生物芯片在病原体检测中的研究进展

综述 生物芯片在病原体检测中的研究进展*

林琳,马雅军**

(第二军医大学病原生物学教研室,上海200433)

摘要 生物芯片作为一种高通量的基因检测技术,在多个研究领域已广泛应用,本文介绍了生物芯片技术的基本原理,综述了其在病原体检测中的研究进展。

关键词 生物芯片;病原体;检测;综述

中图分类号 R37 文献标识码 A 文章编号 1673 5234(2011)03 0232 04

[J our nal of Pathogen B iology.2011M ar;6(3):232-235.]

Applications of biochip technology in pathogen detection

LIN Lin,MA Ya jun (D ep ar tment of Pathogen B iology,Second M ilitar y M edical Univer sity,S hang hai 200433,China)

Abstract Biochip techno log y has been applied in many research fields as a high thro ug hput technique for g ene analysis.

T his rev iew descr ibes t he fundamental principles o f biochip technolog y and summarizes the status of r esear ch into its a p plications in pat ho gen detectio n.

Key words Biochip;pathogen;detectio n;review

生物芯片(Biochip)是多学科交叉融合的综合高新技术,它覆盖生命科学、医学、光学、机械、电子、计算机软件、自动控制、微电子、化学、物理和数学等学科。虽然生物芯片技术成本较高,但具备高通量、微型化和自动化等特点,能够对数万个基因或样品同时进行快速、并行和自动检测分析,实现了生命科学研究中大量样品和数据的连续化、集成化和微型化处理。生物芯片的概念是由F odor等[1]于1991年首次提出,随后发展迅速,目前已在基因表达、基因分型、药物基因组学、蛋白质组学和细胞生物学等基础研究领域广泛应用。另外,随着生物芯片技术本身的优化,在应用研究领域也崭露头角,如药物筛选、食品卫生监督、疾病诊断与治疗、环境监测和司法鉴定等。作者就生物芯片在病原体检测中的研究现状综述如下。

1 生物芯片的类别和基本原理

生物芯片是指借助微加工和微电子技术,以人工合成的或应用常规分子生物学技术获得的核酸或蛋白质片段作为探针,按照特定的排列方式和手段固定在硅片、玻片或硝酸纤维膜上,然后加入待测样品进行杂交,通过杂交信号的强弱与分布进行定性或定量分析[2]。按载体材料分为玻璃芯片、硅芯片和陶瓷芯片等。按结构特点,可分为微阵列芯片和微流体芯片。其中微阵列芯片又包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等;微流体芯片是以各种微结构为基础的芯片,利用它可实现对各种生化组分的微流控操作和分析,如毛细管电泳芯片、P CR反应芯片和介电电泳芯片等。按芯片的应用功能,可分为测序芯片、表达谱芯片和基因差异表达分析芯片。另外,也可依据探针的类别、检测的目的等进行分类。

生物芯片的基本原理类似,在此以基因芯片为例,其工作原理与经典的核酸分子杂交一致,都是应用已知的核酸序列与互补的靶序列杂交,经典的杂交方法固定的是靶序列,而基因芯片技术固定的是已知探针,因此基因芯片可被理解为一种反向杂交。常用双色荧光试剂Cy3和Cy5先标记待测样品,然后与芯片上的探针杂交,再用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描,计算机软件系统检测杂交信号,可高效、大规模地获得相关的生物信息。基因芯片技术解决了传统核酸印迹杂交时操作复杂、自动化程度低和检测目标分子数量少等缺点。

基因芯片的固相介质材料包括玻璃、硅片、瓷片、金、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜等。在选择固相介质时,应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、介质表面积和非特异吸附的程度等因素,目前较为常用的支持介质是玻片。为保证探针稳定固定于支持载体,需要对其表面进行修饰或涂覆,使其形成极强的固定功能和匹配选择能力,以适合连接生物分子。杂交信号的检测方法有放射性核素法、生物素法和荧光染料法等,在以玻片为载体的芯片上目前普遍采用荧光法。检测荧光的装置有激光共聚焦显微镜、电荷偶合器、激光扫描荧光显微镜和激光共聚焦扫描仪等,激光共聚焦扫描检测方法的应用最为广泛,国内外先进的生物芯片检测仪器均使用该装置。经过扫描提取杂交信号之后,首先要扣除背景,进行数据检查、标化和校正,消除不同实验系统的误差,然后再进行数据分析。最后,需要建立通行的数据储存和交流平台,将各实验室获得的实验结果集中起来形成共享的数据库,以便数据的交流和结果的评估。

2 生物芯片在病原体检测中的应用

病原体(pathog en)是能引起人体疾病的微生物和寄生虫的统称。微生物包括病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体和真菌等;寄生虫主要有原虫、蠕虫和媒介生物等。近年

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基金项目 卫生部 重要病媒生物监测和传播相关病原体检测技术研究 (No.2008ZX10004 010)。

通讯作者 马雅军,E mail:yajunm@yah https://www.360docs.net/doc/ca6608321.html,

作者简介 林琳(1982-),江西上饶人,病原生物学专业在读研究生。E mail:linlin198210@https://www.360docs.net/doc/ca6608321.html,

来,生物芯片除了在病原体重要基因(如毒力基因、抗药基因)的筛选检测和基因表达中应用较多以外,在病原体检测以及种类鉴定和分子流行病学等研究中的应用也有不少成功的报道。

2.1 细菌 由于生物芯片检测有特异性和敏感性较高的特点,加之在临床上使用可快速获得检测结果,故对抗菌治疗的时机把握和患者有效管理有重要意义。

细菌核糖体D NA(r ibosomal D NA,r DN A)的16S、23S和16S~23S r DN A序列在种内均高度保守,检测病原菌大多是以上述具种特征性的片段设计探针。2009年Sug ihara等[3]使用通用引物扩增16S rDN A的部分片段,在3个可变区设计寡核苷酸探针,制作的芯片可以检测30种易引发自发性细菌性腹膜炎(spontaneo us bacterial per itonit is,SBP)的病原菌和54种临床上重要或难培养的细菌,虽然芯片的检出率与培养法相似,但耗费的时间却不到培养法的1/4,能及时地针对有腹水症状和SBP的肝硬化病人进行治疗。细菌的23S rD NA虽然较16S r DN A变异大,但已知序列的细菌种类较少,难以应用[4];而16S~23S rDN A间隔区虽然种属间变异较大,但片段较短,不适合单独作为探针使用[5]。虽然也有应用23S rD NA[6]、16S ~23S r DN A间隔区[7,8],还有16S与23S rD NA相结合[9]作为靶基因检测病原细菌的报告,但应用范围较为局限。多位国内学者也依据rD NA基因序列制备了可鉴定各种常见肠道致病菌[10]和感染性细菌[11,12]的生物芯片,实验证实具有良好的临床应用前景。

将生物芯片与其他技术相结合,可提高检出灵敏度。2008年赵源等[13]结合显色法的芯片技术(玻璃芯片转尼龙膜显色法)在种水平对可对分枝杆菌(M y cobacter ium)进行鉴定。P al ka等[14]结合PCR技术可检测葡萄球菌属(S tap hy lococcus)、链球菌属(Str ep tococcus)、肠球菌属(Enter ococcus)、克雷伯菌属(K lebsiella)、不动杆菌属(A cinetobacter)、大肠埃希菌(Esche r ichia coli)和白色念珠菌(Candida albicans)等。

2.2 真菌 真菌感染一直被认为是免疫缺陷人群发病率、死亡率增高的主要原因。传统培养方法由于生长周期的原因耗时长,血清学检测很难查到已存在免疫抑制的病人的抗真菌抗体,虽然组织病理学检测相对较快并能诊断侵入性真菌,但较难精确辨别非典型真菌的形态特征[15]。故依据分子特征的生物芯片检测方法越来越受到各实验室的重视。

文献报告以真菌的rD NA第二内转录间隔区(internal transcr ibed spacer2,IT S2)为靶基因制作的检测临床20种致病真菌和26种重要真菌的生物芯片[16,17]和待测样品杂交的结果与典型图谱比对即可判断种类,特异性与重复性均良好,灵敏度可达为15pg/ml。2008年Cam pa等[18]以IT S2结合IT S1为靶基因设计的检测10属24种真菌的生物芯片,可同时对内部和浅表的病原真菌进行鉴定,包括酵母菌(S acchar omy cetes)、新型隐球菌(Cr y p tococcus neof or mans)和曲霉菌(A s p er gill us)等,结果显示该芯片在临床实验中结果可靠。我国学者张英朗等[19]也应用IT S1结合IT S2为靶标制备芯片成功对170例真菌性角膜病的致病菌种进行临床快速检测。2009年鲁卫平等[20]基于rD NA对真菌的分型技术,结合纳米金新型基因芯片检测系统可同时检测30种临床常见致病酵母菌,杂交信号通过银染反应放大后,裸眼即可观察,最低检测值达50 fmol/L,临床样品检测结果与常规鉴定结果一致性高,能基本满足大通量要求,具有较好的应用前景。

2.3 病毒 病毒几乎可以感染地球上所有的生物,许多学者都致力于对致病性病毒快速检测的研究,依据病毒基因组中的保守区域,设计特异性探针制备芯片,进行种类鉴定并区分型、亚型。最早进行该研究的是美国加州大学De R isi实验室, 2001年Wang等[21]设计了可检测140种病毒的1600余条寡核苷酸探针,制作的芯片不仅可检测序列已知的病毒,并可发现序列未知的病毒。之后,应用生物芯片检测病毒的研究陆续报告,2007年W ang等[22]制备的寡核苷酸芯片可同时检测新城鸡瘟病毒(New castle disease v irus)和艾滋病病毒(Human immuno deficiency v irus)H5、H7亚型。关于芯片检测虫媒病毒研究,2007年朱晓光等[23]曾开展了属水平筛查和种水平的鉴定,包括东方马脑炎病毒(Easter n equine encephalitis virus)、西方马脑炎病毒(W ester n equine encephalom yelitis v irus)和委内瑞拉马脑炎病毒(V enezuelan equine encephalit is vir us)等13种,以及确认登革热病毒(Deng ue v irus)、日本脑炎病毒(Japa nese encephalitis v irus)和西尼罗病毒(West Nile vir us)等[24],还有鹿流行性出血热病毒(Epizoo tic haemor rhag ic disease virus of deer)、阿卡斑病毒(Akabane v ir us)、蓝舌病病毒(Blueto ngue vir us)和水泡性口炎病毒(V esicular sto matitis v ir us)等[25]。

另外,研究者也对以下病毒也进行了生物芯片检测,即人乳头状瘤病毒(H uman pa pillo ma v irus)[26]、疱疹病毒(H erpes vir us)[27,28]、腺病毒(A deno v ir us)[29]、禽流感病毒(Av ian influ enza v ir us)[30]、麻疹病毒(M easles v irus)[31]、甲型流感病毒(In fluenza A v irus)[32]、感染小儿呼吸道的腺病毒和冠状病毒(Co r ona virus)[33]、乙肝和丙肝病毒(H epat itis virus)[34,35]和口蹄疫病毒(Fo ot and mo uth disease vir us)[36]等。病毒检测是生物芯片的主要应用领域之一,虽然检测的敏感性有限,但在未来病毒快速检测中,仍不失为一种有广泛应用前景的工具。

2.4 寄生虫 传统的寄生虫病病原检测方法通常为粪检、血检、体外培养和免疫学检测等,但感染度低时,容易漏检,而生物芯片具有灵敏度高的优势,可以弥补前述缺陷。2003年张锦海等[37]以具种属特异性的SSr RN A基因片段为探针,制备了诊断疟原虫(Pl asmodium)感染和分种的基因芯片,检测时需提取疟原虫的核酸,扩增后与芯片杂交,扫描和分析的结果能特异和敏感地对间日疟原虫(P las mod ium viv ax)和恶性疟原虫(Pl asmodium f alcip ar um)进行区分。T an等[38]使用基因芯片对恶性疟原虫进行基因型分析及核苷酸多态性检测,有助于了解疟原虫的进化历程。2004年周钧等[39]研制的芯片能有效地检测出日本血吸虫(S chistosoma j ap onicum)单个尾蚴、虫卵、阳性钉螺或极微量成虫DN A,而与其他吸虫无杂交信号。另外,有对弓形虫(T ox op lsama gond ii)、旋毛虫(T r ichinella sp iralis)和绦虫(Ces tod es)进行生物芯片检测和区分的研究报告[40,41]。日本久保田公司应用芯片检测自来水中的隐胞子虫(Cr y p tosp or idium p ar v um)作为水质质检的常规手段,方法简便、结果准确。

媒介生物的准确鉴定对虫媒病控制具有重要意义。目前应用生物芯片进行媒介生物鉴定的报告不多,仅在9种按蚊(A nop heles)、7种库蚊(Culex)、2种伊蚊(A edes)、1种阿蚊(A r miger es)和1种杵蚊(T r ip ter oides)中进行了初步尝试[42]。而在媒介生物学领域,应用生物芯片技术主要是进行了家蝇抗

菌肽相关基因筛选[43]、按蚊对疟原虫的抗性差异分析[44,45]、蚊虫对杀虫剂的抗性机制探讨[46~49]、按蚊唾腺基因表达模式[50],以及研究按蚊与疟原虫感染的相互关系等[51]。

3 问题与展望

生物芯片技术作为一种新型技术,具有快速、准确、灵敏和通量高的优点,虽已有成功的产品应用,如 肿瘤基因芯片诊断试剂盒 和 病毒载量测定试剂盒 等,但若将其广泛应用于现场和临床还面临许多问题,主要包括:1)研究成本较高,芯片制作技术复杂,探针的制备与固定费时费力,一般实验室难以承担其高昂的费用;2)方法标准化存在限制,由于各实验室的设备和对样品处理方法等的不同,众多数据间常常可比性差,共享困难;3)基因序列信息缺乏,与人类疾病有关的病原体众多,目前相关的基因组信息限制了生物芯片在病原体检测中的应用范围;4)生物芯片检测的特异性有待提高,假阳性和假阴性仍影响结果的准确性;5)目前未形成有效统一的制备、检测和数据处理标准,在很大程度上影响芯片结果的可重复性。正因为存在上述问题,许多花费了巨大资金和人力制备的生物芯片实用性均不强,故在研究前应充分论证,以免造成浪费。当然,随着芯片技术的不断发展和完善,检测仪器的小型化和低廉化,以及检测操作方法的简便化,有望在未来广泛应用于病原体检测和疾病诊断。

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收稿日期 2010 12 15 修回日期 2011 03 02

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在调查中发现,当地牧民对该病并不了解,防护意识差,如在牛、羊产崽时牧民们常在不采取任何防护措施下进行接生,这在很大程度上增加了Q热感染的机会。将生产后的胎盘随意丢给猫或狗吃,在一定程度上又增加了Q热发生的可能性及传播的范围。有报告通过猫等宠物传播Q热的病例[15]。因此,当地卫生防疫部门应加强此类疾病的宣传,尤其应引起动物防疫部门的重视,提高居民对Q热的认识,在一定程度上降低此类疾病的发生与流行。

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收稿日期 2010 12 02 修回日期 2011 03 02