实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
实验一小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定实验方案：
（一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液
一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用
二、实验原理：
1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧
2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞
匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质）
3、氯仿; Pr沉淀剂，CA T由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀
4、离心：离心机分离固液
三、实验步骤：
1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g
2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,
组织捣碎机匀浆3-5min
3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min
4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液
5、【留样】取匀浆上清液60ul，加入20ul4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5min，备SDS-PAGE
检测，-20℃冰箱保存。另取60ul匀浆后的上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。
（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶
一、实验目的：掌握盐析与透析法的方法与原理
二、实验原理：
1、在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程
2、盐酸沉淀原理：中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而沉淀析出
3、透析:利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子
的一种分离纯化技术
三、实验步骤：
1、向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰冰浴搅拌状态
下浴搅拌1h；
2、将盐析溶液离心（4℃，6000rpm，10min）后弃上清液，保留沉淀；
3、用肝重4倍体积的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助
溶）10min，离心10（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，保留沉淀；
4、留样：取盐析后上清液样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检
测，-20℃冰箱保存。
5、将透析袋（截流量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用。
6、将上清液放入透析袋，（截流量10-20KD，直径2公分）内，置于透析液（20%乙
醇，0.1mol/L，pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/LNaCl溶液）中透析一周，中途更换一
次透析液；
7、一周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（4℃6000rpm，10min）后，弃上清，收集
沉淀；
8、用2ml~3ml的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH4.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器
助溶），离心（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。（测OD280，若
蛋白浓度小于1mg/ml）
9、留样：取透析后上清样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检测，
-20℃冰箱保存。
10. 将透析袋置于沸水中煮沸15min，清洗晾凉后备用
11 .将收获的样品液放入处理后的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩两个小时将样
品浓缩至400-500ul收样，放置4℃
（三）凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶
一、实验目的：
二、实验原理：
三、实验步骤：
1、凝胶的处理：每组取2.5g sepadexG-200葡聚糖凝胶干粉，浸泡与蒸馏水充分膨胀倾
斜法除去表面的悬浮小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），继续浸泡一天
2、装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填上一层海绵垫。将层
析柱将垂直夹与铁架上，将层析柱下端额止水架夹紧，向柱中加入约5-7cm高的缓
冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱。当凝集颗粒沉
积约2cm高时，开启止水夹子使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高达35cm时为止。关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡，表面要平整。
3、平衡：打开层析柱口，控制流速为0.3-0.5mL／min（约5-10滴／min），用磷酸缓冲
液（0.1mol／L,pH7.8）流洗平衡20min。凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm 的
高度不得出现干胶和断层，应保持凝胶面平衡
4、浓缩样品（前次实验已经操作）
5、加样：打开层析柱口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面齐平时，关上出口。
用吸管吸取待分离的浓缩后的样品溶液400-500ul，在接近凝胶床表面处沿层析柱内
壁缓缓加入。打开层析柱口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。待样品液恰好完
全进入凝胶上端内面时，立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸缓冲液小心冲洗管
壁上的蛋白质，然后再加入磷酸缓冲液至距凝胶柱表面约4cm高。
6、洗脱：洗脱过程中不断加入磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），保持0.3-0.5mL／min
（约5-10滴／min）的流速，洗脱速度不可过快，以防样品带扩散。
7、收集及检测：样品进胶开始，用试管收集流出液，。收集管依次在407nm和280nm
波长下，以磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8）调零，测定各管吸光度值。以管号为横
坐标吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线
8、收获纯化产物：合并收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管，再次测定OD407nm
和OD280nm波长下的吸光度值即为最终得到的纯化产物
9、留样：取2mL纯化产物存样备用于蛋白浓度及Km至测定，放置4℃冰箱保存.
10、留样：取浓缩后的层析纯化样品60ul，用20uL4×电泳上样Buffer制样，备用于
SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存放置。
四、实验结果
（四）SDS-PAGE法测定纯化的过氧化氢酶分子量
一、实验目的：
二、实验原理：
1、电泳：带点粒子在电场中的泳动
条件：带电粒子、电场、介质
影响因素：1）电场强度2）带电粒子情况3)带电粒子形状4）带电粒子分子量
2、SDS-PAGE：上样缓冲液的成分1）溴酚蓝：指示剂2）油：比重剂
3）β-巯基乙醇：破坏蛋白二硫键4）SDS：破坏蛋白氢键和疏水键
3、测分子量：lgMW=A-BRf Rf=过氧化氢酶的迁移率/溴酚蓝的迁移率
三、实验步骤：
1、凝胶的制备（由实验室老师完成，包括装板、配胶、凝胶液的灌注和聚合）
2、蛋白质样品的处理：将样品放在沸水中煮沸5min
3、加样：在垂直板型电泳装置的两个槽内加电极缓冲液，必须使缓冲液高于电极，然
后用微量注射器分别在各个样品槽中加样，匀浆液加15ul，盐析液和透析液加30ul
4、电泳：上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始电流控制在15-20mA电
泳15min后再升到50mA,保持电流强度不变，待指示剂溴酚蓝迁移至下沿约1-1.5cm
处，停止电泳，需h
5、剥胶和固定：电泳结束后取下凝胶管，用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水，插入
凝胶柱与玻璃管内壁之间，轻轻旋转玻璃管，一面注入蒸馏水，一面推针呈旋转式前进，是凝胶柱与管壁脱离
6、染色：将凝胶浸入染色液（0.1%考马斯亮兰R-250，40%甲醇和10%的冰醋酸）中，
染色0.5h，弃去染色液
7、脱色：加入脱色液（10%甲醇和10%的冰醋酸），脱色1-3h，期间更换2-3次脱色液，
然后将胶浸泡脱色液中过夜，至背景透明清楚后为止
8、测量和数据处理
四、实验结果：如图所示
（五）过氧化氢酶米氏常数的测定
一、实验目的：学会滴定的方法和Km值的测定
二、实验原理：
1、V=Vmax［s］/Km+［s］1/V=Kmax/Vmax［s］+1/Vmax
2、2H2O2 2H 2O +O2(反应学原理)
剩余的用KMnO4滴定：2 KMnO4+5 H2O2+3 H2SO4 2MnSO4 + K2SO4+5O2+8H 2O 在酸性环境下（硫酸）紫红色变为滴定终点的微红色，记录滴定用的ml数，取平均值计算H2O2的准确摩尔浓度。求出反应前后的浓度差及反应的速度（V），以1/［s］为横坐标，1/V为纵坐标作图可求出酶的H2O2Km值
三、实验步骤：
1、稀释样品匀浆：4ul匀浆+4mlPBS 层析：2ul层析+1mlPBS
2、取6个50ml干燥的锥形瓶，编号后按下表操作
要求：试剂加入准确而迅速，立即摇匀。加入试剂10min后到时立即加入25% H2SO42.0ml，边加边摇匀，终止酶促反应
3、滴定：用标准的0.002mol/L KMnO4滴定，记录个瓶消耗的KMnO4ml数
小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定
小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定
摘要目的分离纯化过氧化氢酶，测定其相关性质。方法采用匀浆、盐析、透析、层析等方法分离纯化过氧化氢酶，采用Lorry 法测定蛋白含量，SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量，双倒数法测定酶的米氏常数。结论相对分子质量为60.25kD，以过氧化氢为底物时酶的Km值为0.133mol/L，酶层析后的比活为0.686IU/mg。 关键词小鼠过氧化氢酶纯化米氏常数SDS-PAGE 前言过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名触酶(Catalase，CAT),是一种广泛存在于生物组织的氧化还原酶[1]。过氧化氢酶是一种四聚体血晶素酶, 由四个相同四面体排列的亚基组成,每一个亚基相对分子质量约60000，每一个分子都包含有四个高铁血红素基团,分子量在240000左右[2]。 在人体内以肝和肾脏所含过氧化氢酶活性最高, 结缔组织活性最弱,其它组织如红细胞、脾、小肠、肌肉等均含有过氧化氢酶。过氧化氢酶在细胞内主要与线粒体及过氧化物酶体结合, 在红细胞内呈溶解状态。过氧化氢酶是一种与D－氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联的酶, 具有重要的生理功能。过氧化氢酶能将细胞代谢所产生的毒性物质迅速加以清除, 从而起到和谷胱肽过氧化酶共同保护琉基酶、膜蛋白和解毒的作用。近年来, 过氧化氢酶的活性测定被作为与肿瘤和抗衰老有关的酶学指标而受到关注。[3] 近年来，过氧化氢酶活性的测定被作为与肿瘤和抗衰老有关，蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点之一。[4] 1实验器材 1.1实验动物 昆明小鼠6只，雌雄不限，由河北医科大学动物实验中心提供。 1.2主要仪器 5200型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司），UV-5200 冷冻离心机(湖南相依实验仪器开发有限公司)，BCD-185冰箱（青岛海尔公司），微量移液器，40W匀浆器（江苏国华仪器厂），电泳仪（北京六一） 2实验方法
小鼠解剖实验报告
°实验五：小鼠解剖实验 吴雪薇121140059 一、实验目的 1、通过实验学习给小鼠注射、灌胃等技术操作 2、了解戊巴比妥对哺乳动物的影响 3、复习解剖的基本操作 4、通过实验了解小鼠唾液腺的结构 5、通过实验了解小鼠体内器官、系统构造 二、实验原理 1、小鼠唾液腺 唾液腺由颌下腺、腮腺、舌下腺组成，颌下腺最明显，颌下腺两边弥散的是腮腺，舌下腺连于颌下腺上，容易与颌下腺上连的淋巴结搞混。 2、会厌软骨 会厌软骨即构成会厌的软骨，形状扁平，像树叶，下部附着在喉结的内壁上。会厌是喉头上前部的树叶状结构，由会厌软骨和黏膜构成。呼吸或说话时，会厌向上，使喉腔开放；咽东西时，会厌向下，盖住气管，使东西不至进入气管内。 3、小鼠体内结构 （1）胸腔：胸腔内的结构主要有食道、心、肺。 （2）腹腔：主要有胃、肝、胆、胰、脾、肠、肾（包括肾上腺）、输尿管、膀胱和生殖器官：卵巢、输卵管、子宫（雌），睾丸、附睾、精囊腺、输精管（雄）。 （3）胸腔与腹腔由膈膜隔开。 三、实验器材 注射器、烧杯、灌胃针、解剖盘、解剖剪刀、镊子、解剖针、钉子 四、实验材料 小鼠1只、戊巴比妥溶液 五、实验操作 1、抓取一只小鼠，拎住尾巴根部，使其前肢抓在抹布上，后肢提起，用注射器 向其腹腔注射0.5ml戊巴比妥溶液。 2、将小鼠放在烧杯中，观察它的反应。 3、待小鼠不再动时，用注射器向其腹腔再注射0.5ml戊巴比妥溶液，使其死亡。 4、将小鼠放在解剖盘上，用大头针将四肢固定在解剖盘上。 5、用解剖剪刀，从靠近肛门处剪开表皮直至口腔，观察唾液腺。 6、剪开口腔，观察会厌软骨。 7、剪开腹腔和胸腔，观察小鼠体内结构。 8、处理小鼠，清洗、整理实验器材。 六、实验结果 1、观察注射戊巴比妥溶液后的小鼠 本次实验第一次注射，注射了0.4ml的戊巴比妥溶液，第二次注射了0.6ml。
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小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 摘要： 过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。 过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。 现报告如下： 一、实验器材 1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供） 2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机， CU600型电热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱
二、实验方法 ●匀浆 是根据过氧化氢酶的性质，利用有机溶剂将组织细胞捣碎，使其释放出来的方法。 小鼠肝脏匀浆液制备：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出肝脏，称重 6g；按1：8.5的比例加入匀浆缓冲液51ml（0.05mol/L醋酸-23.5%乙醇缓冲液， pH4.0）,匀浆机捣碎3-5min；缓慢滴加匀浆液体积0.5倍的氯仿（边加边快速搅拌）再次匀浆1min；匀浆液离心（4℃, 6500rpm, 30min）后保留上清液备用。 ●盐析 是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。 盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4
肝脏病常用的实验室检查
肝脏病常用的实验室检查 一、填空题 1、健康体格检查时可选择（）（），从而发现病毒性肝炎。 2、怀疑原发性肝癌时，除查一般肝功能外，应加查（）（）及其同工 酶，（）及其同工酶。 3、、怀疑为肝纤维化或肝硬化时，ALT、AST、STB、A/G、蛋白电泳、ICG为筛选检查， 此外应查（）（）及（）。 4、、肝细胞受损时，LCAT合成减少，胆固醇的酯化障碍，血中胆固醇酯（）。 5、M蛋白血症，主要见于（），（）。 二、是非题 1、90%以上的蛋白质及全部清蛋白由肝脏合成。( ) 2、清蛋白含量与有功能的肝细胞数量呈反比。( ) 3、A/G倒置可以是清蛋白降低亦可以因球蛋白增高引起，可见于严重肝功能损伤。( ) 4、凝血酶原是时间测定可以判断肝病预后。( ) 5、血氨增高可见于严重肝病、上消化道出血、尿毒症及肝外门脉系统分流等。( ) 6、梗阻性黄疸时CB轻度增加，VCB明显增加，尿胆红素阴性。( ) 三、名词解释 1、A/G倒置 2、血清结合胆红素 3、同工酶 4、“胆酶分离”现象 四、选择题 Ａ型题 1—10 1、下列哪项是反映肝损害的最敏感的检查指标？( ) A、AFP（甲胎蛋白） B、ALT（丙氨酸氨基转移酶） C、AST（天门冬氨基转移 酶） D、ｒ－GT（ｒ－谷氨酰转移） E、ALP（碱性磷酸酶） 2、当临床上怀疑急性肝炎时，应尽快做下列哪项检查？( ) A、血清胆红素 B、ALT C、ALP D、血清胆红素 E、血清胆固醇 3、血清铁降低见于: ( ) A、急性肝炎 B、慢性肝炎复发时 C、肝细胞性黄疸 D、肝硬变黄疸 E、阻塞性黄疸 4、天门冬酸氨基转移酶同I酶（ASTm）升高对下列那种疾病的诊断最有意义？( ) A肝硬变 B、慢性肝炎 C、重症肝炎、肝坏死 D、肝癌 E、阻塞性黄疸 5、下列哪项对诊断肝钎维化最有意义？( ) A、MAO（单胺氧化酶） B、GGT C、ALT D、AFP E、ALP 6、尿胆原减少或缺如见于：( ) A、慢性肝炎 B、溶血性贫血 C、顽固性便秘 D、碱性尿时 E、胆道梗阻 7、关于尿胆红素测定，下列叙述那项正确？( ) A、正常可出现阳性反应 B、肝细胞黄疸时，尿胆红素中度增加 C、阻塞性黄疸时，尿胆红素阴性 D、溶血性黄疸时，尿胆红素明显增加 E、严重肾损伤时，尿胆红素明显增加 8、下列那种疾病胆固醇降低: ( ) A、阻塞性黄疸 B、肝硬变 C、肾病综合征 D、冠心病 E、脑动脉硬化 9、下列那种器官是合成胆固醇的主要脏器？( ) A、肝脏 B、脾脏 C、肾脏 D、肌肉 E、脑 10、保证血氨正常的关键是：( ) A、氨转变成氨基酸分子上的氨基
实验小鼠
实验小鼠（laboratory mouse)学名(Mus muscculus)，实验小鼠来自于野生小鼠，经人们长期选择培育而成。18世纪就被用做动物试验，是目前应用最广泛、被研究的最清楚、最深入的实验动物。已育成的小鼠品种品系有500多种。 一、生物学特性 （一）、动物学分类位置 小鼠属于脊椎动物门，哺乳纲、啮齿目、鼠科、鼷鼠属、小家鼠种。 （二）、一般特性 1、外观：小鼠面部尖突，头呈锥体形，嘴脸前部两侧有19根触须，耳耸立呈半圆形，眼睛大。尾长约与身长相等，尾部覆有短毛和环状角质鳞片。健康小鼠皮毛光滑紧贴皮肤，四肢匀称，眼睛亮而有神。小鼠有多种毛色。 2、体形小，生命周期短，易于饲养管理。出生体重仅1.5克左右，一月龄体重约18--22克。成年小鼠每日食量5--8克，饮水4--7毫升，排粪1.4--2.8克/天，排尿1--3毫升/天。 3、性情温顺，胆小怕惊。 4、成熟早，繁殖力强。雌35--50日龄，雄45-60日龄就可性成熟，雌65--75日龄，雄70--80日龄可达体成熟。性周期4--5天，妊娠期19--21天，哺乳期20--21天，年产6--9胎。属全年多发情动物，产后即发情。 5、反应敏感，适应性差。对多种病原体、毒素及致癌物都很敏感，外界环境光照、噪音、营养、温度、空气质量等多种因素均可对小鼠造成影响。 6、昼伏夜动，喜欢啃咬。喜光线较暗的安静环境，进食、分娩都常发生在夜间，傍晚和黎明前是小鼠活动的两个高峰。 7、喜群居。 8、小鼠有20对染色体，推测有3万多个结构基因，已查明的已有648个。 9、寿命为2--3年。 （三）、解剖生理特点： 1、小鼠上、下颌各有两个门齿，六个臼齿，门齿终生不断生长，需经常磨损来维持齿端的长短，保持恒定。 2、小鼠下颌骨形态有品系特征，可用下颌骨形态分析技术进行近交系小鼠遗传监测。 3、内部脏器：食道细长约2cm，胃分前胃和腺胃，胃容量小（1--1.5ml),胃功能较差，不耐饥饿；有胆囊；胰腺分散在十二指肠、胃底及脾门处；无汗腺；淋巴系统发达；脾脏有明显造血功能；无腭或咽部扁桃体；左肺单叶，右肺四叶；骨髓为红骨髓而无黄骨髓，终生造血；雌鼠为双子宫型，呈Y字型，卵巢有系膜包绕，不与腹腔相通；乳腺发达，共有五对乳头，胸部3对，鼠蹊部2对；雄鼠睾丸大，幼鼠时藏于腹腔内，性成熟后下降到阴囊；前列腺分背、腹两叶。 二、在生物医学中的应用 （一）、药物研究 1、药物安全性评价 小鼠常用于药物的急性、亚急性、慢性毒性试验以及最大耐药量的测定等，“三致”试验也常用小鼠进行。 2、生物制品的检定 3、药物筛选 4、药效学评价试验
诊断学第一节肝脏病常用实验室检测项目
第一节肝脏病常用的实验室 检测项目 为发现肝脏损伤及了解、评估肝脏各种功能状态而设计的众多实验室检测方法，广义上可统称为肝功能试验（1iver function test，LFTs）。肝癌标志物、肝炎病毒血清标志物及基因检测因不属基本肝功能范畴，在其他相关章节中讲述。 一、蛋白质代谢功能检测 除γ球蛋白以外的大部分血浆蛋白，如清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、多种凝血因子、抗凝因子、纤溶因子及各种转运蛋白等均在肝脏合成，当肝细胞受损严重时这些血浆蛋白质合成减少，尤其是清蛋白减少，导致低清蛋白血症。临床上可出现水肿，甚至出现腹水与胸水。γ球蛋白为免疫球蛋白，由B淋巴细胞及浆细胞产生。当肝脏受损，尤其是慢性炎症时，刺激单核一吞噬细胞系统，γ球蛋白生成增加。当患严重肝病时血浆纤维蛋白原、凝血酶原等凝血因子合成减少，临床上出现皮肤、黏膜出血倾向。体内氨基酸及核酸代谢产生的氨在肝脏内通过鸟氨酸循环合成尿素、经肾脏排出体外，从而维持血氨正常水平，当肝细胞严重损害时，尿素合成减少，血氨升高，临床上表现为肝性脑病。由于肝脏参与蛋白质的合成代谢与分解代谢，通过检测血浆蛋白含量及蛋白组分的相对含量（蛋白电泳）、凝血因子含量及血氨浓度，可了解肝细胞有无慢性损伤及其损害的严重程度。
（一）血清总蛋白和清蛋白、球蛋白比值测定 90％以上的血清总蛋白（serum total protein，STP）和全部的血清清蛋白（albumin，A）是由肝脏合成，因此血清总蛋白和清蛋白含量是反映肝脏合成功能的重要指标。清蛋白是正常人体血清中的主要蛋白质组分，肝脏每天大约合成120 mg／kg，半衰期19～21天，分子量为66 000，属于非急性时相蛋白，在维持血液胶体渗透压、体内代谢物质转运及营养等方面起着重要作用。总蛋白含量减去清蛋白含量，即为球蛋白（globulin，G）含量。球蛋白是多种蛋白质的混合物，其中包括含量较多的免疫球蛋白和补体、多种糖蛋白、金属结合蛋白、多种脂蛋白及酶类。球蛋白与机体免疫功能与血浆黏度密切相关。根据清蛋白与球蛋白的量，可计算出清蛋白与球蛋白的比值（A／G）。 【参考值】 血清总蛋白及清蛋白含量与性别无关，但和年龄相关，新生儿及婴幼儿稍低，60岁以后约降低2 g／L，血清清蛋白占总蛋白量至少达60％，球蛋白不超过40％。在分析血清蛋白检测结果时。应考虑以下因素可影响测定结果：激烈运动后数小时内血清总蛋白可增高4～8g／L；卧位比直立位时总蛋白浓度约低3～5 g／L；溶血标本中每存在l g／L的血红蛋白可引起总蛋白测定值约增加3％；含脂类较多的乳糜标本影响检测准确性，需进行预处理，以消除测定干扰。
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 摘要： 过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。 过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。 现报告如下： 一、实验器材 1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供） 2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电 热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱 二、实验方法 来 6g；按1： pH4.0）,
是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。 盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4倍肝重（0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解,离心（4℃, 4000rpm, 10min）,保留上清备用。 ●透析 是利用透析袋的半透过性，在一定透析条件下，使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。 透析法纯化过氧化氢酶：将上清液置于透析袋，透析两周（透析液：20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L氯化钠）中途更换一次透析液；透析后取出浊溶液，离心（4℃, 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液中,离心（4℃,4500rpm, 10min）收获上清，得到小鼠肝脏过氧化氢酶溶液。将收获的上清液（3组合并为一组）放入处理过的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩24小时后放冰箱保存， 制备过程中各阶段产物用比色测定法测定酶活，分析制备效率。分离纯化产物酶活性回收率用各步产物的酶活占匀浆上清液酶活的百分比来表示。 ●层析 是根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。 分别在280nm和407nm波长下测光吸收值，合并收集峰值重合管，得到纯化过的过氧化氢酶。 取出装柱好的层析柱，打开出口使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床面平齐时，沿柱口旋转加样，同时开始收集层析柱的流出液，每管收集约25滴，一次在407nm和280nm波长下，测定各管吸光度值。并绘制曲线。 2、过氧化氢酶的性质测定 制作标准蛋白的选择：选择与待测样品相同组成的蛋白质作为标准蛋白溶液。 标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯式定氮法准确测定其蛋白含量，再用无离子水配成0.1mg∕mL储存液。
过氧化氢酶产生菌的研究
过氧化氢酶产生菌的研究 摘要：过氧化氢酶一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。 关键字：过氧化氢酶发酵调控 过氧化氢酶简介 过氧化氢酶(Hydrogen peroxide oxidoreductase，catalase EC 1.11.1.6.) 是一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。研究表明几乎所有的需氧微生物中都存在过氧化氢酶，只有少数好氧菌如过氧化醋杆菌Acetobacter peroxydas 不存在过氧化氢酶。除谢氏丙酸杆菌Propionibacterium shermanji 和巨大脱硫弧菌Desulfovibrio gigas 等微生物外，绝大多数厌氧微生物体内不存在过氧化氢酶。根据过氧化氢酶在结构和序列水平上的异同将其划分为 3 个亚群，即单功能过氧化氢酶(Monofunctional catalase or Typicalcatalase)、双功能过氧化氢酶(Catalase-peroxidase) 和假过氧化氢酶(Pseudocatalase or Mn-catalasee)。大多数的过氧化氢酶由4 个相同的亚单位组成，分子量在240 kDa 左右，在亚基的活性部位各含一个血红素基团。来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有 4 个紧密结合的NADPH 分子。过氧化氢酶可被氰化合物、苯酚类、叠氮化物、过氧化氢、尿素及碱等物质所阻抑。过氧化氢酶主要集中存在于细胞的过氧化物酶体中，另外线粒体和细胞质中也含有少量的过氧化氢酶。过氧化氢酶能及时分解细胞内产生(主要为SOD 歧化产物) 或由胞外进入细胞的过氧化氢。避免了过氧化氢通过Fenton 和Harber-weiss 反应产生·OH。同时过氧化氢酶还能对血红蛋白及其他含巯基蛋白质起到保护作用，使它们不被氧化。人们研究过氧化氢酶的历史可追溯到100 多年前，早在1811 年就已发现动植物组织可以分解过氧化氢产生氧气，到1892 年Jacobson 证明了在动植物组织内有专一分解过氧化氢的酶，即过氧化氢酶的存在。1901 年Loew 第一次报道了过氧化氢酶的生物化学特性。到1937 年，Sumner 和Dounce 首次从牛的肝脏中分离得到过氧化氢酶的结晶，这是最早分离得到的高纯度酶之一。随后相继报道了哺乳动物的肝脏、红细胞及大多数微生物体内均含有此酶，其中哺乳动物组织中过氧化氢酶的含量差异很大，肝脏中含量最高，
肝硬化的实验室检查(一)
肝硬化的实验室检查(一) 肝硬化是各种肝病向肝硬化发展的共同途径，而肝纤维化的形成与肝脏胶原的代谢、胃泌素、激素类、蛋白类、酶类、血凝系统、脂类等代谢有着密切相关，现对肝硬化患者主要的实验室检查综述如下。1胃泌素水平的检测 近几年，肝硬化并发胃泌素血症已引起高度重视，而肝功能损害与血胃泌素水平的关系尚无明确定论，由于肝硬化时体内多种激素代谢可发生障碍，而胃泌素主要是由胃窦及十二指肠G细胞分泌的消化道多肽类激素，能扩张血管、刺激壁细胞分泌盐酸，有学者认为肝硬化患者存在高胃泌素血症。研究表明，肝硬化时患者血清胃泌素含量较正常人高，且含量随肝功能下降而递增，因此测定肝硬化病人血清胃泌素水平对判断肝脏损害有一定的价值。 2甲状腺素、性激素及促性腺素的检测 甲状腺素包括三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、反T3（γ-T3）的检测。性激素有卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成素（CH）、黄睾酮（T）、雌二醇（E）和泌乳素（PRL）。肝硬化患者T3、T4明显低于正常人，γ-T3呈增高；FSH、CH和PRL高于正常人，提示肝功能受损可能是导致肝硬化患者T4和性激素分泌异常的重要原因，γ-T3、T和PRL对判断肝纤维化程度有明显的意义。 3血清甘油三酯测定（TG） 由于肝脏参与了TG的合成与处理，肝硬化患者血清TG水平高低可反映肝硬化严重程度，有资料表明TG＜1.6mmol/L可作为肝硬化的诊断依据之一。 4血清蛋白类与层粘蛋白（LN）的检测 肝纤维化时白蛋白减少、球蛋白增高，目前在临床上常用来作为肝纤维化的诊断依据；另外LN的含量随肝病变程度为重而升高，尤以肝硬化明显。 5血清总胆汁酸与透明质酸的测定 国内外学者对肝硬化HA的研究表明，肝硬化时HA比慢活肝及正常人显著升高，认为HA 能很好地反映已生成的纤维程度，而血胆汁酸浓度与Childpugh分级有关，C＞B＞A，均认为血清TBA可作为肝硬化严重程度的判断指标〔1〕。 6血小板分析及血小板聚集功能的检测 血小板多以三项参数PLT、平均血小板体积（MPV）、血小板压积（PCT）为判断对象。有学者对肝硬化患者的血小板三项参数及聚集功能进行测定，发现在肝硬化患者中PLT、MPV、PCT明显降低，认为可作为衡量肝硬化出血的指标，亦可作为肝硬化程度的指标。 7血浆内皮素-1（ET-1）的检测 ET-1是一种在全身各组织广泛表达的血管收缩肽，肝脏合成ET-1部位主要在间质细胞及肠道上皮细胞，肝硬化患者血浆ET-1水平明显增高，且在肝功能Child分级中有C＞B＞A的规律。故认为肝硬化患者ET-1可反映肝硬化的严重程度。 8肿瘤坏死因子（TNF-α）的检测 肝硬化TNF-α水平明显增高且在肝功能Child分级中呈现C＞B＞A规律，也证实了TNF-α水平可反映肝硬化的严重程度。 9肝硬化时酶学的检测 肝纤维化的主要病理改变为细胞外基质产生过多和分解减少，致使肝组织中细胞外基质过度沉积在此过程中，参与此过程中的酶点也相应改变，通过对以下主要相关酶类的检测，对肝纤维化的诊断有价值。
实验报告-小鼠
姓名：薛桂凤学号： 实验报告（一） 一、实验目的： 1.掌握小鼠的抓取和固定。 2.掌握小鼠的编号与标记方法。 3.掌握小鼠的常用实验方法。 4.掌握小鼠的常用麻醉方法。 5.掌握小鼠的安死术。 6.掌握小鼠的釆血方法。 7.了解小鼠的采尿、粪的方法。 8.了解小鼠各种脏器标本的采集方法。 二、实验器材：ICR小鼠、电子称、手套、实验托盘、固定板、固定器、烧杯、注射器 （2支）、剪刀、镊子、灌胃针头、毛细管、酒精棉球、5%水合氯醛、生理盐水 三、实验内容 1.抓取：单手固定、双手固定、固定器、固定板。 2.称重：小鼠放在烧杯中称重（去除烧杯重量），记录小鼠体重20g。 3.编号：包括染色法及穿耳孔法。 4.给药：包括尾静脉给药（小鼠放入固定器，露出尾巴、准备好注射器；左手食指托 住尾巴，拇指配合，右手持注射器针尖轻轻抬起与血管平行刺入，轻推给药；血管由红变白后拔针、棉球按压）、皮下注射（俯卧固定，左手拇指和食指捏住皮肤提起，右手持针沿纵轴方向刺入皮肤，阻力消失后回抽无血注入药物，拔针）、皮内注射（俯卧固定，与皮肤平行刺入捏起的皮肤，阻力大，注射药物局部有皮丘后停留片刻后拔针）、腹腔注射（仰面固定，在腹正中线两侧腹股沟平行的位置30-45°进针，挑起皮肤和肌肉，回抽无血，注药）、灌胃（小鼠固定身体呈一条直线，灌胃枕头顺着上颚插入咽部，先少量注药证明未入气管后继续给药）、肌肉注射（）注射针刺入肌肉回抽无血给药。 5.釆血：尾尖釆血法、眼眶静脉丛釆血法、心脏釆血法。 6.麻醉：根据小鼠体重计算麻醉药物用量，水合氯醛，通过腹腔注射给药途径麻醉小 鼠，观察小鼠麻醉期。 7.安死术：颈椎脱臼法、过量麻醉法、空气栓塞法 8.解剖：观察小鼠的脏器解剖结构 四、总结 1.小鼠性情比较温顺，个体小，比较容易抓取固定。但是小鼠尾静脉血管较细，尾静 脉注射有一点难度，可以先酒精擦拭使血管扩张，遵循先远后近的原则会提高尾静脉注射的成功率。 2.通过此次试验，学习了关于实验动物小鼠的一些基本操作技术，对以后的科研实验 做了基本的准备。但还需克服心理的恐惧，多加练习，增加熟练程度。
实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
实验一小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定实验方案： （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液 一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用 二、实验原理： 1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞 匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3、氯仿; Pr沉淀剂，CA T由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4、离心：离心机分离固液 三、实验步骤： 1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g 2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）, 组织捣碎机匀浆3-5min 3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min 4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液 5、【留样】取匀浆上清液60ul，加入20ul4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5min，备SDS-PAGE 检测，-20℃冰箱保存。另取60ul匀浆后的上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。 （二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶
一、实验目的：掌握盐析与透析法的方法与原理 二、实验原理： 1、在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程 2、盐酸沉淀原理：中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而沉淀析出 3、透析:利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子 的一种分离纯化技术 三、实验步骤： 1、向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰冰浴搅拌状态 下浴搅拌1h； 2、将盐析溶液离心（4℃，6000rpm，10min）后弃上清液，保留沉淀； 3、用肝重4倍体积的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助 溶）10min，离心10（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，保留沉淀； 4、留样：取盐析后上清液样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检 测，-20℃冰箱保存。 5、将透析袋（截流量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用。 6、将上清液放入透析袋，（截流量10-20KD，直径2公分）内，置于透析液（20%乙 醇，0.1mol/L，pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/LNaCl溶液）中透析一周，中途更换一 次透析液； 7、一周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（4℃6000rpm，10min）后，弃上清，收集 沉淀； 8、用2ml~3ml的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH4.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器 助溶），离心（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。（测OD280，若 蛋白浓度小于1mg/ml） 9、留样：取透析后上清样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检测， -20℃冰箱保存。 10. 将透析袋置于沸水中煮沸15min，清洗晾凉后备用 11 .将收获的样品液放入处理后的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩两个小时将样 品浓缩至400-500ul收样，放置4℃ （三）凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶 一、实验目的： 二、实验原理： 三、实验步骤： 1、凝胶的处理：每组取2.5g sepadexG-200葡聚糖凝胶干粉，浸泡与蒸馏水充分膨胀倾 斜法除去表面的悬浮小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），继续浸泡一天 2、装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填上一层海绵垫。将层 析柱将垂直夹与铁架上，将层析柱下端额止水架夹紧，向柱中加入约5-7cm高的缓 冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱。当凝集颗粒沉 积约2cm高时，开启止水夹子使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高达35cm时为止。关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡，表面要平整。 3、平衡：打开层析柱口，控制流速为0.3-0.5mL／min（约5-10滴／min），用磷酸缓冲 液（0.1mol／L,pH7.8）流洗平衡20min。凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm 的
小鼠实验操作
小鼠实验操作 （一）、实验动物的选择原则 1、尽量选择与人体结构、机能、代谢及疾病特征相似的动物； 2、选用的实验动物的解剖、生理特点应符合实验目的； 3、根据人与实验动物对同一刺激的反应差异，选用具有明显反应的动物； 4、根据生物医学研究必须达到的精确度，选用结构功能简单又能反映研究指标的动物； 5、选用患有人类类似疾病的近交系或突变系动物； 6、选用与实验设计、技术条件、实验方法等相适应的标准化动物； 7、在不影响实验目的与结果的前提下，选择最易获得、最经济、便于操作管理的动物； 8、供实验用的动物应具备质量合格证。 （二）、常用实验动物的特点 1、小白鼠 是实验室最常用的一种动物。易于大量繁殖，且价廉，适用需要大量动物的实验，如药物筛选、半数致死量测定、药物效价比较、抗感染、抗肿瘤药物及避孕药物的研究等。 2、大白鼠 与小白鼠相似。一些在小白鼠身上不便进行的实验可选用大白鼠，如药物抗炎作用的实验常选用大白鼠踝关节制备关节炎的模型。此外，也可用大白鼠直接记录血压、作胆管插管，或用大白鼠观察药物的亚急性或慢性毒性。大白鼠的血压和人相近，且稳定，现常用于抗高血压药物实验。 3、豚鼠 是实验室常用动物之一。对组织胺很敏感，容易致敏，常用于平喘药和抗组胺药的实验。对结核菌亦敏感，故也用于抗结核药的研究。此外还用于离体心脏及平滑肌实验，其乳头肌和心房常用于电生理特性及心肌细胞动作电位实验，研究抗心律失常药物的机理。 （三）、实验动物选择的注意事项 由于动物对外界刺激的反应存在个体差异，在选择实验动物时，还应注意动物的年龄、体重、性别、生理状态、健康状况及其品系、等级等因素对实验的影响。 二、实验动物的性别鉴别与编号 （一）、实验动物的性别鉴别 药理学实验常用的动物中，较大的动物（如家兔、猫、犬等）可以从生殖器分辨其性别，而较小的动物（如小白鼠、大白鼠、豚鼠等）的性别鉴别，通常以肛门与生殖孔之间的距离来判断，距离近者为雌性，距离远者为雄性。 （二八实验动物的编号 药理实验中常用多只动物同时进行实验，为避免混乱应将动物进行编号。实验动物编号的目的在于将观察范围内的同种动物进行区别，以便于观察。常用的方法有染色法、耳缘剪孔法、烙印法和号牌法等，可根据实验目的、动物种类和具备的条件选用，一般编号应具有清晰易辨、简便耐久的特点。猫、犬、兔等较大的动物可用特别的号码牌固定于身上。小白鼠、大白鼠及白色家兔等用黄色苦味酸涂于动物不同部位进行染色标记而编号。例如在小白鼠，右前肢皮肤外侧涂色标记为1号，腹部右外侧皮肤涂色标记为2号，右后肢皮肤外侧涂色标记为3号，头部皮 肤涂色标记为4号，背部正中皮肤标记为5号，尾巴根部标记为6号，7、8、9号在左侧同1、2、3号，第10号不涂黄色。大白鼠的编号与小白鼠相同。 第二节实验动物的捉拿、给药和处死方法 （一）、小白鼠、大白鼠 1、捉拿法：小白鼠可采取双手法和单手法两种形式。 双手法：右手提起鼠尾，放在鼠笼盖或其他粗糙面上，向后方轻拉，小白鼠则将前肢固定于粗糙面上。此时迅速用左手拇指和食指捏住小白鼠颈背部皮肤（图1），并以小指与手掌尺侧夹持其尾根部，固定于手中。
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备及测定
实验：小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
1：《小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定》实验背景资料 过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。 小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。 2、 3. 实验目的 熟悉并掌握生化四大技术—离心、层析、比色、电泳。 熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。 4. 实验原理 匀浆原理： 分离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。根据上述原理选择0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中，分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。 盐析原理： 蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。通过向过氧化氢酶粗提液中加入适当浓度的中性盐,使过氧化氢酶呈盐析状态,而部分杂蛋白呈盐溶状态, 离心后过氧化氢酶主要存在于沉淀中，弃去上清收集沉淀，即可实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。 透析原理：采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/L NaCl溶液为透析液，对产物进行透析处理。在该透析条件下，过氧化氢酶溶解度变小，以沉淀形式析出，但不变性。透析过夜后离心，过氧化氢酶主要存在于沉淀中，但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。选择0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀，则过氧化氢酶溶解，而变性的杂蛋白不能溶解，从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。 层析原理： 凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种
常用肝脏化验指标的临床意义
常用肝脏生物化学试验的临床意义及评价共识 中华医学会肝病学分会，中华医学会消化病学分会 肝脏生化试验俗称肝功能试验，是判断有无肝损害、评估肝病严重程度、追踪肝病进展以及判断治疗效果和预后的重要临床检验指标。常用肝脏生化试验主要包括血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ谷氨酰转移酶(GGT)、胆红素(Bil)、白蛋白(Alb)和凝血酶原时间(PT)等项目。为帮助临床医生合理应用和正确解释常规肝脏生化试验，中华医学会肝病学分会和消化病学分会组织有关临床及检验专家，在广泛收集国内外有关资料的基础上进行认真讨论，形成了《常用肝脏生物化学试验的临床意义及评价共识》。 一、影响因素及注意事项 影响肝脏生物化学试验结果的因素诸多。在留取标本的过程中，受血液采集、贮藏方法及是否溶血的影响；在检测过程中，存在不同批次试剂和不同实验室之间的差异；在不同个体存在性别、年龄及人体质量指数等因素的差异；在同一个体存在检测时间及是否进行剧烈运动等生理或病理学因素的影响。因此，对于无明显临床症状而仅有肝脏生物化学试验结果轻度异常者，通常不能仅凭1次检测结果就作出诊断或急于进一步作各种检查。临床医师应全面采集患者的相关临床信息，并与实验室技师充分沟通，以作出恰当的评价。 为保证实验室检测结果的准确性和可靠性，必须对检验的全过程进行质量控制。应制定各种管理性、技术性规范和标准操作程序，建立完善的肝脏生物化学试验质量检验保证体系，确保实验室和相关临床科室之间、不同实验室之间的无缝衔接，从而控制可能出现的各种误差甚至差错。 临床科室应认真填写检验申请单，嘱咐患者按要求做好准备，并严格按照操作规程采集、运送和储存标本。检验科应定期进行系统校正(包括仪器、试剂及分析方法等)、质量控制，建立合适的参考区间，对检测结果进行仔细审核后及时发送报告。 在实际工作中，建议特别注意以下问题： 1．肝脏生物化学试验检测标本宜在早晨空腹时采集，待测时间一般≤3 d。 2．应加强检测质量控制，以保证实验检测的总分析误差不超过正常值上限(ULN)的10％～20％。 3．宜分别设立成年男性和女性的肝脏生物化学试验正常值范围。对儿童及60岁以上人群的肝脏生物化学试验正常值范围也最好有所区别。 4．所有异常肝脏生物化学试验结果均必须结合临床表现进行解释。 5．对于偶然发现的或在剧烈活动后出现的肝脏生物化学试验结果异常，应适时重复检测。 6．当仅有单项肝脏生物化学试验指标轻度异常或高度怀疑实验室检查有误时，应及时重复检测。 7．当有2项以上肝脏生物化学试验检测指标出现异常，或某项指标反复或持续异常时，患肝病可能性很大。 二、临床意义及其评价要点 (一)血清转氨酶：血清转氨酶主要包括ALT和AST。ALT广泛存在于组织细胞内，以肝细胞含量最多，其次为心肌、脑和肾组织。组织中ALT位于细胞质，其肝内浓度是血清中浓度的3000倍，血清半衰期为(47±10)h，是反映肝细胞损害的敏感指标。AST主要分布于心肌，其次为肝脏、骨骼肌和肾脏等组织，存在于细胞质和线粒体，其中线粒体型AST 活性占肝脏AST总活性的80％左右。正常成人血清AST／ALT比值约为0.8。心肌梗死和
动物实验技术教材
动物实验技术 第六章动物实验基本操作技术 第一节、实验动物的抓取与固定 一、小鼠的抓取与固定 ?抓取方法：用右手拇指和食指捏住尾部中段提起，如果只想移动小鼠，就用两手把它捧起来。 ?手固定法：将右手捏起的小鼠放在笼盖上，用右手捏其尾部中段，在小鼠向前爬的一瞬间， 用左手的拇指和食指捏住颈背部皮肤，再翻转左手，将小鼠置于左手掌心中，右手拉住小鼠尾部，再用左手小指和无名指压住小鼠尾根部使小鼠整个呈一条直线。固定时注意，过分用力会使小鼠颈椎脱臼，若用力过轻头部能反转过来咬伤实验者的手。这种固定方法是灌胃给药和腹腔注射给药常用的方法。 ?手术固定法：用乙醚等麻醉药品麻醉后，用长20~30cm的线绳分别系在四肢上，再把四肢 的线绳分别系在固定板四角的钉子上，并且在头部上颚切齿的地方牵一根线绳达到完全固定。 ?在静脉给药时，先根据小鼠的大小选择合适的固定器，打开鼠筒盖，把小鼠放在里面，只露出尾巴；或者用倒放的烧杯将鼠扣住，只露出尾巴并压住。 二、大鼠的抓取与固定 ?抓取方法：4~5周龄以内的大鼠同小鼠；周龄较大的大鼠其尾部皮肤容易被剥脱，所以用左手从背部中央到胸部捏起来抓住。抓取时最好带防护手套，但手套不宜过厚。 ?手固定法：同小鼠。 ?手术固定法：同小鼠。 ?静脉给药或采血时同小鼠。
三、豚鼠的抓取与固定 ?抓取方法：抓取幼小豚鼠时，用手捧起来；成熟的大豚鼠，用手大把抓起胸肋部即可。注意不能粗野，更不能抓取腰腹部，这样容易造成肝破裂而死亡。 ?手固定法：⑴将左手的食指和中指放在豚鼠颈背部两侧，拇指和无名指放在肋部，分别用 手指夹住左右前肢抓起来。⑵反转左手，用右手的拇指和食指夹住右后肢，用中指和无名指夹住左后肢是豚鼠整体伸直成一条直线。⑶一个人固定操作时，坐在椅子上，用右手拿着豚鼠的后肢夹在两腿之间，用大腿代替右手夹住。 ?手术固定法：同大、小鼠。 四、家兔的抓取与固定 ?抓取方法：用一只手大把抓住颈背部皮肤提起来，另一只手托住其臀部，让其重心落在托其臀部的手上，运送时，还要抓住颈肩部皮肤抱着兔子运送。 ?手固定法：在灌胃给药时，人坐在椅子上，用一只手抓住颈背部皮肤，另一只手抓住两后 肢放在两腿之间，大腿夹住兔子的下半身，用空着的手抓住两前肢固定之，抓住颈背部的手同时捏着两只耳朵，不让头部转动。 ?固定器固定法：耳静脉给药或采血时用盒式固定法；从颈动脉采血或手术实验时用台式固定法。 ?盒式固定法：把兔子放在盒子里，只露出头部，用转扭拧固定器固定家兔。 ?台式固定法：将麻醉的兔子仰卧，用纱布条依次将四肢捆绑固定于固定台的两侧，然后把头部放在金属制的首伽和咀环上固定。
肝脏疾病实验室检查
肝脏疾病的实验室检查 一、肝脏的基本功能 (一)肝脏的代谢功能 1. 蛋白质代谢：全部清蛋白、部分球蛋白、多种凝血因子由肝细胞合成。 2.糖代谢：肝脏能使血糖浓度保持恒定。餐后血糖>8.25mmol／L时，肝细胞摄取葡萄糖，合成肝糖原贮存起来；空腹时，血糖< 3.9mmol／L，肝糖原分解生成葡萄糖补充血糖，肝脏还能将非糖物质转化为糖原或葡萄糖，参与血糖调节。肝脏又是葡萄糖氧化产生能量的主要场所。 4.脂肪代谢： 在脂类的消化、吸收、分解、合成及运输等代谢过程中均起重要作用。肝脏分泌的胆汁促进脂肪乳化及脂类的消化吸收，利用脂肪酸、糖及某些氨基酸合成脂肪、胆固醇及磷脂。5.维生素及激素代谢：如脂溶性维生素的吸收必须有肝脏分泌的胆汁酸盐参加，激素的灭活主要在肝脏中进行。肝脏还参与胆红素、铁、铜及其他金属的代谢等。 (二)肝脏的生物转化作用：物质代谢中产生的生物活性物质、代谢终末产物及进入体内的各种异物、毒物或从肠道吸收来的非营养物质，在肝脏内通过氧化、还原、水解、结合等进行生物转化。也称为解毒作用。 (三)肝脏的分泌与排泄功能：肝细胞分泌胆汁，肝内代谢产物以及药物、解毒产物可以随胆汁分泌而排入肠腔，随粪便排出体外。 二、血清蛋白质的检查： 蛋白 (一)血清总蛋白、清蛋白、球蛋白比值 白蛋白定义：见课件，球蛋白定义：见课件。（球蛋白不是肝脏合成的） 白蛋白在肝脏内制造，肝功能受损严重时白蛋白减少，降低程度与肝炎的严重程度相平行。临床意义： 总蛋白 1.总蛋白增高： (1)球蛋白增高的临床情况； (2)血液浓缩，如各种原因引起的严重脱水； 2.血清总蛋白降低：主要是由于白蛋白降低所致，见于白蛋白降低的临床情况。 白蛋白： 1.白蛋白增高： 临床上不会出现血清白蛋白浓度的绝对值增多。血清白蛋白增高主要见于血液浓缩。 2.白蛋白降低： （1）合成障碍：见于慢性肝脏疾病，慢性肝炎、肝硬化及肝癌等。 （2）营养不良：蛋白质摄入不足或消化功不良。 （3）丢失过多：如肾病综合征（大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿、高脂血症）、严重烧伤及大出血等。 （4）消耗太大：常见于慢性消耗性疾病，如重症结核、甲亢及恶性肿瘤等。 （5) 血清水分增加：如水钠潴留或静脉补充过多的晶体溶液（稀释性的相对性减少）。 3.白蛋白变化的意义 A的高低与肝细胞数量呈正相关；A的体内半衰期约为21天, ；急性肝炎时A急性肝炎时A无明显变化A<25g/L 以下, 腹水产生（维持胶体渗透压的白蛋白减低，水从血浆移至腹腔）.；A在治疗后回升为病情好转指征；A逐渐下降提示临床预后不良 球蛋白 1球蛋白增高： （1）严重肝脏疾病，如慢性活动性肝炎、肝硬化等。 （2）自身免疫性疾病有免疫功能亢进，如风湿热、系统性红斑狼疮； （3）恶性肿瘤，多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病等； （4）慢性感染使免疫反应增强，结核病、血吸虫病等。 2.球蛋白降低： （1）生理性减少：见于3岁以下的婴幼儿。 （2）免疫功能抑制：长期使用皮质激素或其它免疫抑制剂治疗。