一种从香蕉果实提取高质量RNA的方法
分子植物育种，２００６年，第４卷，第１期，第１４３－１４６页
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．１，１４３－１４６
实验方法
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅ
一种从香蕉果实提取高质量ＲＮＡ的方法
庄军平１苏菁２陈维信１＊
１广东省果蔬保鲜重点实验室，华南农业大学园艺学院，广州，５１０６４２；２中山大学生命科学院，广州，５１０２７５
＊通讯作者，ｗｘｃｈｅｎ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
摘要从香蕉果实在中分离高质量的ＲＮＡ是从分子水平上研究香蕉果实成熟软化过程中相关基因表达的重要前提。实验表明，用已报道的相关ＲＮＡ的提取方法，即便利用已报道的从其它果实中成功提取出高质量ＲＮＡ的方法，也不能从香蕉果实中分离出高质量的ＲＮＡ。这主要是由于香蕉果实富含多糖、多酚和一些其它次生代谢物，在ＲＮＡ提取过程中这些物质会与ＲＮＡ共同沉淀，从而影响ＲＮＡ的产量和质量。到目前尚无商业化的ＲＮＡ抽提试剂盒适用于香蕉果实ＲＮＡ的提取。因此，探索出从香蕉果实中提取高质量ＲＮＡ的方法就具有十分重要的意义。本文所报道的ＲＮＡ提取的简便方法，可从以香蕉果肉和果皮中成功提取高质量的ＲＮＡ，产量可达４８￣７２μｇ?ｇ－１?ＦＷ－１，且整个提取过程可在一天完成；通过测定其Ａ２４０／２６０和Ａ２６０／２８０的比值表明，该该方法可有效降低ＲＮＡ提取过程中多糖、酚类物质和其它次级代谢物以及蛋白质的污染，提取方法所提取的ＲＮＡ纯度较高；在１％琼脂糖凝胶电泳，ＥＢ染色后结果表明ＲＮＡ在整个的提取过程中结构完整，未发生明显降解；利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从所提ＲＮＡ中成功克隆出了β－半乳糖苷酶基因ｃＤＮＡ片段，这表明其质量完全可满足进一步分子生物学研究的要求。
关键词香蕉果实，ＲＮＡ提取
ＡｎＥｆｆｅｃｔｉｖｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＨｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍＢａｎａｎａＦｒｕｉｔ
ＺｈｕａｎｇＪｕｎｐｉｎｇ１ＳｕＪｉｎｇ２ＣｈｅｎＷｅｉｘｉｎ１＊
１ＫｅｙＬａｂｏｆＦｒｕｉｔａｎｄＶｅｇｅｔａｂｌｅＳｔｏｒａｇｅｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｏｕｒｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１０６４２；２ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＣｏｌｌｅｇｅｏｆＺｈｏｎｇｓｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１０２７５
＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｗｘｃｈｅｎ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＡｂｓｔｒａｃｔＨｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｉｓａｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅｔｏｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌｏｆｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｒｉｐｅｎｉｎｇａｎｄｓｏｆｔｅｎｉｎｇ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，Ｐｒｅｖｉｏｕｓａｔｔｅｍｐｔｓｔｏｅｘｔｒａｃｔｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｓｕｓｉｎｇｐｕｂｌｉｓｈｅｄｐｒｏｔｏｃｏｌｓｈａｖｅｐｒｏｖｅｎｔｏｂｅｕｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ，ｅｖｅｎｔｈｅｕｓｅｏｆｐｒｏｔｏｃｏｌｓｄｅｖｅｌ－ｏｐｅｄｆｏｒｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＲＮＡｆｒｏｍｏｔｈｅｒｆｒｕｉｔｔｉｓｓｕｅ．ＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｄｕｅｔｏｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ，ｗｈｉｃｈｏｆｔｅｎｃｏ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅａｎｄｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｔｈｅＲＮＡｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｂｙａｆｆｅｃｔｉｎｇｂｏｔｈｔｈｅｑｕａｌｉｔｙａｎｄｑｕａｎｔｉｔｙｏｆＲＮＡｗｈｅｎｕｓｉｎｇｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｏ－ｃｏｌｓ．Ｕｎｔｉｌｎｏｗ，ｎｏｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｋｉｔｈａｓｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｆｏｒｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙＲＮＡｆｒｏｍｂａ－ｎａｎａｆｒｕｉｔ．ＳｏｏｐｔｉｍｉｚｅｄｐｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔａｒｅｎｅｃｅｓｓａｒｙ．ＨｅｒｅｗｅｄｅｓｃｒｉｂｅａｓｉｍｐｌｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔ．ＵｓｉｎｇｔｈｉｓｐｒｏｔｏｃｏｌｗｅｏｂｔａｉｎｅｄｇｏｏｄＲＮＡｙｉｅｌｄ（４８￣７２μｇ?ｇ－１?ＦＷ－１）ｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｐｕｌｐａｎｄｐｅｅｌｗｉｔｈｌｏｗｌｅｖｅｌｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔａｍｉ－ｎａｎｔｓａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＡ２４０／２６０ａｎｄＡ２６０／２８０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｉｓＲＮＡｗａｓｎｏｔｄｅｇｒａｄｅｄ，ａｓｗａｓｄｅｍｏｎ－ｓｔｒａｔｅｄｂｙｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｏｆｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｏｎ１％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＲＴ－ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｃｔｉｎｉｎｔｈｅｓｅＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｓａｌｓｏｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅａｒｅｎｏｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓｔｈａｔｉｎｔｅｒｆｅｒｅｗｉｔｈｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎｏｒＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｓ．ＡｌｌｏｆａｂｏｖｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｎａｎａＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌｐｒｅｓｅｎｔｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｉｓｏｌａｔｅｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙＲＮＡｗｉｔｈｌｏｗｌｅｖｅｌｓｏｆｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｒｅｌａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓＢａｎａｎａｆｒｕｉｔ，ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
分子植物育种
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ
从香蕉果实中分离和提纯高质量的ＲＮＡ，并用其构建香蕉果实ｃＤＮＡ文库，通过ＲＴ－ＰＣＲ进行相关基因的克隆、进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和蛋白质体外翻译试验，是从分子水平上对香蕉果实的形成、发育和果实成熟软化相关基因研究的基础。
虽然已有许多有关从植物中提取ＲＮＡ的方法报道，且有商业化ＲＮＡ提取试剂盒，但都不太适用于从香蕉果实中提取高质量的ＲＮＡ。这主要是由于香蕉果实中含有大量的多糖、酚类和一些次生代谢物质（Ｌｉｚａｄａｅｔａｌ．，１９９０），这些物质在ＲＮＡ提取过程中不但不易除去，且在除去过程中易导致ＲＮＡ的降解，影响ＲＮＡ的质量（ＺｅｎｇａｎｄＹａｎｇ，２００２），使其不能在体外进行翻译，不能满足进一步实验的要求。
为解决这一问题，我们尝试在提取ＲＮＡ常规方法的基础上进行优化和改进，成功地获得得到了高质量ＲＮＡ。现介绍如下。
１材料和方法
１．１实验材料
供试材料香蕉（ＭｕｓａｐａｒａｄｉｓｉａｃａＬ．ｖａｒ．ｓａｐｉｅｎ－ｔｕｍ）购置于广州市番禺区万顷沙镇，采收成熟度为７￣８成熟。挑选大小均匀、无病虫害及机械伤害的蕉指，用０．１％漂白粉水溶液清洗，再用杀菌剂（０．０５％的施保功）浸泡１￣２ｍｉｎ后晾干，然后在１６℃恒温箱中贮藏。
１．２ＲＮＡ提取试剂
提取缓冲液［１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．２）、１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２％ＣＴＡＢ］，水饱和酚，７０％乙醇，ＤＥＰＣ处理过的水，３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ（ｐＨ５．２），１０ｍｏｌ／ＬＬｉＣｌ，氯仿：异戊醇（２４：１），β－巯基乙醇，无水乙醇。
１．３ＲＴ－ＰＣＲ试剂及引物的合成
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ反转录酶，１５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．１ｍｏｌ／ＬＤＴＴ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰＭｉｘ，ＴａｋａｒａＬａＴａｑＤＮＡ聚合酶等。
用于ＲＴ－ＰＣＲ扩增的基因为β－半乳糖苷酶，其大小约为１．３Ｋｂ，其引物合成如下。上游引物：５＇ＧＧ（Ｇ／Ｔ）ＧＧＴＴＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＧＣＴＮＡＡ３＇；下游引物：５＇ＧＣＡＧＴＣ（Ｇ／Ａ）ＧＧ（Ｇ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）ＡＴＧＣＴＮＡ３＇；其中Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ。
１．４ＲＮＡ的提取
（１）分别取３ｇ香蕉果皮、果肉置于液氮中研磨成粉末然后加入６５℃预热的２０ｍｌ的提取缓冲液中（缓冲液预热前加入６μｌ的２－巯基乙醇）。
（２）将离心管在６５℃水浴锅中温浴１ｈ，后冷却至室温，并加入等体积的氯仿：异戊醇（２４：１）在１２０００×ｇ下离心１５ｍｉｎ。
（３）取上清液，再用等体积氯仿：异戊醇抽提，如上离心。
（４）取上清液，加入１０ｍｏｌ／ＬＬｉＣｌ至最终浓度为３ｍｏｌ／Ｌ，在４℃下隔夜沉淀ＲＮＡ，后在１７０００×ｇ下离心２０ｍｉｎ。
（５）将沉淀用ＤＥＰＣ处理过的水溶解，依次用苯酚、苯酚：氯仿（１：１）和氯仿，进行抽提。
（６）将上清液加入１／１５Ｖ的ｐＨ５．２的３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ和１／５Ｖ的无水乙醇，混合后在冰浴上，放置２ｈ，再离心２５ｍｉｎ。
（７）在上清液加入ｐＨ５．２的３ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＡＣ和３倍体积的无水乙醇，使ＮａＡＣ的最终浓度为０．３ｍｏｌ／Ｌ，在－７０℃下放置３ｈ，沉淀ＲＮＡ。
（８）离心２０ｍｉｎ后弃上清，加４℃预冷的７０％乙醇洗涤沉淀，重复２次。
（９）用等体积７０％乙醇洗涤沉淀，后干燥，并将ＲＮＡ悬浮于８０μｌＤＥＰＣ处理过的水中（不宜完全干燥，否则沉淀难以完全溶解），－８０℃冰箱中保存备用。
１．５纯度、产量及完整性检测
取４μｌＲＮＡ溶液，稀释至１ｍｌ，后测定２３０ｎｍ，２６０ｎｍ，２８０ｎｍ处的吸光值，即Ａ２３０、Ａ２６０和Ａ２８０，并计算Ａ２６０／Ａ２３０，Ａ２６０／Ａ２８０的比值，确定其纯度，再按照以下公式计算ＲＮＡ回收率：
ＲＮＡ回收率（μｇ?ｇ－１?ＦＷ－１）＝（Ａ２６０×４０×稀释倍数×原液体积）／提取样品质量（ｇ）
取３μｌ总ＲＮＡ溶液，在１％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，后在ＱｕａｌｉｔｙＯｎｅ凝胶成像系统下观察并拍照。
１．６ＲＴ－ＰＣＲ分析
１．６．１ｃＤＮＡ第一链的合成
ｃＤＮＡ第一链的合成采用美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司生产的ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ反转录酶进行，具体操作按产品说明指导书进行。
１．６．２ＰＣＲ反应
反应体系（２５μｌ）：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ［２００ｍｍｏｌ／Ｌ
１４４
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．４），５００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ］：２．５μｌ，５０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２：０．７５μ
ｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰＭｉｘ：０．５μｌ，上游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．５μｌ，下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．５μｌ，
ＴａｋａｒａＬａＴａｑＤＮＡ聚合酶等（５Ｕ／μｌ）０．２μｌ，ｃＤＮＡ第一链１μｌ；加双蒸水至２５μｌ。
反应条件：９４℃预变性２ｍｉｎ后再加入Ｔａｋａｒａ
ＬａＴａｑＤＮＡ聚合酶，变性温度９４℃１ｍｉｎ，延伸７２℃１ｍｉｎ，循环数３６，后在７２℃下延伸１０ｍｉｎ。
２结果与分析
２．１总ＲＮＡ纯度、
产量及完整性从表１可看出，香蕉果肉、果皮的ＲＮＡ的
Ａ２６０／Ａ２３０比值均超过了１．９，Ａ２６０／Ａ２８０比值均在１．８以
上，这说明采用该方法所提的ＲＮＡ基本上排除了多糖、多酚和蛋白质等物质的污染，且从表中还可看出其产量可达４８μｇ?ｇ－１?ＦＷ－１以上。
将所提取的ＲＮＡ在１％非变性琼脂糖凝胶中电泳进行检测，结果如图１所示，从图中可清晰看出
２８Ｓ和１８Ｓ两条带，这说明ＲＮＡ在整个的提取过程
中结构完整，未发生明显降解。
２．２ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果
ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果如图２所示，从图中可以看出，无论是用从香蕉果肉还是果皮中提取的总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，均可以扩增出与预期大小相符合的ｃＤＮＡ片段，且１与２，３与４重复性很好，这进一步说明该方法提取的香蕉果肉和果皮的总ＲＮＡ
质量较高，可完全满足于从分子水平上对香蕉果实相关基因进行深入研究的需要。
３讨论
虽然已有许多植物ＲＮＡ提取方法的报道，如常
一种从香蕉果实提取高质量ＲＮＡ的方法
ＡｎＥｆｆｅｃｔｉｖｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＨｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｏｍＢａｎａｎａＦｒｕｉｔ
规的异硫氰酸胍法、ＳＤＳ／酚法以及商业化的Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒法等。但本研究发现这些方法很难从香蕉果实中提取到高质量的ＲＮＡ，这主要是由于香蕉果实中富含多糖、酚类物质和其它的一些次生代谢物质，这些物质可与ＲＮＡ相互作用，形成不溶于水相的复杂混合物，因此在抽提过程中ＲＮＡ可与这些物质共聚合而损耗，
从而影响ＲＮＡ的提取量与质量
（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｂａｕｅｒｅｔａｌ．，１９９１；Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎｅｔａｌ．，１９９４），
故常规的提取方法均难以从香蕉果实中提取高质量
表１通过分光度计所测得的香蕉果皮、果肉总ＲＮＡ的量和质量
Ｔａｂｌｅ１ＲＮＡｙｉｅｌｄａｎｄｑｕａｌｉｔｙｂｙｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
样品
Ｓａｍｐｌｅ
香蕉果肉
Ｂａｎａｎａｐｕｌｐ
香蕉果皮
Ｂａｎａｎａｐｅｅｌ
吸光度比值
ＡｂｓｏｒｂａｎｃｅｒａｔｉｏｓＡ２６０／Ａ２３０１．９２２．０３
Ａ２６０／Ａ２８０１．８４８１．８１２
ＲＮＡ回收率（μｇ?ｇ－１?ＦＷ－１）Ｙｉｅｌｄ（９４℃）７２．７４４８．１３
图１香蕉果皮、果肉总ＲＮＡ电泳图
注：１￣２泳道代表香蕉果肉的总ＲＮＡ；３泳道代表香蕉果皮的总ＲＮＡ
Ｆｉｇｕｒｅ１ＡｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｂａｎａｎａｆｒｕｉｔ
Ｎｏｔｅ：Ｌａｎｅｓ１￣２ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｂａｎａｎａｐｕｌｐ；Ｌａｎｅ３ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｂａｎａｎａ
ｐｅｒｉｃａｒｐ
图２β－半乳糖苷酶基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果电泳图
注：Ｍ：分子量标准；泳道１￣２和泳道３￣４分别代表以香蕉果肉和果皮ｍＲＮＡ扩增的结果
Ｆｉｇｕｒｅ２ＡｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＲＴ－ＰＣＲａｍｐｌｉ－ｆｉｅｄｃＤＮＡｏｆβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｇｅｎｅ
Ｎｏｔｅ：ＬａｎｅＭｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＤＮＡｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅｓ１￣２ａｎｄｌａｎｅｓ３￣４ａｒｅＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｂａｎａｎａｐｕｌｐａｎｄ
ｐｅｒｉｃａｒｐｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
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分子植物育种
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ
的ＲＮＡ。因此提取香蕉果实ＲＮＡ的关键就在于如何防止酚类物质的氧化和除去多糖。
有关阻止酚类物质被多酚氧化酶氧化的措施主要是加入ＰＶＰ和β－巯基乙醇。ＰＶＰ作为多酚化合物的螯合剂，具有很强的结合酚类物质的能力，使之不能被氧化成醌类，有效地防止其与ＲＮＡ的结合。β－巯基乙醇作为强还原剂能防止多酚氧化，还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活，从而阻止酚类物质被多酚氧化酶氧化，有效地防止其与ＲＮＡ的结合。本研究认为在配制提取缓冲液时加入２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），并在加样前在提取缓冲液预热时加入３μｌ／１０ｍｌ的β－巯基乙醇，可有效地防止多酚类物质氧化，这种处理比单独加入β－巯基乙醇或ＰＶＰ效果好。究其原因也可能是因为ＰＶＰ虽然可以作为螯合剂，结合酚类物质，使之不能被氧化成醌类，但其在结合酚类物质过程中，也可与水饱和酚发生不可逆的结合，从而结合掉一部分ＲＮＡ，影响其提取质量（Ｈｕｅｔａｌ．，２００２）；而β－巯基乙醇能防止多酚氧化、阻止酚类物质被多酚氧化酶氧化的原理主要是其可不但可作为强还原剂防止氧化，还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使酶失活，大大减少了抽提中对ＲＮＡ质量的影响。
多糖是影响香蕉果实ＲＮＡ提取的另一重要因素。由于香蕉果实糖类物质含量高达１５％￣２０％（胡位荣等，２００３），因此在抽提过程中就必须首先要除去多糖。除去多糖的方法可用醋酸钾、低浓度乙醇和醋酸钾／低浓度乙醇来沉淀匀浆上清液中的多糖，从而达到除去多糖的目的。由于糖类物质的理化性质与ＲＮＡ比较相似，提取中往往与ＲＮＡ形成难溶的沉淀物，故除去多糖的过程中也将ＲＮＡ除去了。这就存在这样一个矛盾，为了消除多糖人们不断增加除糖的次数，而这样又增加了ＲＮＡ的损失；减少除糖的次数虽可减少ＲＮＡ的损失，但又降低了ＲＮＡ的纯度。因此在除多糖这一步骤中醋酸钾和乙醇的量的确定和处理次序就成了该步骤的关键。本研究认为在顺序用苯酚、苯酚：氯仿（１：１）和氯仿进行抽提后，加入１／１５ＶｐＨ５．２的３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ和１／５Ｖ的无水乙醇混匀并在冰浴上静置２ｈ，可促多糖沉淀而不会聚沉ＲＮＡ分子；然后在弃除多糖沉淀的上清液中加入终浓度为０．３ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＡＣ和３倍体积的无水乙醇，－７０℃下放置３ｈ至过夜，即可获得高质量的ＲＮＡ。
研究结果表明，本方法所提取的总ＲＮＡ，不但获得的ＲＮＡ量高，纯度也高，完全可以满足进一步从事相关分子生物学研究的要求，并可在一天半内完成整个抽提过程，具有快速、简便、操作简单、获取ＲＮＡ质量高等优点，可为其它多酚、多糖和多次生代谢物质ＲＮＡ的提取提供参考。
致谢
本研究由广东省重点科技攻关项目资助。
参考文献
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