(慢病毒-腺病毒-逆转录病毒)三种病毒表达系统的异同点

过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1

过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因二零一一年五月

目录简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)

简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。

分子生物学试题及答案

分子生物学试题及答案一、名词解释 1．cDNA与cccDNA：cDNA是由mRNA通过反转录酶合成的双链DNA；cccDNA是游离于染色体之外的质粒双链闭合环形DNA。 2．标准折叠单位：蛋白质二级结构单元α－螺旋与β－折叠通过各种连接多肽可以组成特殊几何排列的结构块，此种确定的折叠类型通常称为超二级结构。几乎所有的三级结构都可以用这些折叠类型，乃至他们的组合型来予以描述，因此又将其称为标准折叠单位。3．CAP：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein ），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMP activated protein ） 4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互补序列，常是限制性酶切位点。 5．micRNA：互补干扰RNA或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。 6．核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。 7．模体：蛋白质分子空间结构中存在着某些立体形状和拓扑结构颇为类似的局部区域 8．信号肽：在蛋白质合成过程中N端有15~36个氨基酸残基的肽段，引导蛋白质的跨膜。

除了5’ 3’外切酶活性 19．锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 20．融合蛋白：真核蛋白的基因与外源基因连接，同时表达翻译出的原基因蛋白与外源蛋白结合在一起所组成的蛋白质。二、填空 1． DNA的物理图谱是DNA分子的（限制性内切酶酶解）片段的排列顺序。 2． RNA酶的剪切分为（自体催化）、（异体催化）两种类型。3．原核生物中有三种起始因子分别是（IF-1）、（ IF-2 ）和（IF-3 ）。4．蛋白质的跨膜需要（信号肽）的引导，蛋白伴侣的作用是（辅助肽链折叠成天然构象的蛋白质）。 5．启动子中的元件通常可以分为两种：（核心启动子元件）和（上游启动子元件）。 6．分子生物学的研究内容主要包含（结构分子生物学）、（基因表达与调控）、（ DNA重组技术）三部分。 7．证明DNA是遗传物质的两个关键性实验是（肺炎球菌感染小鼠）、（ T2噬菌体感染大肠杆菌）这两个实验中主要的论点证据是：（生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能）。 8．hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点：（ hnRNA在转变为mRNA 的过程中经过剪接，）、

慢病毒系统简介及应用

慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选；

Bac-to-bac表达系统中文版说明书

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒内容物： Introduction： Overview： Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括： *pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。 *一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感

染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。 Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点： *与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周 *减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率 *可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。

指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导： 1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择 2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒

慢病毒Cas9表达系统使用说明

慢病毒Cas9表达系统使用说明本说明书用于： ?构建Cas9蛋白表达细胞系 ?在Cas9蛋白表达细胞系中敲除目的基因适用于以下产品货号货号 pLV‐Cas9载体系列 CR2001，CR2002 pLV‐Cas9‐Nick载体系列 CR2003，CR2004 pGR载体系列 CR2011~CR2013 pGR‐EGFP载体系列 CR2014~CR2016 北京英茂盛业生物科技有限公司北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B‐916 Tel：010‐62495135 Emai：order@https://www.360docs.net/doc/c16554465.html, Web site：https://www.360docs.net/doc/c16554465.html,

目录 1、产品简介 (2) 1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理 (2) 1.2慢病毒Cas9表达系统特点 (2) 2、Cas9表达慢病毒制备 (3) 2.1试剂准备 (3) 2.2简要实验流程 (4) 2.3实验前准备 (4) 2.4病毒制备步骤 (5) 2.4 PEG纯化慢病毒 (6) 3、筛选Cas9表达稳定细胞株 (7) 3.1 试剂 (7) 3.2 实验前准备 (7) 3.3 筛选细胞系实验步骤 (8) 3.4 Cas9表达细胞系检测 (9) 4、用pTYNE载体对Cas9表达细胞系进行验证 (10) 4.1验证Cas9蛋白表达细胞系 (10) 4.2验证Cas9Nicknase蛋白表达细胞系 (11) 5、pGR和pGR‐EGFP载体构建 (13) 5.1 pGR和pGR‐EGFP载体图谱 (13) 5.2 靶点设计 (13) 5.3 pGR载体构建步骤 (14) 附录1 用到的产品 (17) 附录2 引物列表 (17) 1

病毒学复习题2011

2011病毒学复习题库一、选择（33小题） 1.目前已知病毒5种核酸类型是（）。、+DNA、、+RNA、－RNA；、+DNA、－DNA、、＋RNA；、+DNA、－DNA、、－RNA；、－DNA、、+RNA、－RNA。 2.人类免疫缺陷病毒的病毒粒子中含有（）。分子及反转录酶； B.+RNA分子及反转录酶； C.－RNA分子及反转录酶； D.+RNA分子。 3.下列哪一类病毒属于反转录病毒？（） A.腺病毒； B.脊髓灰质炎病毒； C.流感病毒； D.人类免疫缺陷病毒。 4.多数病毒粒子的直径在（）。 A.1nm上下； B.10nm上下； C.100nm上下；上下。 5.病毒粒子中的一种结构是来自寄主细胞膜的，它是（）。 A.包膜； B.刺突； C.衣壳； D.核心。 6.一些丝状噬菌体如M13等，感染寄主细胞后（）。 A.不裂解寄主细胞； B.裂解寄主细胞； C.一般不裂解寄主细胞，偶尔裂解； D.一般裂解寄主细胞，偶尔不裂解。 7.双链RNA病毒的复制方式（）。 A.都是全保留复制； B.都是半保留复制； C.都是以滚环复制； D.有一些以全保留复制，另一些则以半保留复制。 8.有3类病毒的病毒粒子中携带着核酸复制所需要的酶，它们是（）。病毒、－RNA病毒、逆转录病毒；病毒、－RNA病毒、+DNA病毒；病毒、－RNA病毒、+RNA病毒；病毒、－RNA病毒、病毒。 9.T4噬菌体侵入寄主细胞后，其早期转译所产生的蛋白质中，最重要的一种是（）。 A.T4的RNA聚合酶； B.修饰寄主的RNA聚合酶的更改蛋白； C.分解寄主细胞的DNA酶； D.T4的DNA聚合酶。 10.溶源性细菌在其染色体组上整合有（）。 A.温和噬菌体DNA； B.烈性噬菌体DNA； C.烈性噬菌体粒子； D.温和噬菌体粒子。 11.白喉棒杆菌当其染色体DNA整合了噬菌体的核酸以后，就能合成白喉毒素，成为有毒菌株，此种现象称为（）。 A.转化； B.转导； C.转染； D.溶源转变。

艾滋病患者抗癫痫药物与抗逆转录病毒药物联合使用的专家共识

艾滋病患者抗癫痫药物与抗逆转录病毒药物联合使用的专家共识艾滋病在中国人群的感染基数大、且发病率有逐年上升的趋势。据统计，大约2.6％-6.1％的艾滋病患者会发生癫痫。针对这一部分人群，抗癫痫药物(AEDs)与抗逆转录病毒药物(ARV)联合使用是重要的治疗手段。而多项回顾性队列研究和药代动力学研究表明，AEDs与ARV间存在药物相互作用，可影响药物疗效。目前，国内尚无AEDs与ARV联合使用指南。本文组织我国癫痫研究领域的专家，通过文献复习、参考国外资料及相关指南，结合我国国情和临床现状，制定该专家共识，为AEDs与ARV 联合使用提供指导。 1 艾滋病的流行病学据中国卫计委、联合国艾滋病规划署和世界卫生组织统计，截至2011年底《中国共有艾滋病病毒感染者和艾滋病患者78万人，其中艾滋病患者15.4万人，中国人群的感染率为0.058％；2011年新发艾滋病病毒感染者4.8万人，且近年来有逐年上升趋势。在艾滋病患者尸检中，约70％-80％合并有神经系统病变。30％-40％艾滋病患者生前合并有神经系统症状及体征，其中10％-27％患者以神经系统症状为首发症状。2.6％-6.1％的艾滋病患者并发癫痫，并在发病初期接受AEDs治疗(三个III类研究，n=434100550)。我国对艾滋病患者提供的一线免费ARV药物治疗包括核苷类逆转录

酶抑制剂(NRTI)齐多夫定、司他夫定、拉米夫定、去羟基苷；非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)奈韦拉平和依非韦仑。另外还有一些自费药物，如蛋白酶抑制剂(PI)洛匹那韦、利托那韦、阿扎那韦、拉替拉韦等。 2 AEDs与ARV的联合应用时的相互作用当艾滋病患者合并癫痫时，需同时服用AEDs。然而许多AEDs与ARV 之间存在复杂的相互作用。国外多个研究报道(IV级研究)患者的AEDs浓度在ARV治疗启动后发生改变。例如，具有酶诱导作用的传统AEDs如苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平等，可降低通过细胞色素P450系统代谢途径代谢的NNRTI和PI的有效剂量，导致抗病毒治疗失败、临床疾病出现进展及出现ARV抵抗。另外，使用降低AEDs血药浓度的ARV时，可降低AEDs的治疗效果、妨碍癫痫的控制。AEDs与ARV相互作用时，还可以通过提高任一药物的血药浓度而增加其毒性。而且有效的艾滋病治疗需要终身服用至少3种药物，部分艾滋病患者还需要使用酶诱导药物治疗肺结核。因此，合理的联合使用AEDs与ARV对合并癫痫的艾滋病患者具有重要意义。血清HIV病毒载量常被作为艾滋病患者接受ARV治疗后重要的疗效评判指标。ARV治疗浓度不足时HIV病毒的抑制率较低，可导致机体免疫功能衰竭，CD4+T细胞减少、临床进展和机会性感染增加，也易导致ARV耐药性的产生。因此，在研究酶诱导的AEDs与ARV相互作用时，血清HIV病毒载量可作为评判AEDs是否影响酶诱导药物的有效指标。

慢病毒载体,稳定表达

慢病毒载体，稳定表达一、慢病毒逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。慢病毒结构： 2个调节基因：（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白（附属）基因：（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；（2）vpr和nef参与疾病的表现。慢病毒的优势： 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因； 2.可感染分裂和非分裂细胞； 3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验； 4.可以更换特异性启动子； 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；

二、慢病毒载体慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。慢病毒包装过程：慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物）三、慢病毒的使用和优势慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位）检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。图3 MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。最后，818 一些有关慢病毒方面的产品： 1.关于慢病毒载体构建方面： ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】

抗逆转录病毒药物研究

抗逆转录病毒药物的研究梁振洁广东工业大学轻工化工学院09级生物工程1班广州 510006 摘要：抗逆转录病毒药是一类于治疗逆转录病毒（主要是HIV）感染的药物。其作用是最大限度地抑制病毒的复制，保存和恢复免疫功能，降低病死率和HIV相关性疾病的发病率，提高患者的生活质量，减少艾滋病的传播。关键词：HIV，抗逆转录病毒药物，高效抗逆转录病毒治疗(HAART) 前言：在近日举行的美国科学促进会年会上，南非流行病模拟与分析中心主任布莱恩·威廉姆斯表示，通过测试每一个可能感染艾滋病病毒的人，并且用抗逆转录病毒药物对这些高危人群进行治疗，可在5年后阻止所有新的感染发生，并在40年内彻底根除艾滋病这个全球“顽疾”。抗逆转录病毒药物可大幅降低人类血液中人类免疫缺陷病毒（HIV）的浓度，另外，除了保护人们免受艾滋病病毒侵袭之外，抗逆转录病毒药物还能降低个体的传染性，即艾滋病患者将艾滋病病毒传播给他人的能力。威廉姆斯称，人们最大的希望是不仅利用抗逆转录病毒疗法挽救艾滋病患者的生命，也希望这种疗法能够减少艾滋病病毒的传播。通过这种途径，或许能在10年内阻断艾滋病病毒的传播并将与艾滋病有关的肺结核的发病率减少一半，在40年内消灭这两种传染病。 1.1艾滋病的发病机理： HIV病毒为逆转录病毒，所以遗传信息存在于两个相同的RNA单链模板中。该病毒能结合人类具有CD 4+受体的细胞，特别是和 CD 4 T辅助淋巴细胞相结合，还能与神经细胞表面的半乳糖神经酰胺结合，逆转录酶可将病毒RNA逆转录为DNA，然后DNA再与人类基因相整合。病毒DNA序列被感染细胞及其子代细胞终身携带。 HIV进入人体后能选择性地侵犯有CD 4受体的淋巴细胞，以CD 4 T淋巴细胞为主。当HIV 的包膜蛋白gp120与CD 4T淋巴细胞表面的CD 4 受体结合后，在gp41透膜蛋白的协助下，HIV 的膜与细胞膜相融合，病毒进入细胞内。当病毒进入细胞内后迅速脱去外壳，为进一步复制作好准备。最近研究表明，HIV进入细胞内除CD 4 受体外，还需要细胞表面的蛋白酶同gp120的V3环发生相互作用才能完成。 HIV病毒在宿主细胞复制开始，首先二条RNA在病毒逆转录酶的作用下逆转为DNA，再以DNA为模板，在DNA多聚酶的作用下复制DNA，这些DNA部分存留在细胞浆内。进行低水平复制。部分与宿主细胞核的染色质的DNA整合在一起，成为前病毒，使感染进入潜伏期，经过2-10年的潜伏性感染阶段，当受染细胞被激活，前病毒DNA在转录酶作用下转录成RNA，RNA再翻译成蛋白质。经过装配后形成大量的新病毒颗粒，这些病毒颗粒释放出来后，继续攻击其他CD 4T淋巴细胞。大量的CD 4 +T淋巴细胞被HIV攻击后，细胞功能被损害和大量破坏是AIDS患者免疫功能缺陷的原因。 2.1抗逆转录病毒药物抗逆转录病毒药物大体上是按照药物抑制逆转录病毒生存周期的不同时期来分类的。因此抗逆转录病毒药物的大体分类如下：逆转录酶抑制剂(RTI) 通过抑制逆转录酶的活性来靶向抑制病毒DNA的合成。蛋白酶抑制剂 (PI)通过抑制蛋白酶的活性来靶向抑制病毒的组装。HIV使用蛋白酶来分裂初始的蛋白来组装最终的新的病毒体。融合抑制剂（Fusion inhibitor）阻止HIV通过融合细胞膜来进入和感染细胞。整合酶抑制剂抑制酶的整合，整合酶对病毒DNA整合入感染细胞非常重要。

慢病毒转染手册

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。慢病毒载体

基因工程测试题及答案

基因工程测练题 1、将人的抗病毒干扰基因“嫁接”到烟草的DNA分子中，可使烟草获得抗病毒的能力，形成转基因产品。试分析回答： (1) 人的基因工程之所以能接到植物体中去，原因是：。(4)不同生物间基因移植成功，说明生物共有一套，从进化的角度看，这些生物具有。 (3) 烟草具有抗病毒能力，说明烟草体内产生：。 (4) 烟草DNA分子被“嫁接”上或“切割”掉某个基因，实际并不影响遗传信息的表达功能。这说明。 (5) 有人认为，转基因新产品也是一把双刃剑，有如船能载舟也能覆舟，甚至可能带来灾难性的后果，你是否支持这一观点？如果支持，请你举出一个可能出现的灾难性后果的实例：。 2、1990年对一位缺乏腺苷脱氨酶基因，而患先天性体液兔疫缺陷病的美国女孩进行基因治疗，其方法是首先将患者的白细胞取出作体外培养，然后用逆转录病毒将正常腺苷脱氨酶基因转入人工培养的白细胞中，再将这些转基因白细胞回输到患者的体内，经过多次治疗，患者的免疫功能趋于正常。（1）在基因治疗过程中，逆转录病毒的作用相当于基因工程中基因操作工具中的，此基因工程中的目的基因是，目的基因的受体细胞是。（2）将转基因白细胞多次回输到患者体内后，兔疫能力趋于正常是由于产生了，产生这种物质的两个基本步骤是、。 3、在植物基因工程中，用土壤农杆菌中的Ti质粒作为运载体，把目的基因重组入Ti质粒上的 T-DNA片段中，再将重组的T-DNA插入植物细胞的染色体DNA中。（1）科学家在进行上述基因操作时，要用同一种分别切割质粒和目的基因，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就可通过而黏合。（2）将携带抗除草剂基因的重组Ti质粒导入二倍体油菜细胞，经培养、筛选获得一株有抗除草剂特性的转基因植株。经分析，该植株含有一个携带目的基因的T-DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论上，在该转基因植株自交F1代中，仍具有抗除草剂特性的植株占总数的，原因。（3）种植上述转基因油菜，它所携带的目的基因可以通过花粉传递给近缘物种，造成“基因污染”。如果把目的基因导入叶绿体DNA中，就可以避免“基因污染”，原因是: 。

病毒学——练习题

复习题一、名词解释 1.病毒 2.病毒体 3.壳粒 4.刺突 5.核衣壳 6.复制周期 7.缺陷病毒 8.病毒灭活二、选择题 A1型题 1.下列为病毒的特殊结构的是： A.核心 B.衣壳 C.壳粒 D.核衣壳 E.刺突 2.下列有关病毒体的概念,错误的是 A.完整成熟的病毒颗粒 B.细胞外的病毒结构 C.具有感染性 D.具有核衣壳 E.在宿主细胞内复制的病毒组装成分 3.下列描述病毒的基本性状中,错误的是 A.专性细胞内寄生 B.只含有一种核酸 C.形态微小,可通过滤菌器 D.结构简单,无典型细胞结构 E.可在宿主细胞外复制病毒成分 4.下列与病毒蛋白质特性无关的是 A.保护作用 B.吸附作用 C.脂溶剂可破坏其敏感性 D.病毒包膜的主要成分 E.免疫原性 5.关于病毒的概念,错误的是 A.病毒在细胞外不能产生能量 B.病毒在细胞外不能合成蛋白质 C.病毒在细胞外不能合成自身复制所需要的酶 D.病毒需降解宿主细胞的DNA以获得核苷酸 E.包膜病毒需用宿主的细胞膜作为包膜成分 6.病毒在宿主细胞内的复制周期过程,正确的描述是 A.吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装成熟与释放 B.吸附、脱壳、生物合成、成熟及释放 C.吸附、结合、穿入、生物合成、成熟及释放 D.特异性结合、脱壳、复制、组装及释放 E.结合、复制、组装及释放 7.裸露病毒体的结构是 A.核酸+包膜 B.核心+衣壳+包膜 C.核衣壳+包膜 D.核心+衣壳 E.核酸+蛋白质 8.下列不是病毒体的特征 A.非细胞结构 B.只含一种类型核酸 C.对抗生素不敏感 D.可在任何活细胞内增殖 E.对干扰素敏感 9.关于病毒核酸的描述，错误的是 A.可控制病毒的遗传和变异 B.可决定病毒的感染性

哈尔滨2018届高三下学期第四次模拟理科综合考试生物试题含答案

黑龙江省哈师大附中2018年高三第四次模拟考试理科综合能力测试生物试题一、选择题 1.研究表明某些病毒包膜蛋白在较低pH时，具有催化细胞膜融合的功能，并且人们已克隆出多种具有融合作用的病毒融合蛋白的基因。下列说法错误的是 A.细胞膜融合体现了膜的功能特性------流动性 B.如果将病毒融合蛋白基因导入真核细胞并表达，真核细胞会融合成巨大的多核细胞 C.如果哺乳动物细胞膜存在类似于病毒的融合蛋白，可能在受精过程中起作用 D.病毒的包膜蛋白是有病毒的遗传物质在宿主细胞内产生的 2.以下生物学实验中所用试剂不同时使用的是 A.研究人口腔上皮细胞DNA合RNA分布时所用的吡罗红和甲基绿 B.解离洋葱根尖细胞时所用的盐酸和酒精 C.检验果汁中是否存在还原糖时所用的CuSO4和NaOH溶液 D.将染色体染色时所用的龙胆紫和醋酸洋红 3.下列关于HIV的叙述，错误的是 A.HIV属于逆转录病毒，它能以RNA为模板合成DNA B.HIV侵染的T淋巴细胞会合成新的HIV C.HIV侵染宿主细胞时，增殖所需的酶、模板和能量均由宿主细胞提供 D.HIV破坏淋巴细胞，导致艾滋病，病人大多死于其他病原微生物的感染 4.下列关于动、植物激素的叙述，不正确的是 A.用一定浓度的赤霉素溶液处理芹菜植株，可以明显提高其产量 B.新买的猕猴桃和成熟的苹果放在一起几天后变软，与植物激素乙烯有关 C.雄性激素具有增强肌肉力量，提高速度和耐力的作用 D.补充甲状腺激素的方法只能注射，不能口服 5.下列相关叙述正确的是 A.急性肾小球肾炎患者组织水肿的原因是血浆蛋白合成减少 B.人体剧烈运动会使血浆pH有所波动，是由于局部组织细胞无氧呼吸产生CO2 C.一般情况下，Na+在人体神经细胞的细胞内液与组织液中的生理指标非常接近 D.纤维蛋白原是人体内环境的重要组成成分 6.下图为某种遗传病在两个家庭中的发病情况，其中5号与6号婚配生一女孩，分析该遗传

《现代生物学概论》期末考试试题,卷.doc

《普通生物学A》期末考试试题（2004-2005，第一学期） 2005年1月10日院系__________姓名______________学号______________成绩______________ 一、填空（每空0.5分，共40分） 1．蛋白质是由__20__种氨基酸通过__肽_键连接而成，可以用放射性同位素__35S__来特异地标记；核酸可以用__32P__来特异标记；__亚油酸_和__亚麻酸_是人体必需的脂肪酸。 2．蛋白质变性的主要标志是__生物活性丧失，这是因为蛋白质的_高（或二、三、四）级结构被破坏。某些变性的蛋白质在一定条件下可以自动恢复活性，说明蛋白质的__一级结构_决定蛋白质的_高（或二、三、四）级结构_。 3．光合作用的光反应阶段是在类囊体膜上进行，它又可分为两个光系统，即光系统__I__和光系统_II_。前者的产物是_NADPH（或还原力）_，后者的产物是_ATP 和氧气_。光合作用的暗反应在_叶绿体基质进行，其主要作用是固定_二氧化碳_，这一过程称为_Calvin（或开尔文）_循环。 4．细胞周期包括_G1、__S_、_G2_和__M_四个时期。大部分蛋白质的合成是在__G1_期；DNA复制在_S_期。调节细胞周期的最主要的因子叫做_MPF（或有丝分裂促进因子或促卵泡成熟因子）_，它由Cyclin（或周期蛋白）_和_CDK（或周期蛋白依赖的蛋白激酶）_两种蛋白组成。细胞周期有3个检验点，它们分别位于G1/S、_G2/M_和M期，抑癌基因产物_p53（或Rb）_对G1/S检验点的形成很重要。5．不同物质的跨膜运输方式不同，请将下列物质与其运输方式相连： O2进入红细胞肠道葡萄糖进入小肠上皮细胞自由扩散 K＋进入神经细胞协助扩散葡萄糖从小肠上皮细胞进入血液胞吞作用 Ca2+排出肌肉细胞胞吐作用胰岛素分泌主动运输白细胞吞噬细菌 6．细胞通讯与信号传递，对细胞的生命活动很重要。在这一过程中，能引起细胞反应的

杆状病毒表达系统简介

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。 1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用： ①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。 ②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae 的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。杆状病毒基因组的结构和功能研究杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角

职业暴露与防护试题题

职业暴露与防护试题(58题) 一、单项选择（10题）二、多项选择（15题）三、填空题(18题) 四、判断题（13题）五、简答题（2题）一、单项选择（10题） 1、职业暴露的原因有（D） A 针刺 B 切割 C 直接接触 D 以上都对 2、预防艾滋病病毒感染的防控理念是什么？（B） A 一般预防 B 标准预防 C 接触隔离 D 以上都对 3、下列哪类人群不属于艾滋病毒感染的高危人群（D） A 同性恋者??? B 性滥交者?? C 静脉吸毒者?? D 医护人员 4、以下哪项不是艾滋病毒的传播方式？（C） A 共用针头或注射器 B 性接触 C 日常生活接触 D 母婴传播 5、在诊疗、护理操作过程中，有可能发生艾滋病人的血液、体液飞溅到医务人员的面部时，医务人员以下那种做法是错误的（D） A 戴手套B防渗透性能的口罩 C 戴防护眼镜 D 戴纱布口罩 6、为防针刺伤，错误的做法是（D） A 使用后的锐器直接放入耐刺、防渗漏的利器盒 B 利用针头处理设备进行安全处置 C 使用具有安全性能的注射器、输液器等医用锐器，以防刺伤

D 针头用后立即套回针套，以防扎伤别人 7、艾滋病病毒职业暴露级别分为三级，下列哪项确定为三级暴露（C） A 暴露源沾染了有损伤的皮肤或者粘膜，暴露量大且暴露时间较长 B暴露源沾染了有损伤的皮肤或者粘膜，暴露量小且暴露时间较短 C暴露源刺伤或者割伤皮肤，损伤程度较重，为深部伤口或者，割伤物有明显可见的血液 D暴露源刺伤或者割伤皮肤，但损伤程度较轻，为表皮擦伤或者针刺伤 8、艾滋病暴露源的病毒载量水平分为轻度、重度和暴露源不明三种类型，以下属于轻度的是（A） A 经检验，暴露源为艾滋病病毒阳性，但滴度低、艾滋病病毒感染者无临床症状、CD4计数正常者 B 经检验，暴露源为艾滋病病毒阳性，但滴度高、艾滋病病毒感染者有临床症状、CD4计数低者 C 不能确定暴露源是否为艾滋病病毒阳性者 D 上述都不对 9、艾滋病暴露源的病毒载量水平分为轻度、重度和暴露源不明三种类型，以下属于重度的是（B） A 经检验，暴露源为艾滋病病毒阳性，但滴度低、艾滋病病毒感染者无临床症状、CD4计数正常者 B 经检验，暴露源为艾滋病病毒阳性，但滴度高、艾滋病病毒感染者有临床症状、CD4计数低者 C 不能确定暴露源是否为艾滋病病毒阳性者

医学微生物学习题及答案18-逆转录病毒

医学微生物习题第33章逆转录病毒第34章其它病毒测试题一.名词解释 1.内基小体(negri bady) 2.逆转录病毒(retroviruses) 3.gp120 4.街毒株二.填空题 1.狂犬病病毒是一种侵犯中枢神经系统,引起和狂犬病的病原体. 2.狂犬病病毒感染机体的重要特点是经感染,而不经传播. 3.狂犬病病毒在大脑大量复制,并可通过下行,到达各种组织器官. 4.对人类有致病作用的逆转录病毒亚科有和 . 5.HIV有两个型别,分别是单股正链RNA 和 . 6.HIV感染宿主细胞时,病毒的和结合. 7.HIV吸附细胞的表面结构是 ,细胞上的受体是 .具有该受体的细胞有 , , , 等. 三．单选题 1.狂犬病病毒的基因组结构为 A.单股正链RNA B.单股负链DNA C.单股线状,不分节段的负链RNA D.单股线状,可分节段的负链RNA E.双股环状DNA 2.关于狂犬病病毒的血清型正确的是 A.只有1个血清型 B.有2个血清型 C.有3个血清型 D.有4个血清型 E.有5个以上血清型 3.关于狂犬病病毒不正确的描述是 A.可通过虫媒传播 B.在中枢神经细胞胞浆内形成内基小体(Negri Bodies) C.不会引起化脓性脑炎 D.病毒沿感觉神经末梢扩散到脑干 E.病毒对外界抵抗力不强,56℃30分钟即可杀灭 4.下列对逆转录病毒形态与结构描述不正确的是 A.病毒颗粒呈二十面体立体对称的球形,直径为27nm左右 B.P24蛋白构成病毒衣壳 C.病毒外层包有脂蛋白包膜,并嵌有g P120和g P41糖蛋白 D.病毒衣壳内有两条正链RNA基因组,呈双聚体形式 E.病毒核心部分含有其进行复制的蛋白酶,整合酶和逆转录酶