生物技术制药重点

生物技术制药重点

名词解释：

生物技术也称生物工程。是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。

生物药物：是指运用微生物学、生物学、医学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法，从生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断疾病的制品。

生物技术药物：采用DNA重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。

生物技术制药：就是通过基因工程、发酵工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术，来研究、开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病的药物。

细胞融合：在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。(外力如诱导剂，促融剂作用下，两个或两个以上异源细胞或源生质体相互接触，从而发生膜融合，细胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。）

生物反应器：就是为适应生物反应的特点而设计的反应设备。包括微生物反应器（发酵罐）、动植物细胞培养用反应器和酶反应器。

转基因动物：指采用基因工程技术把外源基因导入动物生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体动物的染色体上稳定整合，且能将目的基因稳定遗传给后代的动物。

疫苗：是指将病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防、控制传染病的发生、流行的免疫制剂。

联合疫苗：由两种或两种以上疫苗混合而制成的疫苗。

基因工程亚单位疫苗：主要是指将基因工程表达的蛋白抗原纯化后制成的疫苗。（指在分离出病原体特异抗原编码基因的基础上，将外源基因转入另外一个通常是非致病性的微生物内表达基因产物，然后分离和纯化而获得特异性的蛋白。）

酶工程：是利用酶或含酶的细胞的特异性催化功能，或对酶进行修饰改造，并通过工程化将相应原料转化成人类所需产品的一种技术,是生物工程的重要组成部分。

固定化酶∕固定化细胞：指将具有一定生理功能的酶或生物细胞，用物理或化学方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的技术。

酶的化学修饰：在体外对酶分子通过人工方法使一些化学基团引入或除去，从而使酶的共价结构发生改变的技术。

发酵：工业上泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程（用生物催化剂使培养物质变成产物的生物化学反应。）

代谢工程：运用多基因重组技术，有目的的改变某一代谢途径中的几个关键酶的活性，从而改变代谢途径，产生目的产物。（利用基因重组技术有目的的对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径生产特定目的产物。）

微生物转化：是指微生物通过酶催化将一种物质（底物）转化成为另一种物质（产物）的化学反应。

组合生物合成：指在了解微生物生物合成途径以及克隆有关生物合成、调节等基因的基础上,在体外对这些不同来源（种内或种外）的基因进行删除、添加、取代以及重组，然后导入一个适当的微生物宿主中并定向合成所需的一系列化合物。（通过生物信息学和微生物遗传学手段可确定基因簇中的各模块或结构域的功能，将这些结构域或模块进行组合，就能产生母核，支链以及分子量各异的新型“非天然的天然产物”。）

蛋白质化学修饰: 在分子水平上对蛋白质药物进行化学改造的，通过对主链的切割、剪接及化学基团的引入或除去，实现对蛋白质药物物理化学性质和生物活性的改变。

噬菌体抗体库：B细胞受体基因重排所形成的抗体分子多样性或抗体基因多样性的总称。（用体外基因克隆技术将B细胞全部可变区基因克隆出来，插入噬菌体表达载体，转化工程细菌进行表达，在噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体。）

简答题：

概述生物技术制药的研究内容与任务。

１.生物制药技术的研究、开发与应用；

２.利用生物技术研究、开发和生产药物：

a)应用基因工程技术大量生产天然存在量极微或难以获得的药物；

b)应用蛋白质工程技术设计新的药物；

c)应用酶工程改变药用酶的性质；

d)应用生物技术改造传统制药工艺。

生物技术药物的特性有哪些？

１.理化性质特性：相对分子质量大；结构复杂；稳定性差。

２.药理学作用特性：活性与作用机制明确；作用针对性强；毒性低；体内半衰期短；有种属特异性和可产生免疫原性。

３.生产制备特性：药物分子在原料中的含量低；原料液中常存在降解目标产物的杂质；制备工艺条件温和；分离纯化困难，产品易受有害物质污染。

４.质量控制特性：质量标准内容的特殊性；制造项下的特殊规定；检定项下的特殊规定。

基因工程制药的基本环节有哪些？

获得目的基因—组建DNA重组体—构建基因工程菌活细胞—培养工程菌—产物的分离纯化—除菌过滤—半成品检定—成品检定—包装。

（基因工程菌构建与筛选, 目的基因的制备, 载体DNA与目的基因的连接, 重组DNA导入宿主细胞重组子的筛选与鉴定, 细胞表达及选择。）

获得目的基因的基本方法有哪些？

①化学合成法；②PCR法；③基因文库法；④cDNA文库法

如何筛选含有重组体的阳性菌落？

1）载体遗传标记法：抗生素抗性筛选法、互补筛选法、营养缺陷型筛选法、噬菌斑筛选法。2）核酸分子杂交法：菌落原位杂交；DNA印迹分析；RNA印迹分析。

3）限制性内切酶图谱法：从初步筛选的转化子中提取重组DNA，选择合适的限制性内切酶。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定Mr大小，含有目的基因DNA片段酶切产物的为阳性菌落。

4）DNA序列测定法；

5）目的基因表达产物测定法。

基因工程药物分离纯化的主要技术？

分离技术：1.离心：固液分离的重要手段。

2.沉淀：利用蛋白质在不同条件下的溶解度不同的原理。

1）等电点沉淀法；2）盐析法。

3.膜分离：

1）渗透和透析；2）反渗透、超滤和微滤；3）电渗析。

4.双水相萃取。

纯化技术：离子交换层析（IEC）、亲和层析(AC)、凝胶过滤层析、反相色谱(RPC)和疏水色谱(HIC)。

（分离依据：产物表达形式；分离单元之间的衔接；分离纯化工艺的要求。）

基因工程药物质量控制的项目有哪些？

1.蛋白质含量的测定：紫外吸收光谱、BCA法（双缩脲法）、福林-酚试剂法（Lowry法）、考马斯亮蓝法、ELISA法、SDS-凝胶染色与扫描分析法等。

2.蛋白质纯度检测：电泳法、色谱法、质谱法、末端氨基酸分析法、SDS-PAGE法、非变性PAGE 法、层析法等。

3.蛋白质Mr测：凝胶色谱法、SDS-PAGE法、质谱法、层析法等。

4.蛋白质等电点测定：等电聚焦凝胶电泳。

5.蛋白质序列分析：Edman降解法与质谱分析。

6.内毒素分析、宿主蛋白与核酸残留分析。

离体培养的细胞有哪些类型？

①贴壁依赖性细胞；②非贴壁依赖性细胞；③兼性贴壁细胞。

生产用动物细胞有哪些种类？

①原代细胞；②传代细胞系；③转化细胞系；④工程细胞系。

动物细胞培养的条件？

1.培养温度：不同种类的动物细胞对温度的要求不完全一致。哺乳类动物细胞最适温度：37±0.5℃。

2.pH值：大多数细胞适应pH为7.2~7.4，培养基应具有一定缓冲能力。

3.通氧量：氧的饱和值60%, 氧分压4～0.7kPa，在培养过程中还需通入一定的CO2。

4.防止污染：培养器皿严格消毒；培养液中应加入抗生素。

5.水质：电阻值大于18MΩ，去热原。

6.渗透压：290～300mOsm/kg。

7.基本营养物质：除三大营养素外，还要一定量的维生素，此外还要激素类物质和促细胞生长因子。

动物细胞大规模培养的方法和操作方式？

方法：悬浮培养法，微载体培养法，多孔载体培养法，微囊化培养法，中空纤维培养法。

操作方式：分批式操作，补料-分批式操作，半连续式操作，灌流式操作，连续式操作。

培养基种类有哪些？

天然培养基：营养成分丰富，培养效果好；但成分复杂、不稳定，个体差异大，来源有限。

合成培养基：成分明确，组分稳定，可大量生产供应，但缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要，须加入动物血清。

无血清培养基：由基础培养基和替代血清的补充成分组成。该类培养基具有许多优点，但配制繁琐，同时需加入添加剂。

抗体药物主要开发了哪几代产品？

⑴第一代抗血清；⑵第二代单克隆抗体药物；⑶第三代基因工程抗体药物。

单克隆抗体如何制备？

1）制备抗原；2）用抗原免疫小鼠制得免疫脾细胞；3）用骨髓瘤细胞的培养制得骨髓瘤细胞；4）在PEG作用下融合成杂交瘤细胞；5）再用HAT培养基进行选择培养；6）阳性克隆的筛选及克隆化；7）单克隆抗体鉴定与检测；8）克隆扩增及大量制备单克隆抗体。

基因工程抗体包括哪些？

①Fab与Fv抗体片段；②单链抗体；③双链抗体；④抗体融合蛋白；⑤嵌合抗体；⑥人源化抗体；⑦超变区多肽；⑧特殊抗体。

抗体药物的分类：

按抗体分子的构成可以将单抗药物分为三类。

①抗体或抗体片段；②抗体偶联物或称免疫偶联物；③抗体融合蛋白。

什么类型的分子可作为治疗性抗体的靶标？

特异性、重要性、可检测性的分子可作为治疗性抗体的靶标。

疫苗及其技术的发展经过哪几阶段？

1.减毒活疫苗技术—第一次疫苗革命；

2.基因重组疫苗技术—第二次疫苗革命；

3.反向疫苗学技术—第三次疫苗革命。

简述疫苗的组成与作用原理。

疫苗的组成：免疫保护性的抗原与免疫佐剂。

疫苗的作用原理：疫苗保留了病原菌刺激机体免疫系统的特性。当机体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫细胞、细胞因子、特异性抗体等；当机体再次接触到相同病原菌时，机体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。

常见的疫苗的类型有哪些？分别列举1-2个例子

1.减毒活疫苗；例：乙脑疫苗、卡介苗。

2.灭活疫苗；例：霍乱疫苗、甲型肝炎疫苗。

3.亚单位疫苗；例：伤寒疫苗和无细胞百白破疫苗。

4.联合疫苗。例：无细胞百白破联合疫苗。

（核酸疫苗：埃波拉疫苗。治疗性疫苗：治疗性乙肝疫苗。）

简述疫苗生产的质量控制的主要内容及控制指标。

原材料的质量控制：生产用水；器材、溶液等原材料的供应；动物源的原材料；菌种和毒种。细胞生产过程质量控制：一般真核细胞表达的反复使用多次产品，要求纯度达到98%以上，原核细胞表达的多次使用产品纯度达95%即可。

疫苗产品的质量控制：:理化检定；安全性检定；效力检定。

固定化酶有何优缺点？

优点：可延长酶的半衰期，提高酶的稳定性，可重复使用。

缺点：酶活力下降，对pH非常敏感。

酶和细胞的固定化方法？

传统的酶固定化方法：1.载体结合法：①物理吸附法；②离子结合法；③共价结合法；

2.交联法：交联酶法；酶辅助蛋白交联法；吸附交联法；载体交联法；

3.包埋法：包埋法可分为网格型和微囊型两种。

新型的酶固定化方法：光偶联法；偶合固定化；无载体固定化；

固定化细胞的方法：吸附法、包埋法、交联法、热处理（细胞）、细胞絮凝法。

固定化酶反应器的类型和特点？

1 搅拌罐式反应器：设备简单，易操作，条件易调节控制，反应较完全。

2 鼓泡式反应器：结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质和传热效率高。

3 膜反应器：结构紧凑，利于连续化生产。

4 喷射式反应器：体积小，混合均匀，催化反应速度快。

5 填充床式反应器: 设备简单，操作方便，混合均匀，传质和传热效果好。

6 流化床反应器：温度和pH的调节控制比较容易，不易堵塞。

注：膜式反应器：结构紧凑，利于连续化生产。

喷射式反应器：填充床反应器:固定化酶填充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流形。底物按一定方向以恒定流速通过反应床。

流化床反应器：底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体酶颗粒处于流化状态，达到混合的目的。

间歇式搅拌罐反应器：结构简单、操作方便,用于游离酶反应。

连续流动搅拌罐反应器：连续进料、连续出料。

循环反应器：部分反应液流出和新加入底物流入液混合，再进入反应床进行循环。

连续流动搅拌罐-超滤膜反应器：由连续流动搅拌罐反应器和超滤装置组合而成的反应器。它在连续流动搅拌罐的出口处装有半透膜。

*试述在酶反应器催化的过程中，如何确定底物和酶的浓度。（酶的化学本质为蛋白质。用检测蛋白质的方法也可检测酶。）

⒈根据固定化酶的形状来选择；

⒉根据底物的物理性质来选择；

⒊根据反应的动力学特性来选择；

⒋根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择；

⒌根据操作要求及反应器费用来选择。

发酵类型有哪些？

⑴微生物菌体发酵；⑵微生物的酶；⑶微生物代谢产物发酵；⑷微生物转化发酵；⑸生物工程菌发酵。

简述发酵菌种选育的方法。

1）从自然界中获得新菌种；2）自发突变与定向培育；3）诱变育种；4）杂交育种；5）原生质体融合；6）基因工程育种。

论述发酵过程的影响因素及控制。

1、菌体浓度的影响及控制：发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系，在发酵过程中必须设法使菌体浓度控制在合适范围内，主要通过调节培养基中营养基质的浓度控制；

2、营养物质对发酵的影响及控制：a.碳源影响菌体的生长，在工业上，发酵培养基常采用含有速

效与迟效的混合培养基； b.氮源影响与碳源相同，需控制适量的氮；c.磷酸盐影响微生物的分解和合成代谢，必须结合具体条件和适用的原材料进行实验确定。

3、温度的影响及控制：温度会影响酶的反应速率，利用冷却水，通过热交换来降温，保持恒温发

酵；.

4、pH的影响及控制：pH影响酶的活性，改变细胞膜的通透性，影响代谢方向等，所以将pH控

制在最合适范围内使用；

5、溶氧的影响与控制：溶氧影响菌体生长，产物性质和产量，通过调节搅拌转速和通气速率来控

制供养；

6、CO2 的影响与控制：CO2影响细胞膜结构，发酵液pH下降，通过降低通气量及搅拌速率来控

制CO2；

7、泡沫的影响与控制：泡沫使气体分散，增加气液接触面积，可通过机械消泡、泡沫剂消泡；

8、染菌对发酵的影响：染菌会污染噬菌体和其他杂菌，应避免染菌。

可以采用哪些途径来控制发酵产物生成？

⑴使用诱导物；⑵改变细胞膜通透性；⑶添加生物合成前体；⑷借助末端产物反馈调节；⑸解

除分解代谢物阻遏。

微生物转化反应有哪些类型？

氧化反应、还原反应、水解反应、缩合反应、酰基化等其他反应。

微生物转化在制药工业上有哪些应用？

1) 微生物转化在甾体药物合成中的应用；

2) 微生物转化与中药现代化；

3) 微生物转化在天然药物研发中的应用；

4）微生物转化与手性合成。

简述组合生物合成的技术手段。

①对生物合成基因簇实施突变；②异源表达生物合成基因簇；③重组结构域或模块。

微生物转化中药的基本途径有哪些？

1) 微生物将中药中的有效成分经代谢形成新化合物，产生新的药效；

2) 微生物将原本没有活性的化合物转化成有活性的化合物；

3) 微生物产生的某些次级代谢产物与中药中的某些物质发生反应形成新的化合物；

4) 微生物在中药的特殊环境中有可能改变自身的代谢途径，从而形成新的活性物质或者改变活

性成分的比例；

5) 微生物的分解作用有可能将中药中的有毒物质降解，从而降低药物的毒副作用。

蛋白质药物的化学修饰剂有哪些？

聚乙二醇化修饰，糖基化修饰，人血清白蛋白修饰，用脂肪酸、糖肽、卵磷脂修饰。

(选择蛋白质修饰剂需要考虑的问题有：①修饰剂的毒性、抗原性及稳定性；②修饰剂的反应活性及对修饰位点的选择性；③修饰剂与蛋白质连接键的稳定性；④修饰剂对蛋白质构象及生物活性的影响；⑤是否适合于建立快速、方便的分析、分离及纯化方法；⑥修饰剂是否价廉易得等。）