铅离子与牛血清蛋白相互作用光谱分析—大学课程设计方案
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本科毕业设计<论文）
题目：铅离子与牛血清蛋白相互作用的光谱分析
Spectroscopic investigations on the interaction
of Pb2+with bovine serum albuminn 学院学院
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牛血清蛋白和铅离子相互作用的光谱分析
摘要：本文综合运用荧光光谱法、紫外光谱法、红外光谱法分析铅离子和牛血清蛋白相互作用的光谱特征。探究了不同的实验条件：pH、牛血清蛋白浓度、铅离子浓度、离子强度对铅离子-牛血清蛋白体系光谱的影响，以及最佳实验条件，利用紫外光谱中峰值变化或者位移初步判断铅离子与BSA发生了作用。荧光光谱测定出铅离子可以引起牛血清蛋白的荧光猝灭，利用红外光谱分析铅离子对蛋白质二级结构的影响，可知β-转角增加，α-螺旋减小，β-片层增加。
关键词：铅离子；牛血清蛋白；荧光光谱；紫外可见光谱；红外光谱
Abstract: In this paper，The interaction ofPb2+and bovine serum albumin (BSA> was studied by fluorescence，UV Spectrum，and infrared spectroscopy.It is exploredthe impact of different experimental conditions:pH，the concentration of the bovine serum albumin，the concentration of the lead ion .UV Spectrum shows that Pb2+ froms a compound with BSA.The results revealedthatPb2+caused the fluorescencequenching of BSA.Infrared spectroscopy shows theinteractionbetweenPb2+andBSA couldresultinthechange ofconformation of BSA.Thushelix structure in BSA was decreased the β-sheet was increased.
Keywords：lead ion；bovineserum albumin。fluorescencespectrometry；UV Spectrum；infrared spectroscopy
目录
1. 引言 (4)
1.1紫外光谱 (5)
1.2荧光光谱 (5)
1.3红外光谱法 (8)
2.实验部分 (10)
2.1实验试剂与仪器 (10)
2.1.1实验试剂 (10)
2.1.2实验仪器 (10)
2.2实验试剂的配制 (10)
2.2.1 缓冲液的配制 (10)
2.2.2 BSA溶液的配制 (10)
2.2.3 铅离子溶液的配制 (10)
3.结果与讨论 (13)
3.1紫外光谱图 (13)
3.1.1 不同pH条件下体系的紫外光谱图 (13)
3.1.2 不同浓度BSA下体系的紫外光谱图 (14)
3.1.3不同浓度硝酸铅条件下的紫外光谱图 (13)
3.1.4离子强度对体系紫外光谱的影响 (15)
3.2荧光光谱图 (16)
3.3红外光谱图 (17)
3.3.1 铅离子存在的红外光谱图 (19)
3.3.2 体系的红外二阶导数图 (19)
4.结论 (21)
参考文献 (21)
致谢 (22)
1.引言
在生物体中，蛋白质是极为重要的生命物质，在生命的运动和发展中起着关键的作用。有关蛋白质的组成、构象及与小分子相互作用机理的研究，是目前从事化学、化学生物学、生命科学、药学和临床医学科技工作者共同关注和感兴趣的课题【1】。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，它能与许多内源性物质和外源性药物等有效结合，形成结构更为复杂的复合物，直接或间接地发挥着调控蛋白质的作用【2-4】，影响蛋白质的生理作用。因此关于小分子与蛋白质等生物大分子相互作用的研究引起了人们的极大关注。蛋白质种类繁多，目前已经发现的蛋白质数量已达几百万种，但是各种蛋白质均是含有多个配位原子<如：N、O、S，有些蛋白质还含有P等）的大分子多齿配体，因此能够很容易地与金属离子或其小分子配合物相互作用，并且对应不同的光谱特征。蛋白质的功能与其结构构象密切相关，有什么样的结构就有什么样的功能，反之同样成立。蛋白质某种生物功能的激活或维持往往与一些生命元素或有益元素的作用密切相关；同时，蛋白质某种生物功能或活性的减弱或消失也往往是受某种沾染元素或有害元素的影响，这些元素大多数是金属元素，它们通过与相关蛋白质的作用来稳定或改变蛋白质的结构构象，从而达到控制或影响蛋白质功能的目的。因此可以说，研究金属元素同蛋白质的相互作用特别是多种不同金属元素在近生理环境条件下同蛋白质的相互作用及作用前后蛋白质结构构象的变化，阐明某种金属元素的作用机理，从而为从分子水平上研究微量元素对人体健康的影响、预防中毒及环境污染治理等有重要意义。
牛血清蛋白(bovineserumalbumins，BSA>是常用的研究蛋白，因为它是血浆中含量最丰富的载体蛋白，能与体内许多内源性物质及外源性物质作用，且这类蛋白的结构己用X光测定【5-6】牛血清蛋白和人血清蛋白十分相近，两者氨基酸的排列顺序也极其相似，牛血清蛋白是一种含多个配位基团的生物有机大分子，可以与金属离子配位。所以对牛血清蛋白的分析具有十分重要的理论和现实意义。
金属离子同蛋白质的相互作用除受蛋白质本身刚性和柔性结构影响外，还受金属离子电荷、半径、配位构型等因素影响，如Zn常与Cys、His以配位键形成四面体结构。另外，反应温度、反应时间、离子浓度<强度）、酸度、缓冲液等均影响蛋白质与金属离子的相互作用。特别值得注意的是离子浓度对反应的影响，浓度过高或过低都不会达到理想的实验目的，因为无论是对人体有益的还是有害的元素，它们在体内都
有一个相当恒定的浓度范围，任何一种元素浓度过高或过低都将对人体产生不良影响，而且蛋白质本身还存在盐析作用，因此在实验过程当中应该选择一适当的离子浓度范围。铅在自然界中分布极广，几乎所有的矿物中都含有铅。生活中常见的是铅离子，铅是进行工业生产、科学研究不可缺少的物质之一，在人类的生产生活中起着重要的作用。但是铅又是对人类和高等生物中最具危害的有毒元素之一，铅污染问题己给人类造成了多种灾害。铅在自然界中以多种形式存在。铅的形态不同，产生的毒性也不同。研究表明，无机铅可通过生物甲基化、乙基化等反应生成相应的有机铅，而有机铅可被动植物吸收，并通过食物链富集，最终危害人类健康。铅即可造福人类，又会造成环境的污染。因此，寻求高灵敏度和高选择性的检测方法对其进行检验，具有理论和实际的意义。蛋白质与金属离子相互作用的研究早在50年代就已开始进行。自从60年代以来，许多科学工作者采用晶体结构分析和配位化学方法研究了一些金属蛋白和金属酶的结构，配合生物活性研究推测了它们的作用机理，这些研究共同构成了生物无机化学的主要研究方面。自从80年代以来，各种检测技术及计算机技术的发展为人们研究蛋白质同金属离子的相互作用打开了一个新的局面，这方面我国的生物无机化学家王夔、申泮文等已作了大量的研究工作，并有多部相关的专著介绍具体的实验。常用到的检测方法如下：
1.1. 紫外光谱法
紫外吸收光谱分析是了解溶液中蛋白质分子构象的一种常规方法。牛血清蛋白分子大概在280nm左右有一强吸收峰。由于蛋白质不同区域有特异性的结合，结合药物后会导致上述特征吸收峰的位移，因而在牛血清蛋白溶液中加入很少量的络合物，观察牛血清蛋白的特征吸收峰是否发生位移或者峰值变化可粗略知道络合物是否与BSA发生了作用。
血清蛋白可以吸收紫外光，当与小分子物质发生作用时就会相应的出现吸收峰位移或者谱峰宽度的变化。杜娜娜等结合紫外吸收光谱和荧光光谱的方法，研究了异烟肼
1.2荧光光度法
荧光光谱法具有灵敏度高、选择性好、用量少等优点。利用荧光光谱法测定药物、稀土金属和牛血清蛋白作用的报道比较多【10-15】。罗红斌等人应用荧光光谱研究了岩白菜素与牛血清白蛋白(BSA>分子间的相互作用，研究表明岩白菜素与BSA反应的结合常数为2.083xl04，结合位点数为1【16】。李丹等采用荧光和紫外吸收光谱法，研究了利尿脱水药山梨醇(Sorbito1>与牛血清白蛋白(BSA>的相互作用，求出了在不同温度下反应的结合常数分别7.4×10-5(25o C>和1.7×10-4 (37℃>，结合位点数为1【17】。吴刚坷等在模拟人体生理环境下，用荧光分光光度法及紫外一可见分光光度法研究了解热镇痛药对乙酰氨基酚(简写作PTL>与牛血清蛋白((BSA>之间的相互反应，实验结果发现:由于非辐射能量转移引起的荧光猝灭，BSA的荧光强度因与PTL相互之间的结合反应而明显降低。按Stern- Volmer方程和Lineweaver-Burk方程对所得实际数据进行了处理，求得此结合反应的静态平衡常数(KLB>为2.592X103molL-1(297K>，其结合位位置距212位色氨酸1.94nm，根据结合反应的热力学参数，推断PTL与BSA之间的结合力为硫水作用力【1】。荧光光谱研究的内容与方法如下:
(1> 结合部位的确定
血清白蛋白的三维晶体结构已探明，有3个类似的结构域[18]:Sitel，Sitell和Site1H.每个结构域又含有A与BZ个亚结构域，以槽口相对的方式形成圆筒状结构。大多数药物在血清白蛋白上的结合部位为Sitel及Sitdl。用荧光法确定药物分子在血清白蛋白上的结合部位常用以下方法。
(2> 用具有已知特定部位的探针来做代替[4-7]
某些荧光探针对蛋白质不同区域有特异性的结合，根据药物加入后对荧光探针的影响可以确定药物结合部位.已知Sitel的探针有:华法令(Warfarin>，苯基保泰松(Phnylbutazone>，丹磺酞胺(dansy-lamide>等。Site11的探针有:布洛芬(ibuprofen>，氟灭酸(flufenamic acid>等。
(3>通过Forster能量转移理论来求药物与色氨酸残基之间的距离[19-22]
蛋白质的内源荧光主要是色氨酸发出的。利用Forster能量转移理论，可以求出和蛋白质作用的药物与色氨酸残基之间的距离，由此推测药物与蛋白质结合的空间部位。能量转移作用可以发生在药物一蛋白质复合物内部，也可以发生在药物与蛋白质分子之间。在后一种情况时，求得的药物与色氨酸残基之间的距离表示分子扩散过程中药物分子与色氨酸残基的最近距离[22]。
(4> 结合位点数与结合常数的测定
Scatchard作图法是研究生物大分子与有机小分子结合反应的经典方法。此法在应用时须知道反应体系中游离态药物的浓度，这一点用荧光法测定时常不易做到，而且Scatchard作图法所得结果往往不理想。因此，在研究药物分子与蛋白质的结合反应中，Scatchard作图法应用不多。张保林等曾用此法研究了蒽醌及黄酮类化合物与人血清白蛋白的结合反应[11]。
蛋白质与药物分子发生反应时，可引起体系荧光性质的改变，有2种情况:(l>药物分子无荧光，在蛋白质溶液中加人药物后，蛋白质的内源荧光被猝灭。(2>药物分子有荧光，蛋白质与药物混合后，其内源荧光被猝灭，同时药物分子的荧光被敏化增强。从荧光猝灭机理上来看，药物分子对蛋白质荧光的猝灭可分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是药物和蛋白质的激发态分子之间的相互作用而导致的荧光猝灭，遵循Stern一Volmer方程[9-10]:
Fo/F=l+K sv C Q (1)
式中Fo为未加药物(猝灭剂>时蛋白质的荧光强度，F表示加入药物浓度为CQ时蛋白质的荧光强度，Ksv称为猝灭常数。静态猝灭是药物和蛋白质在基态时生成复合物，从而导致蛋白质荧光强度降低。对于1:1结合的情况，可推导出公式:
Fo/F=l+K[Q] (2)
式中K为复合物的稳定常数，[Q]为游离药物分子的浓度。根据此式作Fo/F-[Q]图，可由回归直线斜率求得K值。用式(2>作图，发现所得回归直线往往线性关系不好，为此，将式(2>变形为双倒数公式[12]，该式是目前国内作者引用最多的一个公式。(Fo - F>-1=Fo -1+K-1 Fo-1[Q]-1 (3)
比较式(1> 和式(2> 可以看到, 无论是静态猝灭还是动态猝灭, Fo/F与CQ之间均存在着线性关系, 因而, 仅仅通过测量荧光强度所得到的荧光猝灭数据, 无法判断猝灭现象究竟是属于动态还是静态的. 区分动态猝灭与静态猝灭可以通过以下几个方面来确定:
①动态猝灭与温度有关, 温度升高将增大扩散系数，从而增大双分子猝灭常数；而温度升高可能引起配合物的稳定性下降, 从而减小静态猝灭的程度。
②由于动态猝灭只影响到荧光分子的激发态, 因而并不改变荧光物质的吸收光谱。而静态猝灭中, 基态配合物的生成往往会导致荧光物质吸收光谱的改变。
③静态猝灭, 猝灭剂的存在并不改变荧光分子激发态的寿命,τo/τ= 1；而动态猝灭,猝灭剂的存在使荧光寿命缩短, τo/τ=Fo/F这是区分静态猝灭与动态猝灭最确
切的方法。
1.3红外光谱法
红外光谱各种实验技术的发展为研究蛋白质及多肽的结构与功能的关系提供了有力手段。蛋白质的二级结构与其分子内形成的不同氢键类型密切相关，红外光谱法是研究蛋白质二级结构和动力学特性的有效工具【23】，通过研究蛋白质的二级结构可以探讨结构和功能的关系。刘会洲等应用红外光谱仪研究了表面活性剂水溶液中的溶菌酶的乳化和二级结构的影响，提出离子型表面活性剂与蛋白质作用，能够破坏蛋白质分子中有序的螺旋结构，增加无规卷曲结构的含量[19]。
红外光谱是研究蛋白质二级结构的主要手段之一，它既可以对蛋白质的二级结构进行定性分析，也可以进行定量分析。1950年Elliott和Ambrose根据模型多肽提出的红外酰胺I带1660~1650cm-1的峰属α螺旋结构、1640~1630 cm-1的峰属β折叠构象的假设是定性估计蛋白质二级结构的基础[87-88]。70年代中期发展了若干半定量计算蛋白质构象的方法，这些方法的局限性在于要求很多参数，而实际工作的难度恰在于此。1983年Susi和Byler首先将二阶导数理论应用于研究二级结构，1986年他们又将卷积方法应用于二级结构分析[89]，使得红外分析蛋白质二级结构进入定量化阶段。
蛋白质在红外区域表现为9个特征振动模式或基团频率，其中最常用于二级结构分析的是位于1700~1600cm-1范围的酰胺I 带。由于蛋白质含有多种不同的二级结构单元，这些构象对应的振动吸收峰重叠在一起形成宽峰，各子峰固有的宽度大于仪器分辨率，利用普通光谱技术难以将各子峰分开，而傅里叶变换红外的高分辨率、高灵敏度、高信噪比及准确的频率精度等特点，使得二阶导数、去卷积技术可以应用于FTIR 上，因而可把原来酰胺I带中未能分辨的峰分开，并指出各子峰的峰位值，然后通过曲线拟合，定量分析蛋白质二级结构的各个组分。
目前，研究小分子、离子与白蛋白的相互作用的方法除了光谱法之外，常见的方法还有平衡渗析法、核磁共振法、离心超过滤法和量热法等【24】。
一直走在生物无机化学前列的王夔等人，他们通过一系列的研究发现了金属离子与血清白蛋白配位的平衡条件、pH效应、以及金属离子(包括稀土金属离子在内>与蛋白质的主要的配位基团及位置等【25】
以上各种方法中，应用较多的是紫外-可见光谱法和荧光光度法，而其中又以荧光光度法为最多，通过荧光法可以发现牛血清蛋白会发生非辐射能量转移引起的荧光静态猝灭，并且可以测定计算平衡常数，结合位点，作用力的类型，以及相关的热力学
常数，从而确定其他物质的加入对牛血清蛋白构象的影响；研究体系则以药物、稀土金属与牛血清蛋白的作用为多，而铅离子对牛血清蛋白构象的影响以及两者间作用的机理研究尚未见报道，因此，开展这方面的研究以寻求高灵敏度和高选择性的检测方法，具有理论和实际的意义。
2.实验部分
2.1 实验试剂与仪器
2.1.1实验仪器
(1>970CRT型荧光分光光度计<上海分析仪器总厂）
(2>UV-7502PC型紫外-可见分光光度计(日本岛津>
(3>电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司>
(4>10-1000μL移液枪
(5>Nicolet6700红外光谱仪(美国热电公司>
2.1.2实验试剂
2.2溶液的配制
2.2.1 缓冲液的配制
用分析天平准确称量KH
2PO
4
、Na
2
HPO
4
分别为0.9073g和2.3852g，用100ml容量瓶
配制成1/15mol/L的溶液，用酸度计调节配制pH为：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的缓冲液。
2.2.2 BSA溶液的配制
取50ml容量瓶，称量0.3400g牛血清蛋白，用二次蒸馏水配置成1×10-4mol/L的牛血清蛋白溶液，并稀释成10-5mol/L，作为储备液放入冰箱中在低于5摄氏度条件下
保存。
2.2.3铅离子浓度的配制
用分析天平准确称取0.3312g的硝酸铅，用100ml容量瓶配制成0.01mol/L的溶液。并且用二次蒸馏水依次稀释为1×10-3mol/L、5×10-4mol/L、1×10-4mol/L、1×10-5 mol/L、5×10-5 mol/L、1×10-6 mol/L。
<1）实验过程不同浓度的硝酸铅溶液的配制
取若干10ml干净的比色皿，加入2mlBSA溶液，2mlpH=7.1的缓冲液，加入硝酸铅体积 <2）不同pH溶液配制 取若干个比色管，加入2mlBSA溶液，并依次加入2mlpH为6.0、6.5、7.0、7.5、8、8.5的缓冲液，并用二次蒸馏水稀释至10ml。 <3）不同浓度的BSA浓度的配制 在十一个干净的10ml的比色管中加入2mlpH=7.1的缓冲液，2mL4×10-4mol/L加入如下表所示的BSA溶液，用二次蒸馏水稀释至10mL <4）测定步骤： 荧光：发射波长设定为350nm，测量200-600nm处的荧光光谱。所有测量均在室温(15±2℃>下进行。激发和发射单色器狭缝均为5nm。 紫外：均用二次蒸馏水建立基线，扫描范围200-600nm。 红外：灵敏度设定为2cm-1，测定4000-400cm-1处的光谱图 3. 结果和讨论 3.1紫外光谱图 3.1.1不同pH条件下体系的紫外光谱图 1-6:pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 由于蛋白质中含有芳香族氨基酸侧链，主要是酪氨酸 从图中可以看出在pH=7.5时峰强度最弱。pH＞7.5后，随着 pH值的增大峰强度减小，pH＜7.5时随着pH的增加，吸收峰逐渐增加。蛋白质具有羧基和氨基这些酸碱功能团，因此对pH的变化非常敏感，过酸过碱都会导致蛋白质变性失活。血清白蛋白280nm附近的吸收峰是其肽链上2个色氨酸和19个酪氨酸残基的芳杂环的π-π*跃迁引起的，而240nm附近的吸收则主要是肽键C=O基的n-π*跃迁引起，与蛋白质分子的α-螺旋结构含量有关。在BSA等电点之后，随着体系中pH的降低，使得BSA分子间 作用增强，有利于分子间和分子内的团聚作用，使蛋白质分子的构象改变，α-螺旋含量减少，使240nm附近的吸收峰发生红移。同时由于体系pH值的降低，出现蛋白质肽链的伸展现象，血清白蛋白的结构改变，使得包围在白蛋白分子内部的色氨酸，酪氨酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来，疏水基之间作用增强，跃迁能量增大，从而导致285nm吸收峰发生红移【26】。 有文献报道[27]，BSA分子中主要的结合部位可能是距 BSA的N端的第 56-57 (Asp —Asp>，170-171(Glu—Asp>，362-363(Asp—Asp>和560-561(Asp—Asp>的氨基酸羧基，而其它部位的残余-CO0-基为弱结合点。由于这些点的配位诱导引起BSA构象变化，α-螺旋含量减少，从而吸收峰位置产生红移。 3.1.2 不同浓度BSA下体系的紫外光谱图 1-12 BSA浓度为1×10-5mol/L、2×10-5 mol/L、3×10-5 mol/L、4×10-5 mol/L、1×10-4 mol/L、2×10-4 mol/L、3×10-4 mol/L、4×10-4 mol/L、8×10-4 mol/L、1.2×10-3 mol/L、1.6×10-3 mol/L、2.0×10-3 mol/L 由图中可观察到在BSA浓度为3×10-5 mol/L时吸光度最大。 3.1.3不同浓度的硝酸铅条件下体系的紫外光谱图 1-13铅离子浓度：0，1×10-6mol/L，2×10-6 mol/L，3×10-6 mol/L，1×10-5 mol/L，2×10-5 mol/L，4×10-5 mol/L，5×10-5 mol/L，2×10-4 mol/L，4×10-4 mol/L，2×10-3 mol/L，4×10-3 mol/L，2×10-2 mol/L 紫外图谱分析可知BSA显示了蛋白质的特征吸收带，其峰位置为285 nm，随着铅离子浓度的不断加入，在285 nm附近吸收峰是其肽键上色氨酸和酪氨酸的芳杂环π-π*跃迁引起的。当加入铅离子时，铅离子与 BSA结合使蛋白质的分子构象发生变化。 3.1.4离子强度的影响 1-8Nacl的浓度依次为0，0015mol/L，0.003 mol/L，0.0045 mol/L，0.002 mol/L，0.0025 mol/L，0.005 mol/L，0.01 mol/L，0.015 mol/L 图中可以看出当Nacl的浓度0.0045 mol/L时体系的荧光光谱图比较稳定，吸光度大，故选择为Nacl的浓度0.0045 mol/L最佳实验浓度。 离子浓度对铅离子和牛血清蛋白的反应有很大影响，离子浓度过高或过低都不会达到理想的实验目的，因为无论是对人体有益的还是有害的元素，它们在体内都有一个相当恒定的浓度范围，任何一种元素浓度过高或过低都将对人体产生不良影响，而且蛋白质本身还存在盐析作用，因此在实验过程当中应该选择一适当的离子浓度范围，才能得到较好的实验结果。 3.2 荧光图谱 A-H铅离子浓度分别为0，1×10-6mol/L，2×10-6mol/L， 1×10-5mol/L，2×10-5mol/L，2×10-4mol/L，4×10-4mol/L,2×10-3 mol/L 蛋白质的内源荧光主要来自于分子中的色氨酸残基和酪氨酸残基，其荧光主要来自第212位的色氨酸残基。在280nm光激发下，BSA分子中的内源荧光发射峰位于350nm附近。图为固定BSA浓度，体系荧光发射光谱随铅离子浓度改变的荧光光谱图谱的变化规律，从图中可见，随着加入的铅离子量的增加，峰形无显著变化，但发射波长有蓝移趋势<5nm），荧光强度有规律地降低，说明铅离子对BSA的荧光有猝灭作用。 3.3红外光谱图 蛋白质的二级结构是指蛋白质分子中多肽链本身的折叠方式，比如α-螺旋、β-折叠、β-转角等，酰胺 I带及酰胺Ⅲ带(1240cm-1>，在一定程度上能反映蛋白质二级结构的变化，且酰胺 I带对蛋白质分子二级结构变化更敏感，酰胺 I带的变化可近似地表征蛋白质分子二级结构的类型。 酰胺基团的特征振动 蛋白质固态与水溶液、重水溶液中二级结构成分归属主频率/cm-1结构成分固态水溶液* 重水溶液* α-helix1646+1.0 1656+2.0 1653+4.0 α-helix1653+3.0 / / α-helix1635+1.0 / / β-sheet1620+2.0 1624+0.5 1624+4.0 β-sheet/ 1632+1.0 1631+3.0 β-sheet/ 1638+1.0 1637+3.0 转角1690+1.0 1666+1.0 1663+4.0 转角1668+1.0 1672+1.0 1671+3.0 转角1683+1.0 1680+1.0 1683+2.0 转角1675+1.0 1688+1.0 1689+2.0 转角1694+0.5 1694+2.0 无序结构/ 1650+1.0 1645+4.0 注：*数据来源参见《蛋白质结构分析》， 阎隆飞 孙之荣 主编，清华大学出版社，1999，北京 3.3.1 铅离子存在的红外光谱图 1642.821385.16 1546.481650.05 3436.94 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100%透过率 1000 2000 3000 4000 波数 (cm-1) ——牛血清蛋白溶液 ——含4×10-4mol/LPb 离子时牛血清蛋白溶液 在 BSA 缓冲液中分别加入不同浓度的铅离子，其他条件保持不变。测量得到图谱当加入一定量的Pb 离子时，BSA 的谱峰峰形的变化，图中可见，加入铅离子后，BSA 酰胺I 带l650cm -1和Ⅱ带1546cm -1的相对强度发生明显变化，说明BSA 和Pb 离子反应后，BSA 分子结构发生了变化。BSA 有三个可能结合的位置，即羧基的氧，氨基的氮和酰基的氮。络合物中1615.45cm -1处的强吸收峰可归属为侧链COO -或其金属络合物COOM 中COO -的反对称伸缩振动，而1739.57cm -1处的峰是由侧链COOH 或COOR 中的C=O 伸展振动引起的，对应于血红蛋白中1732.29cm -1处的弱宽峰。这些都表明结果表明，铅离子的结合引起血红蛋白二级结构的较大变化，且铅离子可能结合在氨基酸残基的羰基或羧基上。3.3.2红外二阶导数 体液免疫球蛋白测定 第一节血清IgG、IgA、IgM测定 血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM定量测定方法一般有单向环状免疫扩散法、火箭免疫电泳法、ELlSA、免疫比浊法、放射免疫分析法等。临床常用单向环状免疫扩散法和免疫比浊法来测定血清免疫球蛋白含量。 一、血清IgG、IgA、lgM测定 （一）单向环状免疫扩散法 该法的原理是将抗血清均匀地分散于琼脂或琼脂糖凝胶内，胶板上打孔，孔内注入抗原或待测血清，抗原在含有抗血清的胶内呈放射状（环状）扩散，在抗原抗体达到一定比例时形成可见的沉淀环。在一定条件下，抗原含量越高，沉淀环越大。 （二）免疫比浊法 该法具有检测范围宽、测定结果准确、精密度高、检测时间短（一般在几分钟内即可完成测试）、敏感度高、稳定性好等优点。 二、血清IgG、IgA、IgM测定的临床意义 （一）年龄 新生儿可由母体获得通过胎盘转移来的IgG，故血液中含量较高，接近成人水平。 （二）免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均升高 慢性肝脏疾病如慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、隐匿性肝硬化患者血清中可见3种Ig均升高。慢性细菌感染如慢性支气管炎、肺结核，血IgG可升高。宫内感染时脐血或出生后的新生儿血清中IgM含量可增高。SLE患者以IgG、IgA升高较多见。类风湿关节炎患者以IgM增高为主。 （三）单一免疫球蛋白升高 主要是指患者血清中某一类免疫球蛋白含量显著增多，大多在30g／L以上，这种异常增多的免疫球蛋白其理化性质十分一致，称为单克隆蛋白（MP）即M蛋白。此类异常增多的免疫球蛋白多无免疫活性，故又称副蛋白。由它所致的疾病称为免疫增殖病如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤、重链病、轻链病等。 （四）免疫球蛋白降低 先天性低Ig血症，主要见于体液免疫缺陷病和联合免疫缺陷病。IgA缺乏患者，易发生反复呼吸道感染。IgG缺乏患者，易发生化脓性感染。IgM缺乏患者，易发生革兰阴性细菌败血症。 第二节血清IgD和IgE测定 正常人血清中IgD含量很低，仅占血清免疫球蛋白总量的0.2%。膜结合型IgD（mIgD）构成BCR，是B 细胞分化发育成熟的标志。未成熟的B细胞仅表达mIgM，成熟B细胞可同时表达mIgM和mIgD。活化的B 细胞或记忆B细胞其表面的mIgD逐渐消失。 IgE是正常人血清中含量最少的免疫球蛋白，要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌。其重要特征为糖含量高达12%。IgE为亲细胞抗体，可引起Ⅰ型超敏反应。IgE可能与机体抗寄生虫免疫有关。 第1页 细胞培养法检测新生牛血清病毒 1原理 某些病毒在其敏感的宿主细胞内增殖时，可引起细胞病变，即出现细胞变圆、细胞破裂、细胞融合等现象。细胞培养法的主要特点是：广泛的适用性、操作方法简单、成本较低并且该技术方法成熟。主要缺点是：特异性差、敏感性较低、检测速度慢。该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。将Vero细胞均匀分为至少3份，分别加入以上供试品。然后再适宜的温度条件下培养，每日进行观察，最多观察21天并记录细胞病变情况。 2材料和方法 2.1材料 2.1.1病毒 牛腹泻病毒；狂犬病毒；牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、呼肠孤病毒。 2.1.2细胞 Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所 2.1.3试剂 无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用； MEM培养基：细胞基础培养基； 胰蛋白酶：消化细胞。 2.1.4仪器设备 ①专门的病毒实验室:生物安全柜(CBK一D201)操作，符合国家生物安全要求； ②洁净工作台； ③倒置显微镜； ④冰箱； ⑤离心机； ⑥离心管、注射器、吸管。 2.1.5阳性病毒 将BVDV等，六种病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/mL以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。 2.2方法 2.2.1非血吸附病毒检查是指利用传统的细胞培养或利用其他的对不具有动物血细胞吸附性质的病毒进行检测方法的统称。 2.2.2细胞制备 以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。 2.2.3供试品检测 取良好单层细胞培养瓶，弃掉Vero细胞旧营养液，在方瓶中分别加入胰蛋白酶消化液0.8mL，待可见细胞面呈松散状态，弃掉胰蛋白酶消化液，方瓶中分 免疫比浊法检测免疫球蛋白 一、实验目的 利用免疫比浊法绘制标准曲线，并检测样品中免疫球蛋白的浓度。（本小组检测的为IgG样品） 二、实验原理 1.抗原抗体反应(Antigen-antibody reaction)：抗原与其刺激机体产生的相应抗体在体内或体外发生特异性结合的反应。反应特点有：特异性、比例性、可逆性、敏感性。影响因素有：电解质、温度、酸碱度。 2.免疫比浊法：合适比例的抗原抗体形成的免疫复合物，在PEG作用下形成微粒，使样品浊度发生变化。当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱，根据光的强度改变可测得微粒浓度。 分类：①透射比浊法（Transmission tubidimetry）当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于被不溶性免疫复合物吸收而减弱，故在一定范围内吸光度与免疫复合物量呈正相关。当抗体浓度固定（过量），样品的浊度与其中所含抗原量成正比。（特点）透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的时间较长。②散射比浊法（Nephelometry）光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光，其强度与复合物的数量和散射夹角成正比，与光的波长成反比。（特点）优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。 本实验采用透射法。 3.聚乙二醇PEG的作用：在免疫反应中，为增强抗原抗体反应常使用增聚剂，3~4％的聚乙二醇，可破坏抗原抗体的水化层，促进抗原抗体靠近反应，但如浓度不适合，会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。 三、实验材料 免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)测定试剂(试剂1[PEG]，试剂2[羊抗人IgA, IgG]）（1管/每组）免疫球蛋白A, G(IgA,IgG)校准品，蒸馏水，血清样本（1管） 微量加样枪、ep管（1.5mL离心管） 酶标仪、水浴箱 四、实验步骤 1.在7个EP管中各加250μL IgG试剂1（PEG）。 2.7管分别加入蒸馏水、校准品原液、1：2校准品、1：4校准品、1：8校准品、1：16校准品、样本各2μL。 3.混匀后37℃水浴5min。 4.7管各加入85μL IgG试剂2（羊抗人IgG）。 5.混匀后37℃水浴10min。 6.分别吸取200μL至96孔酶标板中，用酶标仪在700nm处读取OD值。 五、实验结果与数据处理 2.标准曲线 牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中类牛血清白蛋白残留检测的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛的牛血清白蛋白残留检测水平。用纯化的牛的牛血清白蛋白残留检测抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入类牛血清白蛋白残留检测，再与HRP标记的类牛血清白蛋白残留检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的类牛血清白蛋白残留检测呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛的牛血清白蛋白残留检测浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成48孔配置96孔配置保存 说明书1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1个1个 酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存 标准品：2700ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 细胞生长促进试验筛选新生牛血清 高丽美 陈俊斐 颜建国 冯敏 许玲敏 忻亚娟 陈念良 庄成 摘要 目的 建立适合人二倍体细胞培养血清的筛选方法。方法 通过测定细胞倍增时间和进行细胞 生长促进试验对15批次的新生牛血清作了筛选,并将筛选出的11批次血清用于大规模细胞培养,观察细胞的生长维持情况。结果 发现细胞倍增时间与相对生长率无明显相关性(P>0 05)。在大规模细胞培养中,相对生长率97%以上的血清更适合二倍体细胞生长。结论 细胞生长促进试验比细胞倍增时间测定更能客观地反映血清促人二倍体细胞的生长能力。细胞生长促进试验可能是较佳的,筛选适合人二倍体细胞培养的血清的方法 关键词:新生牛血清;细胞倍增时间;细胞生长促进试验;人二倍体细胞中图分类号:R33 文献标识码:A 文章编号:1007 0931(2008)08 0012 02 Screening of Newborn Calf Serum by the Method of C ell Growth Promotion Assay GAO li mei,CHEN Jun fei,Y AN Jian guo ,et al.(Zhe jiang Acade my o f Medic al Scie nce s ,Hangzhou ,Zhe jiang ,310013,China.) Abstract O bjective To establish a screening method of serum suitable for c ulture of human diploid cells.Methods Two methods of determination of cell doubling time and cell growth promotion ass ay were us ed to screen the ne wborn calf serum (NCS).A total of 11i n 15different batches of NCS were selec ted and used for large scale cell culture so as to obs erve the cell growth s tatus.Results There was no significant correlati on between the cell doubling time and relative growth rate (P>0 05).The NCS which the rel ative growth rate of cells cultured in was above 75%was more sui table for the growth of human diploid cells in large scale culture.Conclus ion The me thod of Cell growth promotion ass ay is better than the one of determination of cell doubling ti me in reflecti ng the growth ability of human dipl oid cells in the serum.Cell gro wth promotion as say is a more s uitable method for screening NCS used for human diploi d cells cul ture. K ey words Newborn calf serum;Cell doubling ti me;Cell growth promotion as say;Human diploid cell 作者单位:浙江省医学科学院,浙江杭州 310013 在细胞培养中,新生牛血清(NBCS)具有极其重要的作用,但由于血清是一种很复杂的混合物,往往会因小牛产地、出生后采血时间等不同,造成其批次间质量的差异[1],所以众多应用新生牛血清进行生产的企业,会通过各种筛选方法,选择适合本企业细胞培养的、质量稳定的血清。本实验拟通过对细胞倍增时间测定,生长促进试验两种筛选方法进行比较,以建立适合人二倍体细胞培养的最佳血清的筛选方法。 材料与方法 1 新生牛血清 15批次筛选新生牛血清分别由杭州四季青生物工程材料有限公司,郑州佰安生物工程有限公司,兰州民海生物工程有限公司提供。对照新生牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司提供。 2 人胚肺二倍体细胞 人胚肺二倍体细胞(KMB17)由本 所细胞室提供。 3 细胞培养液 由本所配液室提供。 4 细胞倍增时间测定[2] 4 1 人胚肺二倍体细胞(KMB17),代数23代,经胰蛋白酶消化,加入含10%筛选血清细胞培养液,细胞计数,按1!104/ml 的细胞浓度接种于24孔板,每批血清接种8孔,5%C O 2培养箱37?培养,每天计数1孔细胞,连续观察1周。 4 2 细胞倍增时间的测定,取细胞峰值前一天计得数(Y)、接种细胞数(X)及生长时间(T)计算倍增时间,倍增时间=T/A A=log 2Y /X 。 5 细胞生长促进试验[3] 5 1 人胚肺二倍体细胞(KMB17),代数23代,经胰蛋白酶消化,加入无血清的细胞培养液,将细胞浓度调至2!105,取9 5ml 注入25cm 2塑料瓶,再加入0 5ml 待筛选或对照血清,配制成5%血清浓度的生长液,每批血清培养3瓶,37?培养。 5 2 7d 后,细胞经胰蛋白酶消化,将每批血清的3瓶细胞 标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl （0.9%NaCl）配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理（）。 2、移液管使用（）。 （三）、标准曲线制作： 1、 2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、 40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。 1）、利用标准曲线查出回归方程。 2）、用公式计算回归方程。 3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。 （五）、注意事项： 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。 蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型： ●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。 第一节免疫球蛋白的结构（The Structure of Immunoglobulin) B淋巴细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞，产生能与相应抗原发生特异性结合的免疫蛋白，这类免疫球蛋白被称为抗体（antibody, Ab）。 1937年，Tiselius用电泳方法将血清蛋白分为白蛋白、α1、α2、β及γ球蛋白等组分，其后又证明抗体的活性部分是在γ球蛋白部分。因此，相当长一段时间内，抗体又被称为γ球蛋白（丙种球蛋白）。 实际上，抗体的活性除γ球蛋白外，还存在于α和β球蛋白处。1968年和1972年的两次国际会议上，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。 Ig是化学结构的概念，它包括正常的抗体球蛋白和一些未证实抗体活性的免疫球蛋白，如骨髓瘤病人血清中的M蛋白及尿中的本周氏（Bence Jones, BJ）蛋白等。 免疫球蛋白可分为分泌型（secreted Ig,SIg）和膜型（membrane Ig, mIg）。前者主要存在于血清及其他体液或外分泌液中，具有抗体的各种功能；后者是B细胞表面的抗原识别受体。 ☆☆相关素材☆☆ 图片正常人血清电泳分离图 一免疫球蛋白的基本结构 The basical structure of immunoglobulin 免疫球蛋白分子是由两条相同的重链（heavy chain，H链）和两条相同的轻链（light chain，L链）通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。 X射线晶体结构分析发现，IgG分子由3个相同大小的节段组成，位于上端的两个臂由易弯曲的铰链区（hinge region）连接到主干上形成一个"Y"形分子，称为Ig分子的单体，是构成免疫球蛋白分子的基本单位。 牛血清在细胞培养中的作用与质量要求． 牛血清在细胞培养中的作用与质量要求 生物技术已经被世界各国视为一种高技术，在整个科学技术中占据了特殊的显著地位， 特别是生命科 学的发展更离不生物技术，生命科学的发展备受各国的重视。我国在很多大学中都设立了生命科学院。现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医 药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。细胞培养的发展，培养基的质量又是关键，而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的，所以牛血清是医药生物技术产品中重要的原材． 料之一。保证牛血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。 一、牛血清在细胞培养基中的主要功能 牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。 1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的 低分子营养物。 2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。 3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和 热原质结合，起到解毒作用。 4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。 5.起酸碱度缓冲液作用。 6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。 二、牛血清的主要成份 血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及生理条件和营养条年龄、随供血动物的性别、含量常． 件不同而异。 1.蛋白质是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白， 深圳中企智业投资咨询有限公司 新生牛血清行业产品价格分析 (最新版报告请登陆我司官方网站联系) 公司网址: https://www.360docs.net/doc/c617657853.html, 1 目录 新生牛血清行业产品价格分析 (3) 一、新生牛血清产品价格特征 (3) 二、2010-2014年中国新生牛血清产品价格走势 (3) 三、主流产品价位调查 (4) 四、价格与成本及其它因素的关系 (4) 五、重点企业价格策略分析 (5) 六、2015-2019年中国新生牛血清产品价格走势预测 (5) 2 新生牛血清行业产品价格分析 一、新生牛血清产品价格特征 我国新生牛血清生产企业数十家，大部分企业规模较小，不同品牌价格有一定的差距。国内新生牛血清产品市场上进出口品牌并存，进口品牌价格昂贵，大大高于国产品牌。一方面进口产品过高的价格令普通消费者望而却步，一方面质低价廉的产品又不能适应中层消费者的需求。消费者呼唤适合中国市场的品牌引领消费。 我国新生牛血清行业发展较晚，最初的国新生牛血清市场完全依靠进口来满足行业需求，随着国家政策的大力支持，下游行业的需求前景，我国新生牛血清生产企业发奋图强，不断提高技术水平，研发出了一系列国产产品。进口新生牛血清产品价格昂贵，质量较高，而国产品牌价格较低，质量水平不高，有待改善。随着国产产品的增多，整体市场价格呈现降低趋势。 二、2010-2014年中国新生牛血清产品价格走势 图表1：2010-2014年我国新生牛血清市场平均价格走势 单位：元/ml 数据来源：千讯咨询 3 三、主流产品价位调查 图表2：2014年主要品牌新生牛血清产品价位分析 数据来源：公司资料 四、价格与成本及其它因素的关系 新生牛血清行业上游原材料主要是牛等，相较其他制造业来说，原材料在整个生产成本中较小。原材料价格的波动将影响新生牛血清公司生产成本进而影响新生牛血清公司的盈利水平。 近几年来，国内新生牛血清行业生产成本不断上涨，造成部分中小企业经营困难，国内生产成本提高主要有四个方面的原因：一是原材料价格上涨比较明显，媒体报道得也比较多；二是企业用工成本的上涨，可以说全国不少地方劳动力成本都在上升；三是像能源比如煤、电等资源价格上涨，影响企业生产经营；四是企业融资成本上升，比如由于利率上调，中小企业贷款利率上浮提高，中小企业通过民间借贷的利率也在上升，所以整个融资成本是上升的。 原材料价格上涨、能源和资源成本的大幅上涨、用工成本的增加，以及企业管理费用的提高等是新生牛血清产品价格上涨的主要原因。 通常原材料涨价的成本应该通过产业链向下传导，这支持了新生牛血清产品价格上涨，但最终决定价格涨跌的关键是供求关系。一些本来应该提价的产品价格提不上去，正是因为这些产品本身产能增加，竞争很激烈，价格上涨乏力。 4 血清免疫球蛋白测定 B-淋巴细胞受抗原刺激后，引起一系列细胞形态与生化特性变化，转化为淋巴母细胞并增生繁殖，最后演化为浆细胞，合成免疫球蛋白。免疫球蛋白普遍存在于生物体的血液、体液、外分泌液及某些细胞（如淋巴细胞）的细胞膜上。免疫球蛋白是一组具有抗体特性的球蛋白，其分子量很大，含有1000个以上的氨基酸分子，均由其共同抗原的两个相同的轻链（L链）和具有特异性抗原的两个不同的重链（H链）组成。 1分类 根据重链的氨基酸组成不同，免疫球蛋白可分为分五类：免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。 1.1IgG IgG是人体的主要免疫球蛋白，也是唯一能通达胎盘的免疫球蛋白。根据IgG的重链氨基酸顺序的差别，可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4各亚类。IgG是主要抗感染抗体，对各种细菌、病DU有抗体活性，并有激活补体的作用。 1.2IgA IgA是分泌液中主要抗体，可分为IgA1和IgA2两个亚类。存在于血清中的称血清型IgA，存在于泪液、乳汁、胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道分泌液中的称分泌型IgA，对局部粘膜有抗菌和抗病DU作用。 1.3IgM IgM可分为IgM1和IgM2两个亚类。是抗原刺激最先产生的免疫球蛋白，有较强的固定补体、溶解细菌及细胞的能力。IgM是抗革兰氏阴性菌和异体红细胞的主要抗体，也是存在于B淋巴细胞表面的主要免疫球蛋白。 1.4IgD 其作用与过敏反应有关。据报道，IgD可对某些抗原起反应，如青霉素、胰岛素、核抗原、甲状腺抗原等。它存在于B淋巴细胞表面，构成早期的膜受体，具有识别抗原，制动B淋巴细胞的分化作用。 1.5IgE 与I型变态反应有关，具有亲细胞特性。IgE通过Fc段与肥大细胞、嗜碱粒细胞上的Fc受体结合，故属亲同种细胞性抗体。当机体再次接触同种抗原后，过敏原即与结合在细胞表面的IgE作用，使细胞释放介质，引起平滑肌痉挛，血管通透性增加等过敏反应，还具有抗寄生虫感染作用。 2正常参考值 IgG：8～16g/L，IgA：1～4g/L，IgM：0.5～1.9g/L，IgD：0.01～0.4g/L，IgE：0.001～0.009g/L。 3临床意义 3.1血清免疫球蛋白降低 血清免疫球蛋白水平取决于免疫球蛋白合成和分解代谢的速率以及由体内丢失的程度。血清免疫球蛋白降低可由于合成不足，丢失 血吸附法检测新生牛血清病毒 1原理 有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。取两瓶细胞，分别加入供试品。然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。 2材料和方法 2.1材料 2.1.1病毒 牛副流感病毒。 2.1.2细胞 Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所； 2.1.3试剂 无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用； MEM培养基：细胞基础培养基； 0.85%生理盐水：洗脱血细胞； 胰蛋白酶：消化细胞； 鸡血； 豚鼠血。 2.1.4仪器设备 ①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求； ②洁净工作台； ③倒置显微镜； ④冰箱； ⑤离心机； ⑥离心瓶、注射器、吸管。 2.1.5阳性病毒 将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。 2.2方法 2.2.1细胞制备 以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。 2.2.2红细胞悬液配制 取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离 药典三部(2015版)-通则-3604 新生牛血清检测要求． 3604 新生牛血清检测要求 本品系从出生14小时内未进食的新生牛采血分离血清，经除菌过滤后制成。牛血清生产过程中不得任意添加其他物质成分。新生牛血清应进行以下检查，符合规定后方可使用。 如采用经过验证的病毒灭活工艺处理的牛血清，大肠杆菌噬菌体及病毒检测必须在灭活前取样进行。 pH值应为7.00～8.50。 蛋白质含量采用双缩脲法（通则0731第三法）或其他适宜方法测定，应为35～50g/L。 血红蛋白用分光光度法或其他适宜的方法测定，应不高于 200mg/L。 以蒸馏水为空白对照，使用1cm光路的比色杯，直接测定供试品在576nm、623nm及700nm波长下的吸光度值，每个供试品至少测定2次，计算平均测定值。按照下式计算供试品中血红蛋白含量： 血红蛋白含量（mg/L）=[(A×115)－(A×102)－(A×39.1)]×10 700623576式中 A、A、A为供试品在576nm、623nm及700nm波长下700623576的平均吸光度值。 渗透压摩尔浓度应为250～330mOsmol/kg（通则0632）。 细菌内毒素检查应不高于10EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。支持细胞增殖检查用Sp2/0-Ag14或适宜的传代细胞进行。细胞复苏后，用待测样品配制的培养液至少连续传三代后使用，取对数 生长期的细胞用于试验。 （1）细胞生长曲线的测定取供试品按10%浓度配制细胞培养4的细胞浓度接种细胞，每天计数活细胞，连续观含10液，按每1ml6/ml。察1周，并绘制生长曲线，细胞的最大增殖浓度应不低于10（2）细胞倍增时间的测定按生长曲线计算细胞的倍增时间。取细胞峰值前一天的细胞计数（Y）、接种细胞数（X）及生长时间（T）计算。 免疫球蛋白I g E This manuscript was revised on November 28, 2020 免疫球蛋白IgE 免疫球蛋白lgE（人体的一种抗体），存在于血中。是正常人血清中含量最少Ig，可以引起I型超敏反应 球蛋白偏高，与慢性肝病，机体免疫系统有关。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（γ-球蛋白）中。可分为五类，即免疫球蛋白G （IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，约占人血浆丙种球蛋白的70%，分子量约15万，含糖2～3%。IgG分子由4条肽链组成。其中分子量为2.5万的肽链，称轻链，分子量为5万的肽链，称重链。轻链与重链之间通过二硫键（—S—S—）相连接。免疫球蛋白是机体受抗原（如病原体）刺激后产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害，使病原体失去致病作用。另一方面，免疫球蛋白有时也有致病作用。在慢性乙肝患者，长期白、球比例倒置，警惕有肝硬化迹象免疫球蛋白Ig的医学定义是具有免疫功能或结构与抗体相似的球蛋白，其基本结构是：两条相同的重链和两条相同的轻链由链间二硫键连接而成。重链根据恒定区中氨基酸种类和排列顺序不同分为5种：α，γ，δ，ε，μ。分别对应5种含相应重链的免疫球蛋白：IgA,IgG,IgD,IgE,IgM。 血清免疫球蛋白E(IgE)又称为反应素，是血清中含量最少的一类免疫球蛋白，只占血清总量的0.001%。IgE测定用国际单位IU或ng表示， 1IU=2.4ng，相当于WHO标准冻干血清制剂0.00928内所含的IgE量。 IgE是正常人血清中含量最少的Ig，正常浓度是5×10的-5次方 mg/ml。正常人群IgE水平受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响，各家各医院的正常值相差甚远。它是一种亲细胞抗体，与具有吞噬作用的肥大细胞，嗜中性粒细胞(可以吞噬被细菌，病毒等有害病原体感染的细胞)有很高的亲和力。因此可以介导Ⅰ型超敏反应，即我们平时所说的过敏反应。此外，IgE可能与抗寄生虫感染有关。 一般大于100-333IU/ml（ku/L）即大于250-800ng/ml(μg/L)即表现为增高，主要见于过敏性体质及过敏性疾病，如哮喘、过敏性鼻炎、荨麻疹等。 作用[J ].解放军医学杂志,2004,29(8):703-706. [3]李 毅,戚好文,刘颖格,等.氟伐他汀对大鼠气道平滑肌增生 的影响[J ].第四军医大学学报,2003,24(6):2089-2093. [4]王文建,杨 莉,王西华,等.川芎嗪对大鼠支气管哮喘模型气 道重塑的影响及机制[J ].中华结核和呼吸杂志,2004, 27(12):833-836. [5]B lack JL,Roth M ,Lee J,et al .Mechanis m s of air way re modeling: A ir way s mooth muscle [J ].Am J Res p ir Crit Care Med,2001,164(10):63-66. [6]葛守一,梅长林,徐成刚.羟甲基戊二酰辅酶A 还原酶抑制剂对 多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖抑制及其机制的研究[J ].中华肾脏病杂志,2002,18(1):49-53. [7]Cerez o 2Guisado M I,Garcia 2Marin LJ,Lorenz o MJ,et al .Lovastatin inhibits the gr owth and survival pathway of phos phoinositide 32ki 2nase /p r otein kinase B in i m mortalized rat brain neur oblasts [J ].J Neur ochem,2005,94(5):1277-1287. [8]Amm it AJ,Panettieri Jr .The circle of life:Cell cycle regulati on in air way s mooth muscle [J ].J App l Physi ol,2001,91(3): 1431-1437. 编辑 杨湘华 ?经验交流? 文章编号:100022790(2007)0720640201血清蛋白质组样品处理方法的比较分析 刘希成,梁 恒,田 真,张 霖,陈 阳 (西安交通 大学生命科学与技术学院分离科学研究所,陕西西安 710049) 收稿日期:2006212212; 接受日期:2007202210基金项目:国家自然科学基金(90209016) 通讯作者:梁 恒.Tel:(029)82663992Email:lheng@mail .xjtu .edu .cn 作者简介:刘希成.博士生(导师梁 恒).Tel:(029)82663992 Email:xichengliu@mail .xjtu .edu .cn 【关键词】双向电泳;蛋白质组学;血清【中图号】Q51 【文献标识码】B 1 材料和方法 应用Affinity 2blue gel 和Pr otein A 分别去除 人血清中的白蛋白和I gG .将未做处理的血清以及去除白蛋 白和I gG 的血清各400μg 与水化液混合,参照G rg 等[1] 的方 法进行双向凝胶电泳(t w o 2di m ensi onal polyacryla m ide gel elec 2 tr ophoresis,22DE )检测,实验重复3次.扫描获取谱图,用P DQuest 分析软件进行图像分析,选取表达量差异2倍以上的 蛋白点进行质谱分析,获得其肽质量指纹图(P MF ),用Pr o 2 found P M F 数据库查询软件在NCB I nr 蛋白数据库中进行蛋白 的检索. 2 结果 P DQuest 软件对22DE 谱图进行匹配和统计分析, 发现未做处理血清、去除白蛋白及I gG 的血清的平均蛋白质点分别为(482±18)个和(523±29)个.从谱图中发现,去除白蛋白及I gG 后,M r =30000～70000区域内蛋白点的丰度明显提高,高丰度蛋白富集区的蛋白丰度明显下降,但其它区域的部分蛋白丰度也随之下降或者丢失.切取在去除白蛋白及 I gG 过程中丢失和新出现的9个蛋白点(Student πs 2t 检验差异 显著,P <0.05),胶内酶解后进行MALD I 2T OF 2MS 分析,成功鉴定了这些差异蛋白点为8种蛋白质.在这些鉴定的差异蛋白点中,出现在未做处理血清中的蛋白有5个,其中2个蛋白点鉴定为同一种蛋白,分别为维生素A 结合蛋白,可溶性尿激 酶血纤维蛋白溶酶原激活剂受体,蛋白激酶1抗原和血清白蛋白.出现在去除白蛋白和I gG 的血清中的蛋白有4个,分别为NADH 脱氢酶辅酶β,肌动蛋白结合蛋白M1,T 细胞活性受体β和血小板生长因子C . 3 讨论 应用Affinity 2blue gel 和Pr otein A 分别去除白蛋白 和I gG 已经成为血清蛋白质组学研究中一种常用的前处理方法[2].本研究应用蛋白质组学方法比较分析了人未做处理血清和去除白蛋白及I gG 的血清,鉴定了8种差异表达的蛋白质,其中7种为低丰度功能蛋白.蛋白功能分析发现,维生素 A 结合蛋白是一种与视觉感知和物质传递相关的胞外蛋白. 可溶性尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活剂受体定位于质膜,具有血液凝聚、细胞表面信号转导的功能.蛋白激酶1抗原是由醛还原酶的C OVA1基因编码生成的,与细胞生长、电子传递和mRNA 拼接等功能相关[3].NADH 脱氢酶辅酶β由线粒体分泌到胞外,具有电子传递功能.T 细胞活性受体β与T 细胞信号通路和细胞防御等功能相关.血小板生长因子C 与血小板生长因子前体相关,定位于胞外,除与血小板受体信号通路相关,还与细胞增殖等其它生物功能相关[4]. 我们的实验结果表明,去除高丰度蛋白时可以增强一些低丰度功能蛋白的检测,但由于非特异性吸附的存在,也会导致部分功能蛋白的丢失.因此,我们认为在分析具体病例的血清时,应采用不同的方法对样品进行处理后再分别进行实验,并将结果综合起来全面地加以分析.【参考文献】 [1]G rg A,W eissW ,Dunn MJ.Current t w o 2di m ensi onal electr ophore 2 sis technol ogy for p r oteom ics [J ].Pr oteom ics,2004,4(12): 3665-3685. [2]Hu S,Loo JA,Wong DT .Human body fluid p r oteome analysis [J ]. Pr oteom ics,2006,6(23):6326-6353. [3]庞月华,杨望平.丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶21和p38在内膜 损伤后血管平滑肌细胞表型转化过程中的表达变化[J ].临床心血管病杂志,2006,22(9):36-40. [4]Campbell JS,Hughes S D,Gilberts on DG,et al .Platelet 2derived gr owth fact or C induces liver fibr osis,steat osis,and hepat ocellular carcinoma [J ].Pr oc Natl Acad Sci US A,2005,102(9): 3389-3394. 编辑 杨湘华 46第四军医大学学报(J Fourth M ilMed Univ )2007,28(7) htt p://j ournal .f mmu .edu . cn \ 全国牛血清生产企业达标检查手册 中国医药生物技术协会 医药生物技术产品质量控制专业委员会动物血清学组 二○○九年十月二十四日修订 编辑说明 一、根据SFDA药监注函【2001】129号文“关于下发《全国牛血清质量管理研讨会纪要》的通知”精神和2009年4月26日《全国新生牛血清质量管理座谈会纪要》，结合我国的实际情况制定本手册。 二、本手册以2007年SFDA《药品GMP认证检查评定标准》为依据，把检查的重点落在：溯源；强调牛血清供血点的管理；洁净室（区）布局合理，完善洁净室（区）空气净化系统，完善工艺用水系统；以批号为主线，全面规范相关的文件、记录；强化质量监管，做好初制品和成品质量检测工作和现场管理，以及开展关键工艺、设备、有关清洁消毒等方面的验证和内部审计等工作内容上。 三、本手册共分机构与人员、厂房与设施、设备、物料、卫生、验证、文件、生产管理、质量管理、产品销售与收回、投诉与处理、内部审核等十二个部分，共162项，其中一般项目62项，重要项目（＊）87项，否决项目（△）13项。 四、检查中发现不符合要求的项目统称为“缺陷项目”。其中，重要项目不符合要求者称为“严重缺陷”，一般项目不符合要求者称为“一般缺陷”，否决项目不符合要求者称为“否决”。 五、在检查过程中，企业隐瞒有关情况或提供虚假材料的，按否决项目处理。检查组应调查取证并详细记录。 六、结果评定 （一）未发现“否决”，且“严重缺陷”≤10%，且“一般缺陷” ≤20%，各类缺陷项目能够立即改正的，企业必须立即改正；不能立即改正的，企业必须提供缺陷整改报告及整改计划，方可通过达标认证。 （二）发现“否决”或“严重缺陷”＞10%或“一般缺陷” ＞20%的，不予通过达标认证。体液免疫球蛋白测定
新生牛血清病毒检测细胞培养法
免疫比浊法检测免疫球蛋白
牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析(ELISA)
细胞生长促进试验筛选新生牛血清
考马斯亮蓝标准曲线制作
蛋白质组学研究方法选择及比较
免疫球蛋白的结构
牛血清在细胞培养中的作用与质量要求
新生牛血清行业产品价格分析报告
血清免疫球蛋白测定.docx
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血清蛋白质组样品处理方法的比较分析
全国牛血清生产企业达标检查手册