USP微生物限度检查 中文
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61）微生物限度检测（MICROBIAL LIMIT TESTS）
此章提供方法来检测可能存在的好氧微生物其他制药过程中可能出现的微生物的数量，包括原材料和成品中的。如果经过验证确认可以得到相同或更好的检测结论，也允许采用自动化的检测方法。在样品检测过程中须进行无菌操作。若无特别说明，则“培养（incubate）”一词指在30—35℃的培养箱内培养24至48小时；“生长（growth）”一词用于专门的判定，说明“存在和可能存在活的微生物”。
准备实验 (Preparatory Testing)
本章涉及实验结果的有效性取决于：提供的被检测样品本身在实验条件下，被充分证明不会抑制可能存在的微生物的生长。因此，在准备样品时，需要正规的实验操作和符合要求的实验条件，接种稀释样品到含有以下（微生物）培养物的培养基：金黄色（奥里斯）葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,大肠埃希氏菌（Escherichia coli）, 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa), 和沙门氏菌（Salmonella）。方法如下：将用肉汤培养基培养24小时后的（微生物）不小于10-3稀释的微生物培养物，加1 ml（微生物）培养液到磷酸(盐)缓冲液(pH 7.2)，液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体乳糖培养基（Fluid Lactose Medium）。相应培养基培养失败则需要采取以下方法更改检测程序：（1）增加稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变；或者
（2）中和一定数量的干扰因子；或者
（3）结合（1）、（2）得出适当条件，
使接种物得以生长。
以下是一些物质的成分和浓度，该物质及浓度可用于加入培养基、阻止物质发挥抑菌作用：大豆卵磷脂（soy lecithin, 0.5%）或者聚山梨醇酯20（polysorbate 20, 4.0%）。然后重复前面的实验，用液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20（Fluid Casein Digest-Soy lecithin-Polysorbate 20 Medium）论证待测样品里的防腐剂或其他抑菌因子被中和。若产品中含有抑菌物质且产品是可溶性的，则采用“无菌实验（Sterility Tests <71>）”里的“薄膜过滤法 (Memb rane Filtration Method)”进行(微生物限度)检测会更适宜（suitable）。
在抑菌物质得以适当中和、稀释液体积大幅度增加后仍不能排除抑制因子，以及不适宜用“薄膜过滤法”的情况下，可能会因为产品本身的杀菌作用导致细菌无法生长。当产品不能检测出接种菌种的情况下，应用光谱法确定产品的抑菌/杀菌成分。
缓冲液和培养基 (Buffer Solution and Media)
按照下列配方配制培养基，或者使用规范厂商生产的培养基干粉进行培养基配制，所使用的干粉培养基应该与在此列出的培养基成分比例相似。
在按列出的配方进行培养基配制时，用水溶解固体物质，必要时可以加热以得到完全溶解的均匀溶液。在使用前用盐酸或氢氧化钠将培养基的pH值调节到要求范围，调节pH值应在
25±2O条件下进行。
PH 7.2 磷酸(盐)缓冲液
储备液——称34g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶，加水500mL溶解。用氢氧化钠TS调节pH 至7.2±0.1（约175mL），然后加水至容量瓶刻度，混匀。分装溶液后灭菌。冰箱保存。
培养基
除另有指出，培养基应在高压灭菌器中加热灭菌。（见<1211>“灭菌”章节中的“蒸汽灭菌”）。保存时间（exposure time）取决于培养基的灭菌体积。
1、液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------20g
大豆卵磷脂---------------------------5g
聚山梨醇酯20-----------------------40mL
水---------------------------------------960mL
将胰腺酪蛋白消化物和大豆卵磷脂溶解于960mL水中，48~50℃水浴加热约30分钟得均匀溶液。加40mL聚山梨醇酯20，混匀，按需要分装。
2、大豆酪蛋白消化物琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------15.0g
大豆粉木瓜蛋白酶消化物---------5.0g (Papaic Digest of Soybean Meal)
氯化钠---------------------------------5.0g
琼脂------------------------------------15.0g
水---------------------------------------1000mL
灭菌后pH值：7.3±0.2
3、液体大豆酪蛋白消化物培养基
按照<71>无菌试验里的方法进行配制。
Soybean Casein Digest Medium under Sterility Tests<71>.
酪蛋白胰酶消化物------------------17.0g
大豆粉木瓜蛋白酶消化物---------3.0g
氯化钠---------------------------------5.0g
磷酸氢二钾---------------------------2.5g
葡萄糖（C6H12O6 H2O）--------2.5g
纯化水---------------------------------1000mL
4、甘露醇-盐琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------5.0g
动物组织胃蛋白酶消化物---------5.0g
牛肉膏---------------------------------1.0g
D-甘露醇------------------------------10.0g
氯化钠---------------------------------75.0g
琼脂------------------------------------15.0g
酚红------------------------------------0.025g
水---------------------------------------1000mL
混匀，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。灭菌后pH值：7.4±0.2
5、 Baird-Parker琼脂培养基
牛肉膏---------------------------------5.0g
酵母膏---------------------------------1.0g
氯化锂---------------------------------5.0g
琼脂------------------------------------20.0g
氨基乙酸（糖胶）------------------12.0g
丙酮酸钠------------------------------10.0g
水---------------------------------------950mL
搅拌加热，煮沸1分钟。灭菌，冷却至45~50℃，然后加入10mL灭菌后的亚碲酸钾（1:100）和50mL乳状蛋黄。轻柔混匀，。。。。。。
6、 Vogel-Johnson 琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g
酵母膏---------------------------------5.0g
甘露醇---------------------------------10.0g
磷酸氢二钾---------------------------5.0g（Dibasic Potassium Phosphate）
氯化锂---------------------------------5.0g
氨基乙酸（糖胶）------------------10.0g
琼脂------------------------------------16.0g
酚红------------------------------------25.0mg
水---------------------------------------1000mL
溶解后煮沸1分钟。灭菌，冷却至45~50℃，然后加20mL灭菌后的亚碲酸钾（1：100）。
灭菌后pH值：7.2±0.2
7、溴棕三甲铵琼脂培养基
白明胶胰酶消化物------------------20.0g
氯化镁---------------------------------1.4g
硫酸钾---------------------------------10.0g
琼脂------------------------------------13.6g
溴棕三甲铵---------------------------0.3g Cetyl Trimethylammonium Bromide (Cetrimide)
丙三醇---------------------------------10.0mL
水---------------------------------------1000mL
将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值：7.2±0.2
8、假单胞菌琼脂培养基检测荧光生二氢荧光素
酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g
动物组织胃蛋白酶消化物---------10.0g
无水磷酸氢二钾---------------------1.5g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）-------1.5g
丙三醇---------------------------------10.0mL
琼脂------------------------------------15.0g
水---------------------------------------1000mL
将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值：7.2±0.2
9、假单胞菌琼脂培养基检测绿脓菌溶素
白明胶胰酶消化物------------------20.0g
无水氯化镁---------------------------1.4g
无水硫酸钾---------------------------10.0g
琼脂------------------------------------15.0g
丙三醇---------------------------------10.0mL
水---------------------------------------1000mL
将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值：7.2±0.2
10、液体乳糖培养基
牛肉膏---------------------------------3.0g
白明胶胰酶消化物------------------5.0g
乳糖------------------------------------5.0g
水---------------------------------------1000mL
灭菌后需尽快冷却。
灭菌后pH值：6.9±0.2
11、液体亚硒酸-双硫丙氨酸（胱氨酸）培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------5.0g
乳糖------------------------------------4.0g
磷酸钠---------------------------------10.0g
亚硒酸钠------------------------------4.0g
L-胱氨酸------------------------------10.0mg
水---------------------------------------1000mL
终pH：7.0±0.2
混匀后加热得均匀溶液。在流动蒸汽中加热15分钟，不可灭菌。
12、液体连四硫酸盐培养基（四硫磺酸钠亮绿TTB）
酪蛋白胰酶消化物------------------2.5g
动物组织胃蛋白酶消化物---------2.5g
牛胆盐Bile Salts---------------------1.0g
碳酸钙---------------------------------10.0g
硫代硫酸钠---------------------------30.0g
水---------------------------------------1000mL
煮沸溶液使固体物质溶解。使用当天加入5g碘化钾和6g碘到20mL水中配制成的溶液，然后加10mL亮绿（1:1000），混匀。加入亮绿后的溶液不可加热。
13、亮绿琼脂培养基
酵母膏---------------------------------3.0 g
动物组织胃蛋白酶消化物---------5.0g
酪蛋白胰酶消化物------------------5.0g
乳糖------------------------------------10.0g
氯化钠---------------------------------5.0g
蔗糖------------------------------------10.0g
酚红------------------------------------80mg
亮绿------------------------------------12.5g
水---------------------------------------1000Ml
煮沸溶液1分钟使固体物质溶解。使用前灭菌，用融化后的培养基倒平皿，冷却凝固后使用。灭菌后pH值：6.9±0.2。
14、戊醛糖-赖氨酸-脱氧胞啶琼脂培养基
戊醛糖---------------------------------3.5g
L-赖氨酸------------------------------5.0g
乳糖------------------------------------7.5g
蔗糖------------------------------------7.5g
氯化纳---------------------------------5.0g
酵母膏---------------------------------3.0g
酚红------------------------------------80mg
琼脂------------------------------------13.5g
脱氧胞啶钠---------------------------2.5g（Sodium Desoxycholate）
硫代硫酸钠---------------------------6.8g
柠檬酸铁铵---------------------------800mg
水---------------------------------------1000mL
终pH：7.4±0.2。
搅拌加热使固体溶解，加热需恰好到沸点，不可过度加热或灭菌。溶解后立即转移到50℃水浴，在培养基凝固前倒平皿。
15、亚硫酸铋琼脂培养基
牛肉膏---------------------------------5.0g
酪蛋白胰酶消化物------------------5.0g
动物组织胃蛋白酶消化物---------5.0g
葡萄糖---------------------------------5.0g
磷酸钠---------------------------------4.0g
硫酸亚铁------------------------------300mg
亚硫酸铋------------------------------8.0g
琼脂------------------------------------20.0g
亮绿------------------------------------25mg
水---------------------------------------1000mL
终pH：7.6±0.2。搅拌加热使固体溶解，加热需恰好到沸点，不可过度加热或灭菌。溶解后立即转移到50℃水浴，在培养基凝固前倒平皿。
16、三糖-铁-琼脂培养基(TSI)
酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g
动物组织胰酶消化物---------------10.0g
乳糖------------------------------------10.0g
蔗糖------------------------------------10.0g
葡萄糖---------------------------------1.0g
硫酸铵亚铁--------------------------- 200mg（Ferrous Ammonium Sulfate）
氯化纳----------------------------------5.0g
硫代硫酸钠----------------------------200mg
琼脂-------------------------------------13.0g
水----------------------------------------1000mL
灭菌后pH：7.3±0.2。
17、麦康凯（MacConkey）琼脂培养基
白明胶胰酶消化物------------------17.0g
酪蛋白胰酶消化物------------------1.5g
动物组织胃酶消化物---------------1.5g
乳糖------------------------------------10.0g
牛胆盐混合物------------------------1.5g
氯化钠---------------------------------5.0g
琼脂------------------------------------13.5g
中性红---------------------------------30mg
结晶紫---------------------------------1.0mg
水---------------------------------------1000mL
煮沸溶液1分钟使固体物质溶解。灭菌后pH：7.1±0.2。
18、 Levine曙红亚甲基蓝琼脂培养基
白明胶胰酶消化物------------------10.0g
磷酸氢二钾---------------------------2.0g
琼脂------------------------------------15.0g
乳糖------------------------------------10.0g
Eosin Y---------------------------------400mg
亚甲基蓝------------------------------65g
水---------------------------------------1000mL
加白明胶胰酶消化物、磷酸氢二钾和琼脂于水，加热溶解后冷却。使用前融化，按如下量比加入其他液态成分，混匀：每100mL琼脂溶液加入——5mL乳糖溶液（1：5）、2mL Eosin Y 溶液（1：50）、2mL亚甲基蓝溶液（1：300）。配制后的溶液应澄清。灭菌后pH：7.1±0.2。
19、 Sabouraud葡萄糖琼脂培养基
葡萄糖---------------------------------40g
同比配制的动物组织胃酶消化物和酪蛋白胰酶消化物---------------10g
琼脂------------------------------------15g
水---------------------------------------1000mL
混合，煮沸得均匀溶液。
灭菌后pH：5.6±0.2。
20、马铃薯葡萄糖琼脂培养基
取300g剥皮的马铃薯，放入500mL蒸馏水中煮溶，过滤，加蒸馏水至1000Ml，然后加入以下物质：
琼脂------------------------------------15g
葡萄糖---------------------------------20g
加热溶解后灭菌。灭菌后pH：5.6±0.2。使用前倒平皿。待培养基冷却到45℃时加入酒石酸溶液（1：10）调节pH3.5±0.1，调节pH后不得再加热。
取样 (Sampling)
每个检测项目需要10mL或10g样品。
操作步骤 (Procedure)
准备检测样品，用与样品物理性质相适宜的方法进行样品处理，处理程序不得改变样品最初的微生物数量和种类。以获得可用于检测操作的溶液或悬液。
对于在一定范围内可溶解但溶解不完全的固体样品，可减少样品量，并加以注明。然后可采用“好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）”、“金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法（Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa）”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法（Test for Salmonella Species and Escherichia coli.）”进行检测。
对于液体样品，溶液或者悬液，或者酒精含量少于30%的水醇溶液，以及易溶且完全溶解于90mL pH 7.2的磷酸（盐）缓冲液或已指明的其他溶媒的固体样品，可采用“好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）”、“金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法（Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa）”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法（Test for Salmonella Species and Escherichia coli.）”进行检测。
对于不溶于水的流体，药膏，乳酪，以及蜡状物，可用最小量限的、已灭菌的乳化剂（如一种ploysorbates），通过机械搅拌、必要时可以进行不超过45℃加热的方法将其制备成悬液，然后将悬液按“好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）”、“金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法（Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa）”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法（Test for Salmonella Species and Escherichia coli.）”进行检测。
对于气雾状态的液体样品。。。（省略）
好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）
对于易溶、溶液透明可采用“平板法（Plate Method）”的样品采用平板法进行检测；否则可采用“多管法（Multiple-tube Method）”。无论采用何种方法，首先精确量取10.0g样品（固体）或10.0mL样品（液体）。将样品加入到pH 7.2的磷酸（盐）缓冲液、液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体酪蛋白消化物-
大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20中至100mL。如果1：10的样品溶液过分粘稠无法吸取，可继续稀释至1：50或1：100等稀释度直到获得可吸取的溶液。按照“准备试验”要求消除抑菌因素后方可进行好氧微生物总数检测。准备好的接种溶液应在1小时内加入样品。
平板法（Plate Method）
必要时对样品溶液进行稀释，直到每1mL液体中含菌量在30到300个之间。吸取1mL供试液到1个已灭菌平皿，共做两个平皿的平行样。迅速地在每个平皿里加入15~20mL加热溶解后冷却到45左右的大豆酪蛋白消化物琼脂培养基，盖上皿盖，顺或逆时针旋转平皿使供试液和培养基混匀，然后静置到室温待平皿冷却凝固。，倒置平皿，培养48~72小时。培养完成后观察平皿内微生物生长状况，进行菌落计数。取两个平皿的平均菌落数作为每g或每mL样品的微生物含量。如果1：10的稀释度未检出微生物，则结果表达为“样品微生物含量少于10个/g or mL”。
向14支大小相同的试验试管中加入9mL灭菌液体大豆酪蛋白消化物培养基。将其中12支试管分为4组，每组3支。（头3组分别标记为“100”，“10”和“1”），另外3支试管的1组作为对照（controls）。（剩余2支试管分别标记为“A”和“B”）。
向标记“100”的一组3支试管和第四支试管（A）里，各加入1mL样品溶液或悬液，混匀。然后从试管（A）里取出1mL加入到剩下的试管（B）里，混匀。这两支试管（A、B）分别含有样品100mg（或100ul）和10mg（或10ul）。
然后从试管（A）里取出1mL溶液分别加入到第二组标记“10”的3支试管里，从试管（B）里取出1mL溶液分别加入到第三组标记“1”的3支试管里。丢弃试管A和B里未使用的溶液。盖上试管口，培养所有的试管。培养结束后观察试管内的生长情况：
3支对照试管应保持澄清；含样品溶液的试管，根据表1的计数规则，对每克或每mL样品可能含有的微生物数量进行计数。
金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法
（Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa）
向样品中加入液体大豆酪蛋白消化物培养基至100mL，混匀后培养。然后检查培养基生长情况。如果有生长情况，用接种环挑取少许在Vogel-Johnson （或Baire-parker、或Mannitol-Salt）琼脂培养基上划线接种，以及溴棕三甲铵琼脂培养基。各涂布一个平皿。盖上皿盖倒置培养。若培养后培养基上未发现具有表2和表3所列出的培养物特征的菌落生长，则可判断此样品不含有金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。
表1多管法(Mulptiple-tube Method)的最可能细菌总数
每组试管里观察到生长情况的试管数量每克或每mL样品最可能含有的微生物数量
每支试管里含有样品量mg（或mL）
100（100 uL） 10（10uL） 1（1 uL）
3 3 3 > 1100
3 3 2 1100
3 3 1 500
3 3 0 200
3 2 3 290
3 2 2 210
3 2 1 150
3 2 0 90
3 1 3 160
3 1 2 120
3 1 1 70
3 1 0 40
3 0 3 95
3 0 2 60
3 0 1 40
3 0 0 23
表2 金黄色葡萄球菌在选择性琼脂培养基上的微生物学特征
选择性培养基菌落的微生物学特征革兰氏染色
Vogel-Johnson琼脂培养基黄色圈围绕的黑色菌落阳性球菌（群生）
Mannitol-Salt琼脂培养基黄色圈围绕的黄色菌落阳性球菌（群生）
Baird-Parker琼脂培养基黑色，有光泽，周围有2~5mm透明圈阳性球菌（群生）
表3铜绿假单胞菌在选择性和诊断性琼脂培养基上的微生物学特征
选择性培养基菌落的微生物学特征紫外荧光反应氧化酶试验革兰氏染色
溴棕三甲铵琼脂培养基通常为绿色绿色阳性阴性杆菌
假单胞菌琼脂培养基检测荧光生二氢荧光素通常为五色或黄色黄色阳性阴性杆菌
假单胞菌琼脂培养基检测绿脓菌溶素通常为绿色蓝色阳性阴性杆菌
凝固酵素检查（Coagulase Test）金黄色葡萄球菌
用接种环从Vogel-Johnson （或Baire-parker、或Mannitol-Salt）琼脂培养基表面挑取典型的可疑菌落，每个菌落分别接种到单独的试管，试管内含有0.5mL兔或马血浆，有或没有任何附加（设施），37℃水浴，每3小时或其他适宜的时间间隔观察一次生长情况，直到24小时。阳性和阴性对照同时进行培养。如果没有发现任何程度的凝结，判断样品符合金黄色葡萄球菌检查。
氧化酶和色素检查（Oxidase and Pigment Tests）铜绿假单胞菌
用接种环从溴棕三甲铵琼脂培养基表面挑取典型的可疑菌落接种到检测荧光生二氢荧光素假单胞菌琼脂培养基和检测绿脓菌溶素假单胞菌琼脂培养基表面，每个可疑菌落分别接种。若需要接种的菌落数太多，可对接种的平皿表面进行分区，每个区域接种一个可疑菌落。然后将培养皿于35℃倒置培养不少于3天。用紫外光扫描菌落表面，观察是否有表3所列的特征。
通过氧化酶检查法确认可疑的菌落是否是铜绿假单胞菌。在菌落培养物上/或将菌落培养物转移到预先浸润了N, N-dimethyl-p phenylenediamine dihydrochloride的滤纸：如果没有出现粉色变为紫色，证明样品符合未检出铜绿假单胞菌的要求。必要时还可以使用其他适宜的途径和生化试验来检定铜绿假单胞菌。
沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法
（Test for Salmonella Species and Escherichia coli.）
将样品放入适宜的容器，加入液体乳糖培养基至100mL，培养。然后检查培养基生长情况，若发现生长物，混合并轻柔振荡培养液，用吸管分别吸取1mL，各加入到10mL液体亚硒酸-双硫丙氨酸（胱氨酸）培养基和液体连四硫酸盐培养基中，混匀培养12~24小时观察结果。（同时需保留液体乳糖培养基残余培养液。）
沙门氏菌属检查（Test for Salmonella Species）
用接种环从液体亚硒酸-双硫丙氨酸（胱氨酸）培养基和液体连四硫酸盐培养基中挑取培养物，分别划线接种到亮绿琼脂培养基、戊醛糖-赖氨酸-脱氧胞啶琼脂培养基和亚硫酸铋琼脂培养基表面。倒置培养，如果未发现表4所列出的特征菌落，判断样品符合未检出沙门氏菌属的要求。
表4 沙门氏菌属在选择性琼脂培养基上的微生物学特征
选择性培养基菌落的微生物学特征
亮绿琼脂培养基细小，透明、无色或粉色到白色不透明（常有粉色或红色环带）
戊醛糖-赖氨酸-脱氧胞啶琼脂培养基红色，有或无黑色中心
亚硫酸铋琼脂培养基黑色或绿色
如果有表4所描述的菌落且经革兰氏染色呈阴性杆菌，则需要对可疑菌落进行进一步的检测。用接种针穿刺接种培养物到三糖-铁-琼脂培养基试管斜面下，培养。如果没有试管出现碱性（红色）或酸性（黄色）端头（有或没有伴随氢化硫黑色物质），则判断样品符合未检出沙门氏菌属的要求。
大肠埃希氏菌检查（Test for Escherichia coli）
用接种环从液体乳糖培养基残余培养液挑取培养物接种到麦康凯（MacConkey）琼脂培养基上。倒置培养。观察结果，若未发现符合表5所列出的微生物学特征的菌落，则判断样品符合未检出大肠埃希氏菌的要求。
表5 大肠埃希氏菌在麦康凯（MacConkey）琼脂培养基上的微生物学特征
革兰氏染色菌落的微生物学特征
阴性杆菌(球杆菌) 红色块状物；可能有汁类沉淀环（surrounding zone of precipitated bile）
如果发现符合表5所描述的菌落，需要进行进一步试验。
将可疑菌落用接种环挑取接种到Levine曙红亚甲基蓝琼脂培养基平皿上，每个菌落接种一个平皿。若需要接种的菌落数太多，可对接种的平皿表面进行分区，每个区域接种一个可疑菌落。倒置培养。如未发现有典型的金属光泽反射并在脉冲光线下无蓝黑色现象，则判断该样品符合未检出大肠埃希氏菌的要求。大肠埃希氏菌的存在情况还可以使用进一步适宜的途径和生化试验来证明。
Total Combined Molds和酵母菌总数检查 (Total Combined Molds and Yeasts Count)
采用好氧微生物总数检查法（Total Aerobic Microbial Count）下的平板法（Plate Method）进行检测。培养基需使用同样体积的Sabouraud葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基代替大豆酪蛋白消化物培养基，并且应在20~25℃培养5~7天。
复测 (Retest)
若按之前的任一方法取10.0g样品进行检测得到的结果有可疑，应另取25.0g样品进行复测。仍按“操作步骤（Procedure）”的方法进行操作，但应根据加大后的样品量进行相应放大。
微生物限度检查方法及其验证报告(修改)
文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告
目录1 样品相关信息 1.1 基本信息 2 主要仪器设备和试验耗材信息 2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种 3 试验环境 3.1 无菌室 3.2 洁净工作台 3.3 生物安全柜 4 试验方案 4.1 验证试验目的 4.2 微生物限度检查方法草案 5 方法验证试验 5.1 菌液制备 5.2 计数培养基适用性检查 5.3 控制菌检查用培养基使用性检查 5.4 供试液制备 5.5 方法验证 5.5.1 菌落计数方法验证试验 5.5.2 控制菌检查方法的验证 5.6 方法验证结论 6 供试品微生物限度检查结果
1 样品相关信息 1.1 基本信息（三批） 2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.2.1 对照培养基
2.2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种
3 试验环境 《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。 本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。 3.1 无菌室 无菌室按《医药工业洁净厂房设计规》GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。 3.2 超净工作台 超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 超净工作台沉降菌检测记录 2015.11.15 3.3生物安全柜 生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 生物安全柜沉降菌监测记录 2015.11.15 4 试验方案 按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
微生物限度检查记录 版
表：微生物限度检查记录（通用） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）
微生物限度检查记录 （30～35℃，3～5天） 20℃～25℃，5～7天） 沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：） 三、控制菌检查（30-35℃）
表： 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号：），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）
表： （含药材原粉的片剂） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、麦康凯液体培养基（配制批号： ）麦康凯琼脂培养基（配制批号： ） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、RV 沙门增菌液体培养基（配制批号： ），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号： ）、三糖铁琼脂（配制批号： ） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号： ），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号： ）
表：微生物限度检查记录（蛇胆川贝液） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：）
制药企业微生物限度控制菌检查培养基适用性检查记录表式样
控制菌检查培养基适用性检查记录 一、菌液制备（需要的菌种在□内划“√”）： □（1）大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml ，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（2）金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（3）乙型副伤寒沙门菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（4）铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（5）生孢梭菌新鲜硫乙醇酸盐流体培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； 二、每ml菌液含菌量的计数测定。 测定方法：取稀释后的菌液1ml（剩余的菌液冷藏保存）,置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml已经过适用性检查确正的温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基（细菌类别计数选用该培养基）或玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌、酵母菌类别计数选用该培养基），混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。细菌类别培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌类别培养温度为23℃～28℃。细菌类别培养3天，霉菌、酵母菌类别培养5天。 三、检查结果：需做的检查在□内划“√”。 □ 1. 增菌培养基促生长能力检查
分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌。 检验标准：与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。 结论： □ 2. 固体培养基促生长能力检查 检验标准：被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。 结论： □ 3. 培养基抑制能力检查 分别接种试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养，试验菌。 检验标准：试验菌应不得生长。 结论： □ 4. 培养基指示能力检查 分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等。 检验标准：被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 结论： 结论： 检验人：复核人：
无菌检查和微生物限度检查操作规范
无菌检查和微生物限度检查操作规范 （中国药品生物制品检定所） 一、无菌室的要求： 无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备，面积不小于6平米，高度2.4-2.8m为宜。建筑材料要光洁，不吸潮，无凸起，耐腐蚀，易清洗。无菌室内部应六面光滑，无缝隙，里面连接处应呈凹凸形，不留死角。操作间和缓冲间的门不应直对，缓冲间两个。 无菌室内采光面积要大，照明灯应镶嵌在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300lux，电源开关应设在室外。 无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯，每立方米2-2.5瓦，距实验台高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，距1米处应不低于70微瓦/平方厘米，无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置，控制温度18-26℃，相对湿度40%-60%，操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压，不低于4.9帕。操作区洁净度100级，操作间洁净度10000级，洁净度定期检查。 无菌室及缓冲间不得存放其他杂物，如培养箱。 用消毒液清洁无菌室操作台面，开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。无菌室的无菌程度，常用的沉降菌测定方法为：取营养肉汤琼脂平板3个，置无菌室的操作区台面左、中、右位置上，开盖暴露30分钟，在30-35℃培养2天后，计算菌落数。用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室，细菌总数应小于3个，浮游菌每立方米应小于5个，否则，不能用于无菌检查和微生物限度检查。 二、培养基的准备 1、培养基的制备： 配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基，加水溶化后，调节PH值，使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3，真菌培养基的PH值为6.2-6.6，分装、盖塞、灭菌，待用。 2、培养基灵敏度试验： 培养基是无菌试验的基准物质，关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度，因此，培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。只有使用灵敏度试验合格的培养基，才能保证无菌试验结果准确、可靠。 培养基灵敏度试验操作如下：取藤黄微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌的新鲜培养液，分别10倍递增稀释，制成每ml 含10-100个菌，并作菌落记数。将制备好的菌液分别加至需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基各3管。至规定温度培养5天，每株菌接种的培养基不少于2管生长，则改培养基的灵敏度试验合格。 3、培养基用前的检查： （1）无菌检查：各种培养基在规定温度培养3天，应无菌生长。 （2）新鲜程度检查：需气菌、厌气菌培养基氧化层的颜色用前不能超过1/5，否则，不能使用。应煮沸去氧，只限加热一次。 4、培养基的保存时限： 配制好的无菌试验用培养基在2周内用完。 三、菌种复苏和保藏 1、菌种复苏： 先将冻干菌种的封口端用砂轮刻痕，在刻痕处过火焰数次，用无菌湿棉球炸裂后打开，然后，加入0.3-0.4ml稀释液于菌种管底部，将菌种稀释、混匀，并吸出菌液，接种于适宜的培养基。培养时间和温度根据不同的菌种而定。仔细检查菌种的有关特性，如无发现异常，即可传代、使用。 2、药品微生物用的菌种传代方法： 取复苏好的菌种一支，接种于规定的培养基数管，培养后，置冰箱中保藏。取出使用的菌种，经一段时间后即可废弃。 为防止微生物突变，菌种应尽量避免不必要的接种和传代。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规范性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。 4.4.2 试验菌的制备和稀释：
微生物限度检查办法验证方法
微生物限度检查方法验证方案 1. 目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2. 范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3. 规范性引用文件： 根据《中国药典》2010 年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4. 验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径 0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3 天内使用。 4.4.1.2 试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在 2 小时内，放于湿热灭 菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3 周内使用。 4.4.1.3 试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法， 配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3
微生物限度检验方法验证方案
微生物限度检验方法验证方案 1.适用范围 本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。 2.目的 通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定。 3.职责 项目责任人：负责验证方案的起草及具体实施。 验证管理员：负责验证工作的组织、协调及管理。 QA现场监控员：负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。 QC负责人：负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责组织实施。 QC检验员：负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。 质量部经理：负责验证方案及报告的审核和批准。 4.内容 4.1.概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 4.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。.验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。 4.2.1.验证用菌株及菌种要求 大肠埃希菌【CMCC（B）44102】、金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】、黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，前述菌株作为细菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌及酵母菌计数验证用菌株。 验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），
微生物限度检查记录(2015年版)
表：2.1-024微生物限度检查记录（通用） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）
审核者：检验者： 微生物限度检查记录 （30～35℃，3～5天） 20℃～25℃，5～7天） 沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：） 三、控制菌检查（30-35℃）
表：2.1-024 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号：），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）
表：2.1-024 （含药材原粉的片剂） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、麦康凯液体培养基（配制批号： ）麦康凯琼脂培养基（配制批号： ） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、RV 沙门增菌液体培养基（配制批号： ），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号： ）、三糖铁琼脂（配制批号： ） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号： ），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号： ）
表：2.1-024微生物限度检查记录（蛇胆川贝液） 三、大肠埃希菌检查
四、沙门菌检查（30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：） 表：2.1-024微生物限度检查记录 （30～35℃，3～5天） 20℃～25℃，5～7天） 沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）
微生物限度检查操纵制度(中国药典2015年度版四部通则)
一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。 二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106) 三、目录1．微生物限度标准 2．设备、仪器及用具 3．消毒液、稀释剂、试液及培养基 4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法） 5．微生物计数法检查 6．控制菌检查法 7．实验技术 8. 附件 1．微生物限度标准 非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准
*未做统一规定。 1.1成品微生物限度标准 (1)．“—”为不得检出。 (2)．目测霉变者以不合格论。 (3)．“无”为标准依据或无相应规定。 1.2工艺用水微生物限度标准
1.3内包装材料微生物限度标准 说明： 1．“—”为每100 cm2中不得检出。2．目测霉变者以不合格论。3．“无”为标准依据或无相应规定。 2．设施、仪器及用具 2.1、设施： 2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。生化
试剂储存箱。 2.2仪器及器皿 2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。 2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml 分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。 2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。 2.3用过的玻璃器皿： 2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次。 2.3.2已被病原微生物污染的器皿：需先经过灭菌处理后再按常法洗涤。 试管及培养皿：先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经121℃灭菌30 分钟。趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。 吸管：全部直立浸没于清洁液的长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。24小时后，逐支用流水反复冲洗洁净，晾干后包扎灭菌备用。
2015年版中国药典微生物限度检查方法验证方案
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表
中国药典微生物限度检查方法验证方案
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC组签名：日期： 审核 部门：QC组签名：日期： 部门：质量部签名：日期： 批准质量负责人签名：日期： 质量部颁发本文件根据需要应分发于以下部门： 01 质量部 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。 文件编号修订原因修订日期TS-VP-4201-00 按GMP（2010年修订版）要求新制定
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 姓名部门及职务职责 黄汉新质量负责人/质量受权 人 负责验证方案及报告的批准 胡建新质量部QA组长审核验证方案、审核验证报告并协调工作 曾凤敏质量部QC组长负责验证方案审核、实施、汇总报告及培训工作 刘红华质量部QC 负责验证方案起草、具体实施、报告工作
微生物限度检查方法验证方案样本.doc
资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 微生物限度检查方法验证方案 1.目的 : 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查 , 包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查 , 特制定本验证方 案 , 经过比较试验菌的恢复生长结果 , 来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性 , 以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计 , 所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行 , 若因特殊原因确需变更时 , 应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.范围 : 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规范性引用文件 : 根据《中国药典》二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求 , 由于某些供试品具有抗菌活性 , 在建立微生物检查方法 或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时 , 可能影响检验结果的准确性 , 必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施 : 4.4.1试验前的准备:
4.4.1.1试验用具的准备:将试验需用的试管、刻度吸 管、薄膜过滤器、滤膜 ( 孔径 0.22um、直径 50mm) 、平皿、空三 角瓶、称量纸等 , 用牛皮纸包扎好后 , 放于湿热灭菌器中 , 在 121℃, 灭菌 30 min, 在 3 天内使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备:取适用性检查合格的营养琼 脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖 培养基 ( BL)、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸 培养基 ( MUG) 等脱水培养基 ,按照相应的配制说明,用纯化水配 制、分装后,在2小时内,放于湿热灭菌器中,在121℃,灭菌 15min, 在 3 周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备: 取在有效 期内的试剂, 按照相应的配制方法, 配制pH7.0 无菌氯化钠- 蛋白 胨缓冲液、0.9% 无菌氯化钠溶液、0.05%( ml/ml) 聚山梨酯80 的 0.9%无菌氯化钠溶液等 , 用纯化水配制 , 加热使溶 , 过滤 , 分 装 , 在 121℃, 灭菌 15 min, 在 3 周内使用。 4.4.2 试验菌的制备和稀释 : 4.4.2.1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液 : 4.4.2.1.1 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新 鲜培养物少许接种至 10ml 营养肉汤中 , 在 30～ 35℃培养 18～24 小时 ;取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基 中 ,在23～28℃培养24～48小时;取黑曲霉的新鲜培养物接种 至改良马丁琼脂斜面培养基上, 23 ～ 28℃培养 5～ 7 天。
微生物限度检查记录版
表：2.1-024 微生物限度检查记录（通用） 1. 常规法：取供试品10為1,用胰酪大豆胨液体培养基稀释至 100ml ，用匀浆仪等适宜的方法混匀， 制成1:10供试液。 2. 薄膜过滤法：取供试品 10mi ,用胰酪大豆胨液体培养基稀释至 100ml ，用匀浆仪等适 宜的方法 混匀，制成1:10供试液。吸取1:10的供试液10ml ,过滤，加0.1%无菌蛋白胨水溶液 300ml 分 三次冲洗，每次100ml ;冲洗后，将滤膜正贴于胰酪大豆胨固体培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基 上，每种培养基平行制备 2个平皿。按平皿法测定其菌数。 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号: ）、麦康凯液体培养基（配制批 ）麦康凯琼脂培养基（配制批号: ） 供试液制备
微生物限度检查记录 、需氧菌总数检查30?353?5） 、霉菌、酵母菌总数检查20C?25C,5?7天）
三糖铁琼脂斜面穿刺接种 （18?24h ） 三、控制菌检查 （30-35 C ） 检验者: 表：2.1-024 号: 结论 本品经按《中国药典》2015年版“非无菌产品微生物限度检查法”进行检验，结果 审核者: 微生物限度检查记录（丸剂） 供试液制备 供试液。 胰酪大豆胨增菌 （18?24h ） RV 沙门选择培 养 木糖赖氨酸脱氧胆酸分离培养 （18?48h ） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号: ）麦康凯琼脂培养基（配制批号: ） 四、沙门菌检查 （30 °C ?35C ） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、RV 沙门增菌液体培养基（配制批号： ）,木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号: ）、三糖铁琼脂（配制批号：