生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程(1)
生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程
本规程适用于人用生物制品生产/检定用动物细胞基质，包括具有细胞库体系的细胞及原代细胞。细胞基质系指可用于生物制品生产/检定的所有动物或人源的连续传代细胞系、二倍体细胞株及原代细胞。
生产非重组制品所用的细胞基质，系指来源于未经修饰的用于制备其主细胞库的细胞系/株和原代细胞。生产重组制品的细胞基质，系指含所需序列的、从单个前体细胞克隆的转染细胞。生产的细胞基质，系指通过亲本骨髓瘤细胞系与另一亲本细胞融合的杂交瘤细胞系。
一、对生产用细胞库细胞基质总的要求
用于生物制品生产的细胞系/株均须通过全面检定，须具有如下相应资料，并经国务院药品监督管理部门批准。
（一）细胞系/株历史资料的要求
1.细胞系/株来源资料
应具有细胞系/株来源的相关资料，如细胞系/株制备机构的名称，细胞系/株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。这些资料最好从细胞来源实验室获得，也可引用正式发表文献。
人源细胞系/株须具有细胞系/株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及生理状况的相关资料。
动物来源的细胞系/株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、病原体检测结果及供体的一般生理状况的相关资料。如采用已建株的细胞系/株，应从具有一定资质的细胞保藏中心获取细胞，且应提供该细胞在保藏中心的详细传代过程，包括培养过程中所使用的原材料的相关信息，具有细胞来源的证明资料。
2．细胞系/株培养历史的资料
应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系/株过程的相关资料，包括所使用的物理、化学或生物学手段，是否有外源添加序列，以及细胞生长特征、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择方法等。同时还应具有细胞鉴别、检定、内源及外源因子检查结果的相关资料。
应提供细胞培养液的详细成分，如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物学活性的物质，应具有这些成分的来源、制备方法及质量控制、检测结果和质量保证的相关资料。
（二）细胞库的建立
细胞库的建立可为生物制品的生产提供已标定好的、细胞质量相同的、能持续稳定传代的细胞种子。
1．原材料的选择
建立细胞库的各种类型细胞的供体均应符合本规程‘细胞的检定’中相关规定。神经系统来源的细胞不得用于生物制品生产。
细胞培养液中不得使用人血清，如需使用人血白蛋白，则须使用有批准文号的合格制品。
消化细胞用胰蛋白酶应进行检测，证明其无细菌、真菌、支原体或病毒污染。特别应检测胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒，如细小病毒等。
用于生物制品生产的培养物中不得使用青霉素或β-内酰胺(β-Lactam)类抗生素。配制各种溶液的化学药品应符合《中国药典》（二部）或其他相关国家标准的要求。
2．细胞操作的环境要求
细胞培养的操作应符合中国《药品生产质量管理规范》的要求。生产人员应定期检查身体。在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作；在同一工作日进行细胞操作前，不得操作或接触有感染性的微生物或动物。
3．建立细胞库
细胞库为三级管理，即原始细胞库、主细胞库及工作细胞库。如为引进的细胞，可采用主细胞库和工作细胞库组成的二级细胞库管理。在某些特殊情况下，也可使用MCB一级库，但须得到国务院药品监督管理部门的批准。
（1）原始细胞库(PCB)
由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养而形成的均一细胞群体，通过检定证明适用于生物制品生产或检定。在特定条件下，将一定数量、成分均一的细胞悬液，定量均匀分装于安瓿，于液氮或-130℃以下冻存，即为原始细胞库，供建立主细胞库用。
（2）主细胞库(MCB)
取原始细胞库细胞，通过一定方式进行传代、增殖后均匀混合成一批，定量分装，保存于液氮或-130℃以下。这些细胞必须按其特定的质控要求进行全面检定，应合格。主细胞库用于工作细胞的制备，每个生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。
（3）工作细胞库(WCB)
工作细胞库的细胞由MCB细胞传代扩增制成。由MCB的细胞经传代增殖，达到一定代次水平的细胞，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或-130℃以下备用，即为工作细胞库。每个生产企业的工作细胞库必须限定为一个细胞代次。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制品。复苏后细胞的传代的水平应不超过批准的该细胞用于生产限制最高限定代次。所制备的WCB必须经检定合格（见本规程‘细胞检定’中有关规定）后，方可用于生产。
4．细胞库的管理
每种细胞库均应分别建立台帐，记录放置位置、容器编号、分装及冻存数量，取用记录等。细胞库中的每支细胞安瓿或细胞冻存管均应注明细胞系/株名、代次、批号、编号、冻存日期，储存容器的编号等。
冻存前细胞活力应在90%以上，复苏后细胞存活率应不低于85%。冻存后的
细胞，应至少作一次复苏培养并连续传代至衰老期，检查不同传代水平的细胞生长情况。
主细胞库和工作细胞库分别存放。非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。
（三）细胞检定
细胞检定主要包括以下几个方面：细胞鉴别、外源因子和内源因子的检查、致瘤性检查等。必要时还须进行细胞染色体核型检查。这些检测内容对于MCB 细胞和WCB细胞及生产限定代次细胞均适用。
细胞检定的基本要求见下表1。细胞库建立后应至少对MCB细胞及生产终末细胞进行一次全面检定。每次从MCB建立一个新的WCB，均应按规定项目进行检定。
表1、细胞检定项目要求
*生产终末细胞:是指按生产规模制备的终末代次细胞。
1．细胞鉴别试验
新建细胞系/株、细胞库(MCB和WCB)和生产终末细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞，无其他细胞的交叉污染。细胞鉴别试验方法有多种，包括细胞形态、生物化学法(如同工酶试验)、免疫学检测(如HLA、种特异性抗血清)、细胞遗传学检测(如染色体核型、标记染色体检测)、遗传标志检测(如DNA指纹图谱、STR 图谱、基因组二核苷重复序列 )等。
可选其中一种或几种方法，但均须经国家药品检定机构认可。细胞表型特征与遗传学特征相结合来判断，更有利于细胞鉴别。
2．无菌检查
取混合细胞培养上清液样品，依法检查，应符合要求（附录XII A）。
3．支原体检查
取细胞培养上清液样品，依法检查，应符合要求（附录XII B进行），应为阴性。
4．细胞内、外源病毒因子检查
应注意检查细胞系/株中是否有来源物种中潜在的可传染的病毒，以及由于操作带入的外源性病毒。细胞进行病毒检查的种类及方法，须根据细胞的种属来源、组织来源及细胞特性决定。
（1）细胞形态观察及血吸附试验
取混合瓶细胞样品，接种至少6个细胞培养瓶或培养皿，待细胞长成单层后换维持液，持续培养两周。如有必要,可以适当换液。每日镜检细胞，细胞应保持正常形态特征。
如为贴壁细胞或半贴壁细胞，细胞至少培养14天后，分别取1/3细胞培养瓶或培养皿，用0.2%~0.5% 豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。加入红细胞后置2~8℃ 30分钟，然后置20~25℃ 30分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况，结果应红细胞吸附应为阴性。
新鲜红细胞在2~8℃保存不得超过7天, 且溶液中不应含有钙或镁离子。
（2）不同细胞传代培养法检测病毒因子
将待检细胞分别接种下列三种单层细胞，包括猴源细胞、人源二倍体细胞和同种属同组织类型来源的细胞。每种单层细胞接种至少107个含有原细胞培养上清液的活细胞悬液或细胞裂解物，每种细胞至少接种2瓶。接种供试品量应占维持液的1/4以上，培养至少14天。试验应设立病毒阳性对照，包括可观察细胞病变的病毒阳性对照、血凝阳性对照及血吸附阳性对照。如细胞裂解物对单层细胞有干扰，则应排除干扰因素。
在培养第7天时，分别取每种接种的单层细胞上清液各一瓶，分别接种于新鲜制备的相应的单层细胞上，继续培养7天，观察细胞病变并进行细胞形态观察及血吸附试验。每种接种的单层细胞不得出现细胞病变，血吸附试验应均为阴性。
若待检细胞已知可支持人巨细胞病毒(CMV)的生长，则应在接种人二倍体细胞后至少观察28天，应无细胞病变。同时，应进行血吸附试验,应为阴性。
（3）接种动物和鸡胚法检测病毒因子
MCB或WCB细胞、增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次的细胞须采用动物体内接种法进行外源病毒因子检测。选用乳鼠、成鼠和鸡胚(两组不同日龄)共计4组，按表2所列方法进行试验和观察。接种细胞后，任何动物出现异常或疾病均应进行原因分析。观察到期时，应至少有80%以上接种动物或鸡胚健存，视为试验有效。接种动物未显示有外源病毒感染，则细胞判定为合格。
表 2 动物体内接种法检测外源病毒因子
动物组要求数量接种途
径
细胞浓度
(个活细胞
/ml)
接种细胞液
量(ml/
只)
观察
天数
结果判定
乳鼠 24小时内10(2窝) 脑内
腹腔＞1x1070.01
0.1
21 应健存
成鼠15~20g 10 脑内
腹腔＞1x 1070.03
0.5
21 应健存
鸡胚* 9~11日龄10 尿囊腔＞1x 1070.2 3~4 尿液血凝
试验阴性鸡胚5~6日龄10 卵黄囊＞1x 1070.5 5 应存活
豚鼠 350~500g 5 腹腔＞1x 107 5.0 42 应健存，
解剖无结核病
变
家兔 1.5~2.5kg 5 皮下
皮内** ＞1x 1079.0
0.1X10
21 无异常，健存
* 经尿囊腔接种的鸡胚，在观察末期，应用豚鼠和鸡红细胞混合悬液进行直接红细胞凝集试验。
**每只家兔于皮内注射10处每处0.1ml
对于新建细胞系/株，还应接种豚鼠和家兔（见表1）。豚鼠主要用于检查细胞内结核分支杆菌，在注射前观察4周，结核菌素试验为阴性者方可用于试验。家兔主要用于检测猴来源细胞中是否存在B病毒污染，也可用兔肾细胞培养法代替。
（4）逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测
可采用下列方法对MCB或WCB细胞、增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次的细胞进行逆转录病毒的检测。
①逆转录酶活性测定：采用敏感的方法,如产品增强的逆转录酶活性测定法(PERT)法或其他灵敏度相当的检测逆转录酶的方法检测细胞培养液上清中逆转录酶活性。
②透射电镜检查：收集待检细胞，低速离心后，弃上清，沉淀中应含有1×107个细胞，且细胞存活率应不低于99%。在沉淀中加入固定剂，于4℃保存或直接包埋后制备超薄切片，置于铜网上染色后透射电镜观察。
③感染性试验：将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞，培养后检测。根据待检细胞的种属来源，须使用不同的敏感细胞进行感染性试验。
这三种方法具有不同的检测特性及灵敏度，因此应采用不同的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性时，建议进行透射电镜检查及感染性试验，以确证是否有感染性逆转录病毒颗粒存在。
小鼠来源和其他啮齿类来源的细胞系或其杂交瘤细胞系有可能携带潜在的逆转录病毒。因此，对于人-鼠杂交瘤细胞系则应进行特异性逆转录病毒检测。如用于单克隆抗体生产的小鼠细胞系，则可不检测特异性的逆转录病毒，但在生产工艺中应增加病毒灭活程序。
（5）特殊外源病毒因子的检测
应对MCB或WCB的细胞进行特殊病毒的检测。检测病毒的种类应根据细胞系/株种属、组织来源等确定。
如鼠源的细胞系，可采用小鼠、大鼠和仓鼠抗体产生试验检测其种特异病毒。
人源的细胞系/株，则应检测如人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些情况下，也可能进行转化病毒的
检测，如人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒。这些病毒的检测可采用适当的体外检测技术。
5致瘤性检查
某些传代细胞系已证明具有致瘤性，如来源于啮齿类的细胞系BHK21，CHO，C127细胞等，或细胞类型属致瘤性细胞，如杂交瘤细胞，则可不必作致瘤性检查。
某些传代细胞系已证明在一定代次内不具有致癌性，而超过某代次则具有致瘤性，如VERO细胞，则必须进行致瘤性检查。
人上皮细胞系、人二倍体细胞株及所有用于活病毒疫苗生产的细胞系/株应进行致瘤性检查。另外，新建细胞系/ 株必须进行致瘤性检查。
在某些情况下，用于人体细胞治疗及基因治疗的细胞也须进行致瘤性检查。
将MCB或WCB的细胞增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次，再进行致瘤性试验。”
下述两种致癌性试验方法可任选其一：
①裸鼠至少10只，将细胞悬浮于适量无血清培养基中，使细胞浓度为5×107个细胞/ml，每只裸鼠皮下或肌内注射0.2ml；同时用Hela或Hep-2细胞设立阳性对照，阳性对照组至少10只，每只注射0.2ml含106个细胞；可用人二倍体细胞株作为阴性对照，阴性对照组至少10只，每只注射0.2ml含1067个细胞。
②新生小鼠(3~5日龄)，8~10g小鼠10只，在出生后第0天、2天、7天和第14天，分别用0.1ml抗胸腺血清(ATS)或球蛋白处理，然后同上每只皮下接种107活细胞。并设立阳性对照组，对照组至少接种10只。
结果判定：
①定期观察并触摸注射部位有无结节形成，且形成的任何结节均应进行双向
测量并记录。
②阳性对照组应至少有9只有进行性肿瘤生长时，试验视为有效。
③如试验组动物有进行性生长的结节或可疑病灶，应观察至少1~2周；若出
现的结节在观察期内开始消退，则应在结节完全消退前，处死动物并进行解剖作病理及组织学检查。
④未发生结节的动物半数应观察21天，剖检，另外半数动物应观察12周，进行病理检查，剖检接种部位，观察各淋巴结和各器官有无结节形成，如有怀疑，进行病理组织检查，不应有转移瘤形成。
除上述体内法外，也可采用软琼脂克隆形成试验或器官培养试验等体外法检测，特别适用于在低代次时在动物体内无致瘤性的传代细胞系。
（四）生产用细胞培养
生产用原材料的选择和细胞操作环境应符合本规程‘细胞库的建立’中有关规定。
从冻存的WCB中取出一支或多支安瓿，混合后培养，传至一定代次后供生产
用。其代次不得超过该细胞用于生产的最高限定代次。生产用细胞的最高限定代次应根据研究结果确定，但不得超过国际认可的最高限定代次。从WCB取出的细胞种子增殖的细胞不得再回冻保存后而再用于生产。
体外培养细胞龄的计算
二倍体细胞龄以细胞群体倍增（Population Doubling）计算，以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代，即一瓶细胞传二瓶(1:2分种率)，再长满瓶为一世代；一瓶传四瓶(1:4)为二世代；一瓶传八瓶(1:8)则为三世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前2/3内。
传代细胞系则以一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代。
二、连续传代细胞系的特殊要求
传代细胞系一般是由人或动物肿瘤组织或正常组织传代或转化而来，可悬浮培养或采用载体培养，能大规模生产。这些细胞可无限传代，但到一定代次后，致瘤性会增强。所以对生产用传代细胞系应进行严格检查。应按本规程‘细胞的检定’的规定进行细胞库的检查。对生产过程中细胞培养的要求如下：1．用于生产的细胞代次
用于生产的传代细胞系，生产代次应有一定限制。用于生物制品生产的细胞最高限定代次，须经批准。
2．生产过程中细胞培养物检查：
对于病毒类制品，在生产末期，应按照本规程中的三.6（2）、（3）、（4）和（5）对生产对照用细胞进行检查，并合格。对于在不同时间收集合并的培养物，应在每次收集时检测对照细胞培养物。
三、人二倍体细胞株的特殊要求
新建的人二倍体细胞必须具有以下资料：建立细胞株所用胎儿的胎龄和性别、终止妊娠的原因、所用胎儿父母的年龄、职业及健康良好的证明（医师出具的健康状态良好、无潜在性传染病和遗传性疾患等证明），以及胎儿父系及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史的书面调查资料。
人二倍体细胞株应在传代过程的早期，选择适当世代水平（2-8世代）增殖出大量细胞，定量分装后，置液氮中或–130℃下冻存，供建立PCB之用，待全部检定合格后，即可正式定为PCB，供制备MCB用。
1．染色体检查及判定标准
新建人二倍体细胞株及其细胞库必须进行染色体检查。对于已建株的人二倍体细胞株，如WI-38、MRC-5、2BS，KMB17等，在建立MCB时可不必进行细胞染色体检查。但如对细胞进行了遗传修饰，则须按新建细胞株进行染色体检查。
（1）染色体检查
新细胞建株过程中，每8~12世代应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有4次染色体检查结果。
每次染色体检查，应至少随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、
形态和结构检查，并作记录以备复查。其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析，并应粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。
每次染色体检查，应从同一世代的不同培养瓶中取细胞，混合后进行再培养，制备染色体标本片。染色体片应长期保存，以备复查。
可用G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。
（2）判定标准
对1000个和500个中期细胞标本异常率进行检查，合格的上限(可信限90% Poison法)如表2。
表2 人二倍体细胞染色体分析标准
检查细胞数
异常1000 500 100
47 26 8
染色单体和染色体
断裂
结构异常17 10 2
超二倍体8 5 2
亚二倍体* 180 90 18
多倍体** 30 17 4 * 亚二倍体如超过上限，可能因制片过程人为地丢失染色体，应选同批号标本重新计数。
** 一个中期细胞内超过53条染色体即为一个多倍体。
2 无菌检查
每8~12世代细胞培养物，应进行无菌检查，依法检查，应符合规定（附录XII A）。
3 支原体检查
每8~12世代细胞培养物，应进行支原体检查，依法检查，应符合规定（附录XII B）。
4 病毒检查
二倍体细胞株传代过程中，至少对2个不同世代水平进行病毒包含体、乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒，艾滋病病毒进行检查等，结果应均为阴性。
5 致瘤性检查
每8~12世代应作一次致瘤性检查，（方法见本规程‘致瘤性检查’），结果应无致癌性。
6生产过程细胞培养检查
（1）染色体检查
可根据制品特性及生产工艺，确定是否进行生产过程中细胞培养的染色体检查。通常含有活细胞的制品或下游纯化工艺不足的制品，应对所用细胞培养进
行染色体检查及评价。（见本规程“染色体检查及判定标准”）但如采用已建株的人二倍体细胞生产，则不要求进行染色体核型检查。
（2）细胞鉴别试验
按本规程“细胞检定”中细胞鉴别试验进行。对于每个制品生产用细胞每年应至少进行一次该项检定。
（3）无菌检查
依法检查，应符合规定（附录XII A）。
（4）支原体检查
依法检查，应符合规定（附录XII B）。
（5）正常细胞外源病毒因子检测
制备病毒类制品时，于接种病毒的当天或在连续传代的最后一次接种病毒时，留取此批细胞的5%(或不少于500ml)的细胞不接种病毒，换维持液作为正常细胞对照。与接种病毒的细胞在相同条件下培养，并按附录ⅫC生产用细胞外源因子检查项进行检测。
四、重组细胞的特殊要求
重组细胞系通过DNA重组技术获得的含有特定基因序列的细胞系，因此重组细胞系的建立应具有细胞基质构建方法的相关资料，如细胞融合、转染、筛选、集落分离、克隆、基因扩增及培养条件或培养液的适应性等方面的资料。细胞库细胞的检查应按本规程‘细胞的检定’的规定进行，但还应进行下述检查：
1 细胞基质的稳定性
生产者须具有该细胞用于生产的目的基因的稳定性资料，包括：重组细胞的遗传稳定性、目的基因表达稳定性、目的产品持续生产的稳定性，以及一定条件下保存时细胞生产目的产品能力的稳定性等资料。
2 鉴别试验
除按本规程“细胞鉴别试验”进行外，还应通过检测目的蛋白基因或蛋白进行鉴别试验。
3 重组细胞产物的外源病毒因子检测
应按本规程“细胞形态观察及红细胞吸附试验”和“不同细胞传代培养法检病毒因子”的要求对细胞裂解物或收获液及生产用培养基进行外源病毒因子的检测。
五、原代细胞的要求
原代细胞应来源于健康的动物脏器组织或胚胎，包括猴肾、地鼠肾、沙鼠肾、家兔肾、狗肾或动物的胎儿和其他组织以及鸡胚和鹌鹑胚等正常组织，以适当的消化液消化、分散组织细胞进行培养，原代细胞不能建立细胞库，只能限于原始培养的细胞或传代少数几代内（一般1-5代内）使用，无法事先标定。因此，只能严格规范管理和操作措施，以保证以原代细胞为基质所生产的制品质量。
（一）动物组织来源和其他材料
1．动物组织来源
应符合“凡例”的有关要求。对各种动物都应有明确健康状况和洁净级别要求。
2．生产或检定用猴
多采用非洲绿猴、恒河猴等，我国以恒河猴为主。应为正常健康猴，以笼养或小群混养。动物用于制备细胞前，应有6周以上的检疫期，检疫期中出现病猴或混入新猴，应重新检疫。从外面新引入猴群应作结核菌素试验及猴疱疹I型病毒(B病毒)的检查。
胎猴肾可用于生产，对其母猴应进行检疫。
（二）原代细胞培养物的检查
用于细胞制备的动物剖检应正常，取留的器官组织亦应正常，如有异常，不能用于制备细胞。
1．细胞培养原材料检查及细胞培养操作按本规程“原材料的选择”及“细胞培养操作的环境要求”进行。
2．细胞培养物的检查
（1）细胞形态检查
细胞在接种病毒或用于生产前，其培养物均应进行外观检查和镜检，应无任何可疑、异常和病变，否则不得用于生产。
（2）对照细胞检查
每批消化所得原代细胞留取5% (或至少500ml)悬液，不接种病毒，细胞浓度和处理均与生产制品过程相同，至少观察14天，并作下列各项检查，结果均应为阴性。
①无菌检查
依法检查，应符合规定（附录XII A）。
②支原体检查
依法检查，应符合规定（附录XII B）。
③外源病毒污染的检查
对观察到期的细胞，按本规程4（1）项“细胞形态观察及血吸附试验”和4（2）项“不同细胞传代培养法检测病毒因子”项进行外源病毒污染检测。
④原代细胞培养物特定病毒检查
原代猴肾细胞培养应检查SV40病毒、猴艾滋病毒和B病毒。应用Vero或原代绿猴肾细胞、兔肾细胞检查。地鼠肾原代细胞应用BHK21细胞培养检查，观察细胞形态，如有可疑应在同种细胞上盲传一代继续观察。
六、检定用细胞的要求
检定用细胞是指生物制品制造过程中用于检定的细胞，包括原代细胞、连续传代细胞或二倍体细胞，以及经特定基因修饰过的细胞。检定用细胞的质量对检定结果的判定具有重要的影响，因此，为保证检定结果的有效性、可靠性及真实
性，国家药品检定检定机构和生物制品生产企业检定部门所用的检定用细胞应符合下列要求：
（一）细胞资料
1、检定用细胞应具有明确的合法来源，及相关的来源证明资料。
2、如使用传代细胞系/株，应建立细胞库体系，即主细胞库及工作细胞库，
如细胞使用量较少，可建立单一细胞库。各制品应根据其特性以及保证检测结果的可靠性基础上，在该细胞允许的最高限定代次内，规定相应检定用细胞的代次范围（应在确定细胞代次的±1代范围内）。检定时从工作细胞库复苏细胞后，不能再回冻。
3、应详细记录检定用细胞建库的过程，包括细胞培养所用原材料的来源、批
号，细胞生长液的配制方法、使用浓度等，记录细胞的传代及冻存过程，并建立细胞冻存及使用台账。
（二）细胞检定
生物制品检定用细胞应至少进行以下1-3项检定，根据检定用细胞用途的不同，还应按照4项下的有关要求进行相关的检定。
1、细胞鉴别试验
按本规程一（三）1项进行，或其他相适应的方法，应确认为本细胞而无其他细胞的交叉污染。
2、无菌检查
依法检查，应符合要求（附录XII A）。
3、支原体检测
依法检查，应符合要求（附录XII B）。
4. 外源病毒污染检查
用于待检样品外源病毒污染检查所用的细胞，应采用本规程一（三）4（2）项及4（3）项鸡胚接种检查，应无外源病毒污染。
5、其他检测：
（1）致瘤性检查：
对于待检样品致瘤性检查时所用的阳性对照细胞，应采用本规程一（三）5项进行检查，应具有致瘤性。
（2）病毒敏感性检查：
用于活病毒类待检样品病毒效价测定的检定用细胞，应进行此项检查，证明所用细胞具有足够的相应病毒敏感性。
（3）细胞功能检查：
用于待检样品生物学活性、效力或效价测定的检定用细胞，应进行此项检查，证明所用细胞能够有效评价待检样品质量。
附录逆转录酶活性检查法
附录IX M 逆转录酶活性检查法
本法系以雀麦草花叶病毒RNA为模板，采用RT-PCR法扩增特定片段并用ELISA法检测特异片段与探针的杂交信号，从而测定供试品中的逆转录酶活性。
试剂
(1)供试品稀释液(A液)
每1L A液含三羟甲基氨基甲烷－盐酸（Tris-HCl,pH7.5）25mmol,氯化钾50mmol, 二硫苏糖醇(DTT) 5mmol,四甲基乙二胺（EDTA）0.25mmol, TritonX-100 25ml,甘油500ml。
(2)供试品保存液(Ｂ液)
每1L A液中含1mg亮抑蛋白酶肽、0.7mg抑胃肽及1mg抑蛋白酶肽。
(3)引物及探针序列
上游引物：5’-Biotin-CGTGGTTGACACGCAGACCTCTTAC-3’
下游引物：5’-TCAACACTGTACGGCACCCGCATTC-3’
ATTATCTGGCCTTTGAGAGTTACTCTTTG-3’
探针：5’-NH
2
(4)模板雀麦草花叶病毒RNA(BMV RNA)
(5)反转录缓冲液每1L反转录缓冲液含Tris-HCl(pH8.3) 50mmol, 氯化钾40mmol, 氯化镁6mmol, DTT 10mmol，脱氧核糖核苷酸200μmol,下游引物0.8×10－3 mmol。
(6)扩增缓冲液每1L扩增缓冲液含Tris-HCl(pH8.8) 25mmol, 氯化钾40mmol,氯化镁2mmol,脱氧腺嘌呤核糖核苷酸200μmol、脱氧胞嘧啶核糖核苷酸200μmol、脱氧鸟嘌呤核糖核苷酸200μmol及脱氧尿嘧啶核糖核苷酸200μmol,上、下游引物各0.4×10－3 mmol，核糖核酸酶A 0.8g， Taq DNA聚合酶6×104U，尿嘧啶N－糖基化酶（UNG）4×104U。
（7）封闭液 3%牛血清白蛋白或0.5%酪蛋白溶液。
(8)变性缓冲液 0.2mol/L氢氧化钠，5mmol/L EDAT。
（9）包被液0.05mol/L磷酸氢二钠溶液（pH8.5）
供试品、阳性对照及灵敏度供试品的制备
(1)取供试品200μl，每分钟5000转离心5分钟，取上清液100μl，加入
B 液100μl 和焦炭酸二乙醇（DEPC）处理的5%Triton X-100 2μl，混匀后，置冰浴15分钟后，置-70℃保存备用。
(2)阳性对照用SP2/0细胞培养上清液作阳性对照，同上处理后，按单次使用量分装，-70℃保存备用。
(3)灵敏度供试品取鼠源白血病病毒逆转录酶（MMLV）用A液进行系列稀释至10-8 U/μl，充分混匀，按单次使用量分装，-70℃保存备用。
检查法
（1）反转录
将已处理的供试品及阳性对照用A液作10倍稀释。
反转录反应管中加入反转录缓冲液20.8μl， 500mg/L BMV-RNA 0.2μl，混匀后，标记，70℃放置10分钟，置冰浴。
在相应的反转录反应管中分别加入4μl已稀释的供试品、阳性对照及灵敏
度供试品，以A液作阴性对照。反转录反应体系为25μl。37℃反应90分钟。
（2）PCR扩增
取反转录产物5μl加至PCR扩增缓冲液20μl中，PCR扩增反应体系为25μl。混匀后，按下列条件进行扩增：37℃30分钟，预变性94℃5分钟，94℃45秒，56℃45秒，72℃45秒，进行35个循环，72℃延伸5分钟。
（3）杂交检测
用经包被液适当稀释的探针100μl包被DNA结合板，4℃过夜；次日，用封闭液37℃封闭60分钟, 洗涤3次，备用；扩增结束后，每个反应管中加入变性液25μl，混匀；在封闭洗涤后的包被板上每孔加入供试品25μl，再加入杂交液100μl，混匀后，37℃反应60分钟，用洗涤液洗涤5次；每孔中加入链亲合素标记的辣根过氧化物酶100μl，37℃反应30分钟；同上洗涤5次；每孔加入显色液100μl，37℃显色10分钟；每孔加入终止液100μl终止反应。以630nm 为参考波长，于波长492nm处测定吸光度。
结果判定
Cutoff值为阴性对照的吸光度值加0.2 。
阴性对照吸光度值应不高于0.2，如小于0.05按0.05计。
阳性对照应为阳性，且吸光度值应不低于1.5。
灵敏度供试品应为阳性，且吸光度值应不低于0.8。
供试品吸光度值大于Cutoff值者为阳性。
注意事项
（1）如供试品为培养细胞，则将细胞传代后，培养3-4天长成单层，取上清检测，取供试品前不得换液。
(2)试验中所有试剂及吸头均需灭菌。与RNA操作有关的试剂及材料均需经过DEPC处理。
(3)加供试品区、扩增区及PCR产物检测区及其所用加样枪及服装应严格区分。
(4)定期对各区进行消毒，PCR产物及其加供试品吸头应及时进行有效处理。
动物细胞工程知识点
动物细胞工程12月20日 动物细胞工程常用技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 一、动物细胞培养 1、定义：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 2、原理：细胞增殖 3、过程 分散成单个细胞， 制成细胞悬液 注意： ①10代以内细胞保持正常的二倍体核型，无突变发生，常用于实践或冷冻保存。 ②超过50代，极少数细胞突破自然寿命极限，突变成癌细胞，具有无限增殖能力；若超过50代，细胞不再增殖，全部死亡，则说明细胞没有发生癌变。 ③分瓶之前，称原代培养；出现接触抑制用胰蛋白酶处理，再分瓶培养为传代培养。 思考回答： ⑴、为什么选用幼龄动物组织或胚胎进行细胞培养? 答：其细胞的分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。 ⑵、动物细胞培养需要脱分化吗?为什么? 答：不需要。因为高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以没有类似植物组织培养的脱分化过程，要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。 ⑶、进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分?用胃蛋白酶行吗? 答：主要是蛋白质，不行，因为胃蛋白酶作用的适宜PH约为2，当ＰＨ大于6时就会失去活性，多数动物细胞培养适宜PH为7.2－7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。（胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2－8.4，胰蛋白酶活性较高） ⑷、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗?为什么?
答：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤，因此必须控制好消化时间。 ⑸、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？ 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体 4、重要概念 ①细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 产生原因：培养贴附性细胞时，细胞要能够贴附于底物上才能生长增殖。 培养要求：培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒，易于贴附。 ②细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 ③原代培养：动物组织消化后的初次培养 ④传代培养：原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。 5、培养条件： ⑴无菌无毒环境：无菌——对培养液和所有培养用具进行无菌处理；在细胞培养液中添加一定量的抗生素。；无毒——定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对自身造成危害。 ⑵营养： 成分：所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然成分。 培养基类型：合成培养基（将细胞所需的营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基） ⑶温度和pH值：哺乳动物多以36.5±0.5℃为宜，多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。 ⑷气体环境：通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含95％空气加5％CO2的混合气体的培养箱中进行培养。O2：是细胞代谢所必需的CO2主要作用是维持培养液的pH。 6、应用：生产有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。基因工程中受体细胞的培养。用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。科学家培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。
高中生物 动物细胞培养和核移植技术教案 新人教版选修3
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
动物细胞工程
细胞工程第一讲 一、概述 1、细胞工程（cell engineering ）定义 应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的原理方法与技术，按照人们的需要，在细胞水平上进行遗传操作，包括细胞融合、核质移植等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。 2、细胞工程的研究内容 （1）动植物细胞和组织培养 植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备，日本等国家用生物反应器培养人参细胞生产有效药用成分。 动物细胞培养用于制备单克隆抗体、疫苗、生长因子等。 （2）细胞融合 改良性状，培育新品种 （3）染色体工程 细胞工程 动植物细胞和组织培养 细胞融合 染色体工程 胚胎工程 细胞遗传工程 器官培养 组织培养 细胞培养 （快速繁育和产物大量制备） （改良性状，培育新品种） （培育新品种，单倍体和多倍体） （获得人们需要的成体） （无性繁殖，改变性状） 克隆 转基因技术
主要用于培育单倍体或多倍体新品种，如四倍体小麦，八倍体小黑麦 （4）胚胎工程 主要是获得人们需要的成体 如：胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存 对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿 （5）细胞遗传工程 克隆：无性繁殖，动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。 转基因技术：将外源基因整合到生物体内，能够表达并稳定遗传给后代的实验技术。 3、细胞工程的优势 （1）避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。 （2）不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。 4、细胞工程发展 （1）萌芽阶段---理论渊源和早期的尝试（20世纪初-30年代中期）德国植物生理学家Haberlandt在1902年提出植物细胞的全能性。认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。 美国生物学家Harrison 是公认的动物组织培养的创始人，1907年，以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程，
动物细胞工程制药的研究进展
动物细胞工程制药的研究进展 程庆佳 （云南大学，生命科学学院，生物技术，20091070004） 摘要：动物细胞工程制药是动物细胞在制药产业中的应用，本文主要介绍动物细胞工程最新的制药研究进展，包括动物细胞融合技术，细胞核移植技术，转基因动物技术，细胞大规模培养技术等，同时讨论动物细胞制药的发展方向和发展前景。 英文摘要：Animal Cell Engineering is animal cells in the pharmaceutical industry in the application. This paper describes the latest pharmaceutical animal cell engineering research, including animal cell fusion techniques, monoclonal antibodies, transgenic animal technology, large-scale cell culture technology, Also discussed animal cell engineering pharmaceutical development prospects. 关键词：动物细胞融合技术，单克隆抗体的制备，转基因动物技术，细胞大规模培养技术，发展前景 英文关键词：Animal cell fusion techniques, monoclonal antibodies, transgenic animal technology, large-scale cell culture technology, development prospects 所谓动物细胞工程就是以动物细胞为基本单位在体外条件下进行培养、繁殖和人为操作，使细胞产生某些人们所需要的生物学特性，从而改良品质，加速繁殖动物个体或获得有用品系的技术。这种技术在制药业中起到关键的作用，目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过8 0％，例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等。当前动物细胞工程制药所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞核移植技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术等方面。本文就是以细胞工程为基础阐述动物细胞工程制药的技术与发展前景。 1、用于制药业的动物细胞系 目前用于生物制药的动物细胞有4类，即原代细胞、传代细胞系，转化细胞系和融合的或重组的工程细胞系。 1.1 原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织器官，经过粉碎消化而获得的细胞悬液。动物细胞生产生物药品的早期，一般用原代培养的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞等，Ender最先用原代培养的猴肾组织细胞来生产脊髓灰质炎灭活疫苗。原代细胞增殖能力有限，需要大量动物才能增加产量，费钱费力，限制了它的应用。 1.2 传代细胞系 传代细胞系是二倍体细胞在传代繁殖过程中，有些细胞发生改变，不仅形态发生变化，且生长更快，能以少量的细胞起始培养。由一个这样的细胞得到的细胞克隆，与它起源的细胞株大不相同，它能无限期地生存，这样的细胞克隆称为传代。许多传代细胞系建立于50年代，用它们来生产疫苗不仅可以降低实验动物的量，并且因为所用的细胞性质均一，通过体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量，避免了动物个体差异产生的疫苗质量不稳定问题。但传代细胞系在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处，有时是从肿瘤细胞衍生而来，由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性，因而数十年间未允许传代细胞系用于生产。7 O年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性，wI一38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系。二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴
(完整word版)2015 动物细胞培养技术实验报告
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
动物细胞培养及无血清培养研究进展
动物细胞培养及无血清培养研究进展 摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。 关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言 组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念 细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容
动物细胞培养技术 思考题
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
(完整版)动物细胞培养及应用发展史
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
动物细胞培养技术实验
实验十五动物细胞培养技术及其应用 一．实验目的 通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。 二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。 三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液 管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。 四．实验方法与步骤 （一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。 胰蛋白酶液： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛 血清。 细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,
国内外细胞工程制药的研究现状及发展前景6
国内外细胞工程制药研究现状及发展前景 摘要：动物细胞工程制药是动物细胞工程技术在制药行业方面的应用。当前动物细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面。本文综合论述了国内外动物细胞工程制药的发展简史，研究近况和制造实例，并在此基础上探讨了动物细胞工程制药的未来发展趋势和前景。 关键词：细胞工程、细胞融合、核移植、染色体改造、转基因、细胞培养 1 前言 细胞工程制药是细胞工程技术在制药工业方面的应用。所谓细胞工程，就是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品的一门应用科学和技术。它主要由上游工程（包括细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏）和下游工程（即将已转化的细胞应用到生产实践中用以生产生物产品的过程）两部分构成。当前细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面[1]。
21世纪，生物技术制药是制药行业的亮点，近25年来，世界生物技术工业飞速发展，创造了35种重要的治疗性生物技术药物。中国生物技术产业是紧跟世界产业同步发展的。2007年全球生物技术药物市场销售额已达到828亿美元[2]。基因工程、细胞工程和酶工程组成三驾马车行驶在现代生物技术发展大道的前列。动物细胞工程在生物制药的研究和应用中起关键作用，目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程生产的已超过80%，例如蛋白质、单克隆抗体、疫苗等。 2 细胞工程制药研究现状 动物细胞工程制药主要涉及细胞融合技术、细胞器移植尤其是核移植技术、染色体改造技术、转基因技术和细胞大规模培养技术等。 2.1 细胞融合 是用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。可用于产生新的物种或品系及产生单克隆抗体等。在我国目前动物细胞工程的发展中,技术最成熟的当数细胞融合。其中淋巴细胞杂交瘤在国内已普遍开展,并培育了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系,它们能分泌产生在诊断和治疗病症方面发挥重要作用的单克隆抗体。如甲肝病毒单克隆抗体[3]、抗人Ig M单克隆抗体[4]、肿瘤疫苗[5]等可用于治疗疾病;抗人结肠癌杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体[6],巨噬细胞集落刺激因子受体)胞外区的单克隆抗体等[7]则对诊断疾病具有重要价值。由于技术已趋成熟,目前许多单克隆抗体已经进入产业化的生产阶段。
动物细胞工程制药技术
动物细胞工程制药技术 摘要 生物制药产业以基因工程、抗体工程、细胞工程为主要代表。文章主要讲述动物细胞工程技术。动物细胞工程制药是动物细胞工程技术在制药行业方面的应用。当前动物细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面。 关键词：动物细胞工程制药细胞融合细胞大规模培养核移植
1、动物细胞工程制药技术 1、1.细胞融合 细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，进而发融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一，不仅在农业、工业的应用领域不断扩大，而且在医药领域也取得了开创性的研究成果，如单克隆抗体、疫苗等生物制品的生产。在动物体细胞融合技术的基础上 Kohler G和 Milstein C将能产生特异性抗体的原代 B 淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，创立了单克隆抗体制备的方法。国内外已培育出了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌用于疾病诊断和治疗的单克隆抗体，如甲肝病毒、抗人 I g M 、抗人肝癌和肺癌、抗M-CSFR（Macrophage Colony-Stimulat-ing Factor Receptor，巨噬细胞集落刺激因子受体）胞外区的单克隆抗体等。目前单克隆抗体技术已趋成熟，许多产品已经进入产业化的生产阶段。 此外利用细胞融合技术可以生产各种免疫疫苗，肿瘤细胞 / 树突状细胞融合疫苗是近年来国内外恶性肿瘤免疫治疗研究的热点, 在各种动物模型及病人身上观察到肿瘤的消退。Avigan 等将乳腺癌或肾癌病人的自体癌细胞与树突状细胞在含有人粒 - 巨噬细胞集落刺激因子、白介素 - 4 的自体血清中培养，加入聚乙二醇使两种细胞产生融合, 融合细胞疫苗能使肿瘤消退，显示其在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。 1、2.转基因动物 利用转基因动物乳腺反应器生产药用或食品蛋白是生物制药领域近年来研究的热点之一。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器，所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量高的动物就相当于一座药物工厂。20 世纪 80 年代中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因，开创了研制动物乳房生物反应器的先河。 据美国遗传学会预测，到2010年，所有基因工程药物中利用动物乳房生物反应器生产的份额将高达95％。国外现已有数十家以动物乳腺反应器为核心技术的公司，可生产α 1 －抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、乳铁蛋白、人血清白
动物细胞工程试题及详解汇编
动物细胞工程试题 1用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是（C）A都须用液体培养基 B都需用培养箱 C都要在无菌条件下进行 D都可体现细胞的全能性 解析：动物细胞离体培养主要是获得细胞的代谢产物，植物体细胞离体培养体现的是全能性。植物体细胞是固体培养基。动物体细胞培养需要二氧化碳培养箱。 动物细胞培养： 1、动物细胞的培养：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。 2、动物细胞培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。 3、动物细胞培养液的特点：液体培养基含动物血清。 4、动物细胞培养需要满足以下条件 (1)充足的营养供给——微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。 (2)适宜的温度：36.5℃±0.5℃；适宜的pH：7.2～7.4。 (3)无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。 (4)气体环境：95%空气+5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。 5、动物细胞培养的过程： 取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。 2下列关于细胞工程的叙述，错误的是（D） A. 电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合 B. 去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理 C. 小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体 D. 某种植物甲乙两品种的体细胞杂交与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同 解析：A正确诱导原生质体融合的方法有物理法（离心振动电刺激）化学法（聚乙二醇PEG）生物方法（灭活的病毒）. B正确去除植物细胞壁需要纤维素酶和果胶酶，将动物组织分散成单个细胞需要胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间。C正确小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合既可以无限增殖，又可产生特异性抗体。D错误，假设甲植物体细胞是2N,乙植物体细胞是2M，甲乙体细胞杂交染色体数目为2N+2M；而甲乙品种杂交染色体数目是N+M。 3制备单克隆抗体所采用的细胞工程技术包括（A） ①细胞培养②细胞融合③胚胎移植④细胞核移植 A．①②B．①③C．②③D．③④ 解析：单克隆抗体的制备过程是人工诱导经过免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，再经筛选获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，经过培养获得的杂交瘤细胞获得单克隆抗体。 4利用细胞工程方法，以SARS病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（D）
名词解释-动物细胞工程
1.细胞融合：又称为细胞杂交，指真核生物体细胞在体外培养条件下，用人工的方法，使两个或两个以上的细胞融合成一个双核或多核细胞的过程。分为同核融合细胞（相同细胞形成的融合细胞）和异核融合细胞（不同细胞形成的融合细胞）。 2.染色体工程：是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术。广义上讲，它还包括染色体内部的部分遗传操作。 3.试管动物：是指利用精、卵体外受精、胚胎体外培养和移植获得的各种动物，又称体外受精动物。是试管动物从供体获得精子和卵子，经过成熟培养，在体外人工条件下受精，并经过一段早期发育，再将胚胎移植入受体的子宫内。 4.动物细胞工程：是借助物理、化学、生物等手段来更新细胞的遗传物质或通过受精卵细胞的改造而达到改造生物的遗传特性和生理功能的目的，从而有效提高动物的生产性能和产品质量。因此，动物细胞工程技术的应用，在当前提高动物生产性能方面已成为最基本、最重要的技术措施之一。 5.生物技术：又称生物工程或生物工艺学，是以生物科学的原理为基础，利用生物体系和工程学原理，按照人们设计的蓝图，改良或加工生物体，以提供商品和社会服务的综合性技术科学。生物技术是生物科学和工程技术的发展在非常精密有效的基础上结合在一起，形成的多学科综合的结果。 6.细胞工程：是应用细胞生物学、发育生物学和分子生物学的理论和技术，按照人们的需要，有计划、大规模的培养生物组织和细胞，以获取生物及其产品。或改变细胞的遗传组成，以产生新的种或品种，为社会和人类提供服务。 7.抗体：是一种免疫球蛋白，当机体受到细菌、病毒或其它抗原攻击时，B淋巴细胞就增殖、产生对这些抗原相应的抗体。 6.克隆：由一个细胞繁殖而形成的具有相同遗传特征的细胞。 7.单克隆抗体：由一个抗体形成细胞大量增殖形成的克隆所产生的抗体。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 多倍体：是由于细胞内染色体加倍而形成的，既通过抑制受精卵第二极体的排出产生三倍体或抑制第一卵裂产生四倍体。目前广泛应用的诱导方法有：生物学、物理学和化学方法。 9.细胞重组：是细胞工程中将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，即在融合介子诱导下与完整细胞合并，重新构成胞质杂种的过程。 10.转基因动物：借助分子生物学实验手段，将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定地整合有人工导入的外源基因的动物称转基因动物。 11.干细胞（SC）：是指每个具有生命的有机体在从其最初形式发展成为完整体的过程中，始终保留着部分未分化的原始细胞。 12.生殖细胞：多细胞生物体内能繁殖后代的细胞的总称。包括从原始生殖细胞直到最终已分化的生殖细胞。物种主要依靠生殖细胞而延续和繁衍。
细胞工程动物细胞培养
第3章动物细胞培养 内容回顾 重点：细胞分化和细胞全能性 重点：消毒与灭菌方法、细胞培养的基本方法、支原体污染的检测与控制 3.1 动物细胞的特点 动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞比进化程度高，结构、成分更复杂，功能更全面。 3.1.1动物细胞与微生物细胞的比较 （1）细胞大，无细胞壁； （2）倍增时间长，生长缓慢，易受污染； （3）需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感； （4）以聚集体形式存在； （5）原代细胞一般繁殖50代左右就退化死亡。 3.1.2动物细胞与植物细胞比较 共同点：动植物细胞中都有细胞膜、细胞质和细胞核。 区别：动物细胞中无细胞壁、叶绿体和液泡，但是有的植物细胞中无叶绿体。 3.1.3动物细胞连接的5种形式： （1）紧密连接（常见） （2）间隙连接（常见） （3）隔壁连接（无脊椎动物细胞） （4）中间连接（脊椎动物细胞） （5）桥粒连接（常见） ***细胞连接（cell junction）： 细胞间的联系结构，是细胞质膜局部区域特化形成的，在结构上包括膜特化部分、质膜下的胞质部分及质膜外细胞间的部分。细胞连接是多细胞有机体中相邻细胞之间通过细胞质膜相互联系, 协同作用的重要基础。 ***各类连接的比较
3.2 动物细胞与组织培养的定义与分类 3.2.1定义：动物细胞与组织培养（animal cell and tissue culture) 是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 3.2.2分类 动物细胞与组织培养可以分为：细胞培养、组织培养和器官培养。 1. 细胞培养(cell culture):细胞培养是指细胞的体外培养,这是在无菌条件下,将机体内的组 织取出,分散(机械或酶消化)成单个细胞,在模拟体内的环境中,给以营养物质,使细胞不断生长、繁殖或传代,借以观察细胞的生长、分裂、接触抑制以及衰老、死亡等生命现象。细胞培养也包括单个细胞的培养。 2. 器官培养(organ culture):器官培养是指器官的原基(芽胚基)、整个器官或器官的一部分, 在体外条件下保存(维持)或生长,并能分化和保持结构和/或功能。 3. 组织培养(tissue culture):组织培养是指组织在体外条件下的维持或生长。此种方法可有 组织分化及保特组织的结构和/或功能的特点。这里需要说明的是,当我们做组织培养时,不论用什么方法和条件,组织培养中的主要成分仍然是细胞;细胞在生长过程中总有移动(运动)和其他变化,这样就使得被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长,发生变动的可能性越大。结果常使单一类型的细胞易保存下来,最终也成了细胞培养。 ***细胞培养,并不意味着细胞彼此之间是独立的。细胞在培养中的生命活动和体内细胞一样,仍然是相互依存的,呈现一定组织的特征。所以组织培养和细胞培养并无严格区别,两者在一定程度上可看作是同义语。 3.2.3细胞体外培养可分为原代培养与传代培养 原代培养(primary culture):是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。实效培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。 传代培养(subculture)：从原代培养的细胞继续转接培养的过程。体外动物细胞在形态结构上均程度不同的与原来的细胞有所差异。 3.3 发展简史 1907（美）Harrison，用蛙淋巴液来培养蛙胚神经管,并观察到神经纤维是由细胞质进行阿米巴运动所形成。动物细胞组织培养的奠基人） 1912（德）Carrel，用更换培养基和传代的方法解决了组织块长期存活的问题；设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 1943Earle，培养C3H小鼠结缔组织并用致癌物20-甲基胆蒽处理，获得了能回种于小鼠体内并生长肉瘤的长期培养的细胞系，定名为L细胞系。 1548Sanfold，用预先处理的条件培养基成功地使L细胞系的一个单细胞在体外发展成“克隆”并繁殖成克隆株。 1951Gey，用人的宫颈癌组织建立在体外连续培养的人的肿瘤细胞系（HeLa细胞系）。L 与HeLa细胞系是最早建成的细胞系。 1955Eagle研制成人工合成的培养基。 20AD70sSato等人发展了无血清培养。
动物细胞培养在药物领域的应用2
动物细胞培养在药物领域的应用 摘要：动物细胞培养开始于本世纪初 1962 年, 其规模开始扩大, 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法, 利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等, 已成为医药生物高技术产业的重要部分。本论文主要介绍动物细胞培养在药物领域的应用。 关键词：现代生物技术、动物细胞工程、动物细胞培养、药物领域、单克隆抗体 现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切的关系，特别是在生物医药领域，细胞培养更具有特殊的作用。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多都是通过细胞培养来实现的，基因工程乙肝疫苗大多是以CHO细胞作为载体；基因工程抗体药物的制备也离不开细胞培养。细胞工程领域更离不开细胞培养技术，杂交瘤单克隆抗体的研究制备完全是通过细胞培养来实现的，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。 一、首先介绍下动物细胞特点及其培养的基本要求和技术 1、动物细胞特点 动物细胞没有细胞壁，只有细胞膜，细胞质，细胞核，而且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或者半固体的表面才能生长。 体外培养的动物细胞可分为原代细胞和传代细胞。原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。通常体外大量培养的动物细胞有哺乳动物细胞、昆虫细胞、禽类细胞和鱼类细胞等。 2、动物细胞培养的要求 动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH （36.5±0.5℃，7.2~7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。 其中动物细胞对营养要求更加苛刻，包括有氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或者半乳糖，除此之外还要有血清，因为由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。这些都是组成培养基的重要成分。 动物细胞培养还需要防止污染问题，细菌、真菌、病毒均可以导致动物细胞在培养过程中受到感染而死亡。而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境均会引起污染。显著的污染标志是培养基的pH迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现漂浮的集落。 3、动物细胞培养的步骤 ①无菌操作取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净； ②以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块； ③将小组织块置解离液离散细胞（解离液含有蛋白酶类）； ④低速离心洗涤细胞后，讲目的细胞吸移至培养瓶内培养。注意，哺乳动物细胞的大量培养需要提供较大的支持界面，原因前面已经说过，那是因为哺乳动物细胞只有附着在固体或者半固体的表面才能生长。 4、动物细胞培养的方法
动物细胞工程样本
细胞工程第一讲 一、 概述 1、 细胞工程( cell engineering) 定义 应用现代细胞生物学、 发育生物学、 遗传学和分子生物学的原理方法与技术, 按照人们的需要, 在细胞水平上进行遗传操作, 包括细胞融合、 核质移植等方法, 快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。 2、 细胞工程的研究内容 ( 1) 动植物细胞和组织培养 植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备, 日本等国家用生物反应器培养人参细胞生产有效药用成分。 动物细胞培养用于制备单克隆抗体、 疫苗、 生长因子等。 ( 2) 细胞融合 改良性状, 培育新品种 ( 3) 染色体工程 主要用于培育单倍体或多倍体新品种, 如四倍体小麦, 八倍体小黑麦 ( 4) 胚胎工程 主要是获得人们需要的成体 细胞工程 动植物细胞和组织培养 细胞融合 染色体工程 胚胎工程 细胞遗传工程 器官培养 组织培养 细胞培养 ( 快速繁育和产物大量 制备) ( 改良性状, 培育新品 种) ( 培育新品种, 单倍体和多倍体) ( 获得人们需要的成体) ( 无性繁殖, 改变性状) 克隆 转基因技术
如: 胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存 对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿 ( 5) 细胞遗传工程 克隆: 无性繁殖, 动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。 转基因技术: 将外源基因整合到生物体内, 能够表示并稳定遗传给后代的实验技术。 3、细胞工程的优势 ( 1) 避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作, 只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。 ( 2) 不但能够在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间, 甚至能够在三者之间形成前所未有的杂交物种。 4、细胞工程发展 ( 1) 萌芽阶段---理论渊源和早期的尝试( 20世纪初-30年代中期) 德国植物生理学家Haberlandt在19 提出植物细胞的全能性。认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。 美国生物学家Harrison 是公认的动物组织培养的创始人, 19 , 以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程, 首创了体外组织培养法。 ( 2) 奠基阶段---离体培养技术的建立( 20世纪30年代中期-50年代中期) 1934年美国植物生理学家White经过培养番茄根, 建立活跃生长的无形繁殖系, 而且在28年间转接培养1600代仍能生长。并正式提出植物细胞全能性学说。 1940年, Earle建立无限传代的小鼠结缔组织L细胞系; 1954年, 美国微生物学家索尔克利用原代培养的猴肾细胞制备脊髓灰质炎疫苗并进入工业化生产。 ( 3) 蓬勃发展阶段---各种新物种的出现( 20世纪50年代末-至今) 1958年, 利用胡萝卜髓细胞形成了体细胞胚, 并发育成完整植株。 1960年, 植物原生质体和体细胞杂交成功。在育种及次生代谢产物生产方面飞速发展, 1958年, 冈田善雄灭活的仙台病毒诱导肿瘤细胞融合, 开创了细胞融合的崭新领域。