌eppondorf管，50 ml的灭菌离心管，70%的酒精，5M的KAc混合液，研钵，液氮，SDS抽取液，1M Tri-HCl (pH 8.0)，0.5M EDTA (pH 8.0)，TE (pH 8.0)( 相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996） 1.DNA小量提取法（SDS小量提取法） F2群体DNA采用SDS小量提取法，步骤如下： 1. 取新鲜水稻样本叶片2cm左右于1.5 eppondorf管中，加入液氮，用电钻磨碎。 2. 每管磨碎的水稻叶片中加入700ul已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水浴30min。 3. 加入200ul 预冷的5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴30min后，于40C 10000转离心4min，吸取上层液到另一准备好的1.5ml eppondorf管中。 4. 加入等体积预冷的异丙醇，置于-200C 30min后，40C 10000转离心4min。 5. 弃上清，加入70% 乙醇清洗，上下颠倒混匀，小型离心机快速离心弃上清，倒扣晾干（注：晾干不宜太久，反止DNA难溶）。 6. 将晾干的DNA溶于100ul TE溶液中， 40C保存备用。 2．DNA大量提取法（SDS大量提取法） 亲本DNA和突变体DNA池、正常株DNA池采取SDS大量提取法，步骤如下： 1.取每个水稻新鲜样本叶片1g，放入10ml离心管，加入液氮，用电钻磨碎。 2.加入5ml已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水浴20min。 3.水浴20min后加入1 ml 5MKAc混合液，上下颠倒充分混匀，冰浴20min， 冰浴期间要将离心管上下颠倒数次。 4.加入等体积的氯仿，室温下以3000（10000 rmp）的速度离心 3min，吸取 上清于另一准备好的50 ml离心管中。 5.加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃，可以看见DNA絮状沉淀。 6.用玻棒挑出DNA絮状物，用75%乙醇清洗两次，将乙醇到掉，晾干。 7.将晾干的DNA溶于500ul TE溶液中， 40C保存备用。