兽医微生物学 第三章 消毒与灭菌

第三章消毒与灭菌

第一节物理因素对微生物的影响

第二节化学因素对微生物的影响

第三节生物因素对微生物的影响

1、灭菌（sterilization）指杀死物体中所有微生物的过程。经灭菌后物体内外不含有任何活的微生物及其细菌的芽胞、霉菌孢子等。

2、消毒（disinfection）指杀灭物体中的病原微生物的过程。消毒只要求达到消除传染性的目的，而对非病原微生物及其细菌的芽胞、霉菌孢子等不做要求。

3、防腐（antisepsis）指阻止或抑制微生物生长繁殖。

4、无菌（asepsis）指没有活的微生物的状态。采取防止或杜绝任何微生物进入动物机体或其它物体的方法，称为无菌法。以无菌法进行的操作称为无菌操作。

无菌操作（如下图）

第一节物理因素对微生物的影响

一、温度

(一)低温

大多数微生物对低温具有很强的抵抗力。低温下，代谢活动降低到最低水平，生长繁殖停止，但仍可长时间保持活力。

意义：保存菌种、毒种、疫苗等

(二)高温：高温对微生物具有明显的致死作用

热力灭菌法：干热灭菌和湿热灭菌两种方法。

二者比较：在同一温度下，后者效力比前者为大。

原因：（1）湿热中细菌菌体蛋白较易凝固，蛋白质的含水量与凝固所需的温度成反比；

（2）湿热的穿透力比干热强；

（3）湿热的蒸汽遇物体放出潜热进一步提高物体的温度。

1、干热灭菌法

(1)火焰灭菌法: 分为灼烧和焚烧两种，灼烧主要用于耐烧物品，直接在火焰上烧灼，如接种针（环）、金属器具、试管口等的灭菌；焚烧常用于烧毁的物品，直接点燃或在焚烧炉内焚烧，如传染病畜禽及实验感染动物的尸体、病畜禽的垫料以其他污染的废弃物等的灭菌

(2)热空气灭菌法

干热灭菌器适用于高温下不损坏、不变质的物品，如玻璃器皿、瓷器等的灭菌。

灭菌温度需160-170℃维持1.5-2 h 。

2、湿热灭菌法

(1)煮沸消毒法:煮沸10～20 min可杀死所有细菌的繁殖体，芽胞常需煮沸1～2 h 才被杀死。用于饮水、一般手术器械如刀剪、注射器、针头的消毒。

(2)巴氏消毒法以较低温度杀灭液态食品中的病原菌

或特定微生物，而又不致严重损害其营养成分和风味的消毒方法。用于葡萄酒、啤酒及牛乳等的消毒(不损失营养成分）。

低温维持巴氏消毒法：63-65 ℃，30min，迅速冷却至10℃以下,称为冷击。这样可以进一步促使细菌死亡，也有利于鲜乳马上转入冷藏保存。

高温瞬时巴氏消毒法：71-72℃，15s，迅速冷却至10℃以下,称为冷击。

超高温巴氏消毒法：使鲜牛奶通过温度不低于132℃的管道1-2s，迅速冷却至10℃以下(在常温下的保存期可达半年）。

（3）流通蒸汽灭菌法：是一种常压蒸汽消毒法，细菌繁殖体15-30min可杀灭，但芽胞不全部被杀灭。

(4) 间歇灭菌法（反复多次流通蒸汽）

100℃维持30min ——>温箱过夜——>100℃维持30min——>温箱过夜—

—>100℃维持30min——>温箱过夜——>100℃维持30min。

此法常用于一些不耐高温的培养基，如鸡蛋培养基、血清培养基、糖培养基的灭菌。

（5）高压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌器：15磅/英寸2 (1.02kg/cm 2)，121.3℃温度下维持15～

20min 。

应用此法灭菌，一定要充分排除灭菌器内原有的冷空气。用于耐高温又不怕湿的物品，如：普通培养基、生理盐水、耐热药品、手术敷料等。

设备：高压蒸汽灭菌器

条件：121.3℃，15~20min

主要用于：能耐高热物品等

二、辐射

辐射：能量通过空间传递的一种物理现象。

按辐射对微生物的灭活作用分：

1、非电离辐射:可见光、日光、紫外线。

2、电离辐射:、、γ、χ射线以及高能质子、中子等。

(一)非电离辐射

1.可见光：指在红外线和紫外线之间的肉眼可见的光线，其波长400～800nm。可见光线对微生物一般无多大影响，但长时间作用也能妨碍微生物的新陈代谢与繁殖。

光感作用：指可见光具有微弱的杀菌作用，若将某些带有荧光的染料如结晶紫、美蓝、汞溴红、伊红、沙黄等加到培养基或涂在外伤表面，能增强可见光的杀菌作用，这种作用称之。

2、阳光：直射日光有强烈的杀菌作用，是天然的杀菌因素。许多微生物在直射日光的照射下，半小时到数小时即可死亡。芽胞对日光照射的抵抗力比繁殖体大得多，往往需经20h才死亡。日光的杀菌效力因地、因时及微生物所处环境不同而异。

3、紫外线

波长200-300nm部分有杀菌作用，其中以265-266nm段的杀菌力最强，这与DNA

的吸收光谱范围一致。实验室常使用的紫外线杀菌灯紫外线波长为253.7nm。常用于微生物实验室、无菌室、手术室等的空气消毒，或用于不能用高温或化学药品消毒的物品的表面消毒。还可用于诱变育种。

杀菌机理：

（1）损害DNA构型，影响DNA复制和转录

（2）O2 ——>O3——> [O ]杀菌

紫外线具有明显的杀菌效果！

尤其265~266nm 的紫外线。

紫外线的杀菌作用仅限于照射物体的表面，因此主要用于工作台、手术室的消毒。

(二）电离辐射

三、干燥

微生物在干燥的环境中失去大量水分，新陈代谢便会发生障碍，甚至引起菌体蛋白质变性和由于盐类浓度的增高而逐渐导致死亡。不同种类的微生物对干燥的抵抗力差异很大。主要用于菌种和食品的保藏。

四、超声波

频率在20 000～200 000 Hz的声波称为超声波。主要用于裂解细胞，提取细胞组分。

五、微波

从几百兆赫至几十万兆赫频率的无线电波称为微波。所需时间短、加热均匀。主要用于陶瓷、耐热玻璃容器和塑料器皿，金属器皿忌用。

六、滤过

滤过除菌：通过机械阻留作用将液体或空气中的细菌等微生物除去的方法。但滤过除菌常不能除去病毒、支原体以及细菌L型等小颗粒。主要用于不耐高温的营养液、血清、抗菌素、空气等除菌。

近年已普遍使用可更换滤膜的滤器或一次性滤器。一般滤膜的孔径为0.45μm和0.22μm两种规格。

空气过滤器则常用于超净工作台、无菌隔离器、实验动物房、无菌操作室及疫苗、药品、食品生产中洁净厂房等的空气过滤除尘（菌）。过滤器中的滤纸、滤布及滤毡，以玻璃纤维、合成纤维和其他纤维制成，滤器分粗效（清除5μm 以上粒径的尘埃），中效（清除1μm以上的尘埃）和高效（清除0.3μm以上尘埃）3种等级的滤器。例如，普通动物房的空气只要求粗效过滤，洁净动物房应粗效加中效过滤，生物洁净室则必须经粗、中和高效3级过滤。

第二节化学因素对微生物的影响

一、消毒剂和防腐剂的概念

消毒剂：用于杀灭病原微生物的化学药物。

防腐剂：用于抑制细菌生长繁殖的化学药物。

化学治疗剂：用于消除宿主体内病原微生物或其他寄生虫的化学药物。

二、影响消毒剂作用的因素

第三节生物因素对微生物的影响

一、植物杀菌素（phytocide）

存在于某些植物中的杀菌物质。

如黄连、黄苓、黄柏、大蒜、金银花、连翘、鱼腥草、穿心莲、马齿苋、板蓝根等都含有杀菌物质，其中有的已制成注射液或其他制剂的药品。

二、细菌素（bacteriocin）

是某种细菌产生的一种具有杀菌作用的蛋白质，只能作用于与它同种不同菌株的细菌以及与它亲缘关系相近的细菌。

细菌素可分为三类：

（一）多肽细菌素，分子量2000～10000u，G+菌产生。

（二）蛋白质细菌素，分子量30000-90000u，G-菌产生。

（三）颗粒细菌素，由蛋白质亚单位组成，分子量>107 u，绿脓杆菌产生。

三、噬菌体

感染细菌、支原体和螺旋体的病毒统称为噬菌体（phage），它们又分别称为细菌噬菌体（bacteriophage)和支原体噬菌体（mycoplasmaphage）。

噬菌体形态似蝌蚪状，但不同类型噬菌体的形态构造亦有不同。有些具一个正20面体的头和一条长而能收缩的尾，如大肠杆菌噬菌体T4；有些尾部不能收缩，有些只有短尾，有些无尾，有些则整个呈长丝状。噬菌体的核酸，多数为DNA，少数为RNA。

烈性（毒性）噬菌体与温和性噬菌体

烈性（毒性）噬菌体：噬菌体在宿主菌体内的复制增殖过程与动物病毒相似。

增殖后能使细菌细胞迅速裂解、释放子代噬菌体颗粒的噬菌体称为烈性（毒性）噬菌体。

在固体培养基上生长的菌体感染了烈性噬菌体，可因菌体被裂解出现噬菌斑；在液体培养基中生长的菌体感染烈性噬菌体后，原来混浊的菌液可逐渐变为清亮。

温和性噬菌体：有的噬菌体感染菌体后，并不复制也不使细菌细胞裂解，而是将其核酸整合到细菌细胞染色体中去，随着细菌的繁殖，噬菌体的核酸也复制遗传下去，可能在某一世代，才使细菌细胞裂解，这种噬菌体称为温和性噬菌体。

带这种噬菌体的细菌称为溶原性细菌。也有的噬菌体从感染菌细胞到复制、增殖、释放时，细菌细胞并不裂解而仍存活，如大肠杆菌噬菌体fd。

毒性噬菌体复制周期

吸附

侵入

生物合成

成熟与释放

噬菌现象

（一）液体培养基混浊——> 澄清

（二）固体培养基中，出现噬斑（plaque）

温和噬菌体

前噬菌体（prophage）

溶原性细菌（lysogenic bacterium）

溶原性（lysogeny）

溶原状态

溶原性周期和溶菌性周期

溶原性转换

噬菌体的应用

一种噬菌体只对相应种类的细菌、支原体或真菌发生特异性感染和寄生，故可利用噬菌体鉴定细菌和治疗细菌性疾病。但在抗生素生产和其他发酵工业中也可因噬菌体感染发酵菌而造成危害。自然界中温和噬菌体可介导细菌之间DNA 片断的转导（见第六章第四节），导致细菌部分遗传性状的改变，并与细菌的致病性、耐药性变化有关系。在基因工程实验中应用噬菌体的转导作用，已构建出许多重要的常用载体，如λ噬菌体、丝状噬菌体M13系列载体等。

细菌的鉴定与分型

分子生物学研究的重要工具

细菌感染的诊断与治疗