间充质干细胞培养方法
间充质干细胞培养方法
１、间充质干细胞MSC基本形态?2。干细胞应用与干细胞调控、?３、间充质干细胞MSC生长过程
4. 间充质干细胞ＭＳC培养得合适气体环境
５、细胞培养板得选择
6. 如何选用细胞培养基?
7. 如何维持培养液p H?８。血清与干细胞得培养?9、胎牛血清(F B S )
10.细胞得细菌、真菌污染及排除
就是否需要灭活?
１１、细胞培养污染得预防
1４。胶原酶V １２、使用胰蛋白酶时加入 E ＤTA得目得就是什么?１3、胶原酶得种类与选型?
S胰酶
１5、干细胞得种类与表面标记
18. 干细胞老化得表现与处16.间质干细胞培养原理概述?１7、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?
理
20。冷冻保护剂作用与选择
1９、细胞传代消化过程指导?
21。细胞冻存指导
2２。干细胞冷冻与复苏
2３、移植细胞得基因修饰?１、间充质干细胞ＭＳC基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征,可分为贴附型生长细胞,常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。?间充质干细胞ＭSＣ基本形态:形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核,胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同得突起、可瞧到细胞成螺旋状生长。?
2、干细胞应用与干细胞调控?干细胞得调控就是指给出适当得因子条件,对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发展。?
2.1内源性调控?干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化,包括调节细胞不对称分裂得蛋白,控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。
(1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得。细胞得结构蛋白,特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要、如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器,包含有许多调节蛋白,如膜收缩蛋白与细胞周期素Ａ。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位,从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?(2)转录因子得调控
在脊椎动物中,转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct4 就是必需得。Oct4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FGF－4 等生长因子,能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oc ｔ4 缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子(LI Ｆ)对培养得小鼠ES细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用,说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得、又如Tｃf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要、Tcf／Leｆ就是Wnｔ信号通路得中间介质,当与β－Ｃateｎin形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。
2.2外源性调控?除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(１)分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖,分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用,它们就是TＧＦβ家族与Ｗｎt 信号通路、比如TＧF 家族中至少
有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子(GDNＦ)不仅能够促进多种神经元得存活与分化,还对精原细胞得再生与分化有决定作用。GDNF缺失得小鼠表现为干细胞数量得减少,而ＧDNF得过度表达导致未分化得精原细胞得累积。Wnts 得作用机制就是通过阻止β—Cａtｅｎｉn分解从而激活Ｔｃｆ/Ｌef介导得转录,促进干细胞得分化。比如在线虫卵裂球得分裂中,邻近细胞诱导得Ｗnt 信号通路能够控制纺锤体得起始点与内胚层得分化、?(２)膜蛋白介导得细胞间得相互作用
有些信号就是通过细胞－细胞得直接接触起作用得。β-Cａｔeｎin 就就是一种介导细胞粘附连接得结构成分、除此之外,穿膜蛋白Notch及其配体Delta 或Jagged 也对干细胞分化有重要影响。在果蝇得感觉器官前体细胞,脊椎动物得胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌与血液系统中,Notch 信号都起着非常重要得作用、当Nｏtｃh 与其配体结合时,干细胞进行非分化性增殖;当Notch 活性被抑制时,干细胞进入分化程序,发育为功能细胞、?(3)整合素(Iｎtegrin)与细胞外基质?整合素家族就是介导干细胞与细胞外基质粘附得最主要得分子。整合素与其配体得相互作用为干细胞得非分化增殖提供了适当得微环境。比如当β1整合素丧失功能时,上皮干细胞逃脱了微环境得制约,分化成角质细胞。此外细胞外基质通过调节β１整合素得表达与激活,从而影响干细胞得分布与分化方向。
2、3干细胞得可塑性?越来越多得证据表明,当成体干细胞被移植入受体中,它们表现出很强得可塑性。通常情况下,供体得干细胞在受体中分化为与其组织来源一致得细胞、而在某些情况下干细胞得分化并不遵循这种规律、１９９9年Goodeｌl 等人分离出小鼠得肌肉干细胞,体外培养5 天后,与少量得骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射得小鼠中,结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系、这种现象被称为干细胞得横向分化(tｒans—ｄifｆｅrｅｎtiａtion )。关于横向分化得调控机制目前还不清楚、大多数观点认为干细胞得分化与微环境密切相关、可能得机制就是,干细胞进入新得微环境后,对分化信号得反应受到周围正在进行分化得细胞得影响,从而对新得微环境中得调节信号做出反应、?
３.间充质干细胞ＭSC生长过程?潜伏期→指数增生期→停滞期?(1)潜伏期(latｅｎt phａse) 细胞接
种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态得悬浮期。此时,细胞质回缩,胞体呈圆球形,然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束。细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体得理化性质等密切相关。一般情况下,原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-2４小时或更多,而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-３０分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段,才进入生长与增殖期。原代培养细胞潜伏
?(２)指数增生期长,约2４-96小时或更长, 连续细胞系与肿瘤细胞潜伏期短,仅需6—2４小时、?
期(ｌoｇaｒithｍｉcｇｒowｔｈｐhase)
这就是细胞增殖最旺盛得阶段,分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长就是否旺盛得一个重要标志、通常以细胞分裂相指数(Mitoｔic index, ＭI )表示,即细胞群中每100０个细胞中得分裂相数。一般细胞得分裂指数介于0、1％—0、5% ,原代细胞分裂指数较低,而连续细胞与肿瘤细胞分裂相指数可高达3%-5%。指数增生期得细胞活力最好时期,就是进行各种实验最佳时期,也就是冻存细胞得最好时机。在接种细胞数量适宜情况下,指数增生期持续3—5 天后,随着细胞数量不断增多、生长空间减少,最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动,这种现象称接触抑制现象(ｃontact iｎhｉbｉtion)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象,能继续移动与增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(piled ｕp)、细胞接触汇合成片后,虽然发生接触抑制,但只要营养充分,细胞仍能进行增殖分裂,因此细胞数仍然在增多。但就是,当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养枯竭与代谢产物得影响,导致细胞分裂停止,这种现象称密度抑制现象(Deｎsity Inhibitiｏｎ)、?
(3)停滞期(Stagnate phａｓe) 细胞数量达到饱与密度后,如不及时进行传代,细胞就会停止增殖,进入停止期、此时细胞数持平,故也称平台期(Pｌateａu phase)、停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动。如不进行分离传代,细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒,出现形态改变,
贴壁细胞会脱落,严重得会发生死亡,因此,应及时传代。
?４.间充质干细胞MSC培养得合适气体环境
干细胞相关得培养液都必须在5%ＣO2 得气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体就是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气与二氧化碳。氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖得能量与合成细胞生长所需用得各种成分。开放培养时一般把细胞置于9５%空气加5％二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既就是细胞代谢产物也就是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中得主要作用在于维持培养基得ｐH 值。大多数细胞得适宜pH 为７。2—7。４,偏离这一范围对细胞培养将产生有害得影响。一般情况下,细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长、?
５。细胞培养板得选择?细胞培养板依底部形状得不同可分为平底与圆底(U 型与Ｖ型);培养孔得孔数有６、12、２4、４8、９6、384、１５36 孔等;根据材质得不同有Ｔｅraｓaｋi 板与普通细胞培养板。具体选择时根据培养细胞得类型、所需培养体积及不同得实验目得而定、
(１)平底与圆底(U 型与V 型)培养板得区别与选择
不同形状得培养板有不同用途、培养细胞,通常就是选用平底得,这样便于镜下观测、有明确得底面积、细胞培养液面高度相对一致。因此做MTＴ等实验时,无论就是贴壁与悬浮细胞,一般选用平底板。测吸光值一定要使用平底得培养板。要特別注意材质,标示“ＴｉｓｓｕｅCulture (ＴC) Ｔrｅated”就是养细胞用得。U 型或Ｖ型板,一般在某些特殊要求時才使用。如在免疫学方面,当做两种不同淋巴细胞混合培养時,需要二者相互接触刺激,这时一般会选用U 型板,因为细胞会由于重力得作用而聚集在很小得范围内內。圆底培养板还会用于同位素掺入得实验,需要用细胞收集仪收集细胞得培养,如“混合淋巴细胞培养”等、Ｖ型板常用做细胞杀伤、免疫学血凝集实验。细胞杀伤这种实验也可用U 型板替代(加入细胞后,低速离心)。
(2)Ｔerasaki 板与普通细胞培养板得区别
Terasakｉｐｌaｔe主要就是用于晶体学研究,产品设计便于对晶体得观察与结构分析。有两种s ｉtting 与handing drop 两种方法,两种方法应用产品得外形结构也不同、材料上选择crｙsｔaｌｃｌaｓｓpoｌyｍｅｒ,特殊得材料有利观察晶体结构。细胞培养板主要就是PＳ材料,材料就是t ｒeａted ｓuｆface,便于细胞贴壁生长与伸展、当然还有浮游细胞得生长材料,同时还有ｌoｗbiｎdiｎg sｕｒｆaｃe
(３)细胞培养板与酶标板得区别?酶标板一般要比细胞培养板贵,细胞板主要做细胞培养,也可以用来测蛋白浓度;酶标板包括包被板与反应板,一般不用做细胞培养,它主要做免疫酶联反应后得蛋白检测,需要更高得要求与特定得酶标工作液。
?(4 )常用不同培养板得孔底面积及推荐加液量?不同孔板所加培养液得液面都不宜太深,一般在
2~3mm范围,结合不同孔得底面积就可算出各培养孔得适宜加液量(参考下表)。若加液量过多会影响气体(氧气)交换,而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验得目得不同灵活掌握。?常用得培养器皿
24孔培养板培养器皿底面积(ｃm2) 加培养液量(mL) 可获细胞量?
96孔培养板０、3２０.1 105?
12孔培养板4、５ 2.0 106
２1。０５×105?
6 孔培养板9.６２。5 2。5×1０6
4 孔培养板2８５、0 ７×1０6
3。５cｍ培养皿8 ３。0 2。0×１０6
6cm培养皿21 5、0 ５.2×1０６?9ｃm 培养皿49 10.0 1２.2×106
10cｍ培养皿5５10。013.7×1０6
25ｃm 塑料培养瓶25 5。0 5。２×106?７5ｃｍ塑料培养瓶７５15~3０2×１０7
250ｃm 玻璃培25ｃm 玻璃培养瓶19 4.０3×106?１00ｃm玻璃培养瓶3７.5 1０、0 6×１06?
养瓶７8 １５。0 ２×107?２500cｍ旋转培养瓶７00１00～250 2.5×10８
注:各种单层生长得细胞在培养皿中长满得细胞数,主要取决于器皿底表面积与细胞体积得大小。上表以293 细胞为例给出得可获细胞量仅作参考。?
６.如何选用细胞培养基
培养基就是维持体外细胞生存与生长得基本溶液,就是组织细胞培养时最重要得条件。细胞培养基大致有: ?
(1)合成培养基?主要成分为:氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质(核酸降解物、氧化还原剂等)。常用得有:
①199细胞培养基及其改良品种。１950年由Morgan等设计,除BSS 外,含有53 种成分,添加适量得血清后,可广泛用于多种细胞培养、病毒学、疫苗生产等。１99 (HB)细胞培养基,主要应用于Vero 细胞、地鼠肾细胞转瓶培养生产狂犬、乙脑等疫苗,具有高缓冲性能,能够有效提高病毒滴度。
②BMＥ细胞培养基。基础Ｅagle 培养基(ＢaｓaｌMedｉum Ｅagｌｅ),1955年由Eagｌｅ设计,BＳS+12 种氨基酸＋谷氨酰胺+8种维生素。简单、便于添加,适于各种传代细胞系与特殊研究用,在此基础上改良得细胞培养基品种有ＭEM、DＭEM、IMDＭ等。?③ＭＥM细胞培养基。低限量Eagle 培养基(Ｍinｉmal Essential Mediuｍ),1959 年修改配方,删去赖氨酸、生物素,增加氨基酸浓度,适合多种细胞单层生长,就是一种最基本、适用范围最广得培养基,就是一种被广泛应用得培养基。需要注意得就是,MEM 细胞培养基有含Eａrle’s平衡盐得类型,也有含Hankｓ’平衡盐得类型;有高压灭菌型得,也有过滤除菌型得;还有含非必需氨基酸得类型。生产与科研时,应根据实际情况注意选择合适得MEM 细胞培养基。另外,因MEM 培养基营养成分所限,针对生产之特定细胞培养与表达时,并不一定就是使用效果最佳或者最经济得培养基、?④ＤＭEＭ细胞培养基及其改良品种。DＭＥＭ由Dulbecco 改良得Eaｇle 培养基,各成份量加倍,分低糖(1000ｍg/L)、高糖(450０mg／L )。细胞生长快、附着稍差得肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好,常用于杂交瘤得骨髓瘤细胞与ＤＮＡ转染得转化细胞培养。例如ＣHO 细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPＯ。
⑤IMＤM 细胞培养基。IMDM就是由Isｃove’ｓ改良得Ｅagle 培养基,增加了几种氨基酸与胱氨酸量。可用于杂交瘤细胞培养,以及无血清培养得基础培养基。?⑥RＰMI－164０细胞培养基。Moore 等人于1９67 年在Roｓwell Paｒk Memoｒial Ｉｎstｉtute 研制,针对淋巴细胞培养设计,ＢSＳ＋21种氨基酸+维生素１1 种等,广泛适于许多种正常细胞与肿瘤细胞,也用做悬浮细胞培养。?⑦Fischer’s细胞培养基。用于白血病微粒细胞培养。
⑧HamＦ10、F12 细胞培养基。1963 年、196９年由Ham设计,含微量元素,可在血清含量低时用,适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞,F1２适用于CHＯ细胞、
⑨DＭＥM／Ｆ12细胞培养基。DMEＭ与F1２细胞培养基按照1:１比例混合效果最佳,营养成分丰富,且可以使用较少血清,或作为无血清培养基得基础培养基。
(２)低血清细胞培养基?主要应用于VＥRO 细胞、BＨK21 细胞等细胞在转瓶、微载体反应器中得?(３)无血清培养基?就是设计用来在无血清条件下促使特殊类型得细胞生长或进行专门应培养、?
用得培养基。需要添加生长因子与或细胞因子,含有个别蛋白或大量蛋白组分。?
(4)替代天然培养基
培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构得组分,所有得成分均有已知得化学结构。面对如此多得细胞培养基,对细胞培养基得选用,建议:
①可以查阅相关文献,或在购买细胞株时咨询选用最适合细胞株得培养基,或购买相配套得细胞培养基产品、
②许多培养基都适合多种细胞株得培养,可以采用现有得培养基进行试验。?③根据细胞株得特点、实
验得需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选1６40;进行细胞杂交、基因转移实验,可选择ＩＭDＭ。
④结合细胞特性及培养基得培养效能,用多种培养基培养目得细胞,观察其生长状态,可以用生长曲线、
?注:目前也有不少商业化得mｓc培养基,如克隆形成率等指标判断,根据实验结果选择最佳培养基。?
百恩维得间充质干细胞无血清培养基,间充质干细胞培养基(低血清)
7。如何维持培养液p Ｈ?配好得培养液变碱(变紫红)就是正常得现象。暴露在空气中得培养液,因为大气中二氧化碳得浓度很低,培养液中得ＨＣO3 -被渐渐耗掉,培养液得ｐH值也逐渐升高,变成了紫红色、如果培养基pH值偏碱得程度不大,可将装培养液得瓶口拧松,放置于二氧化碳培养箱中一段时间,让培养箱中得CO2进入培养液,pH值就可以纠正。如果ｐH值偏离得程度很大,可以通过添加少量无菌得H Ｃｌ或者ＮaOH调节pH,便可以使用。将配制好得培养基小剂量分装,可以避免反复开盖引起其中得二氧化碳逸出而造成pH升高。同时因NａHCO３遇热不稳定,会分解释放出CO２,而使培养基得pH升高,偏碱。因此在配置使用培养得过程中应注意: ?(1)动作迅速,不可使培养液长时间处于较高室温下; ?(2)配置过程中,混匀时切不可加热。混匀后应立即放入4°C冰箱,待过滤时再取出; (3)使用完毕应尽快将瓶口封好,放于4°Ｃ冰箱保存。?通过在培养液中同时添加Ｈｅｐｅｓ也可以有效得稳定pＨ值、Hepes (羟乙基哌嗪乙硫磺酸)就是一种非离子两性缓冲液,它在ｐH 7。２～7。４范围内具有较好得缓冲能力。其最大优点就是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定得pH 值。在这种培养条件下,细胞培养瓶得盖子应拧紧,以防止培养液中所需得少量碳酸盐散入空气中、该缓冲液使用得终浓度为１0~50mmol/L,一般培养液内含20mmｏｌ/LＨepes 便可达到缓冲能力。Hep ｅs 得使用方法有以下两种:?(1)Hepes 可按所需得浓度直接加入到配制得培养液中,再过滤除菌。每１０00ml 培养液中加入2。38克HＥＰES,溶解后用1N ＮａOH 调pH 至7.2,过滤除菌后使用、此时HEPEＳ得使用浓度为1０mmoｌ/L。?(2)配成１０0ｘ贮存液(1 mol／Ｌ),使用前取99mL 培养液加入ｌmＬ贮存液,最终应用浓度仍为1０mmol／L、1 moｌ/L (100x)Hｅpeｓ贮存液配制方法:取２3。8g Hepｅs 溶于９0ml 双蒸水中,用1N NaOH 调pＨ至7、5~8。0,然后用水定容至１00mＬ,过滤除菌,分装小瓶(2mＬ／瓶),4℃或—20℃保存。
８.血清与干细胞得培养?干细胞在体内存在得量很少,处在一个个环境相对稳定得“niｃhｅ”中,所以一旦完成分离进入体外环境,最重要得就就是保证细胞得活力不受影响,那么就必须提供一个相对稳定得培养环境、这些环境就就是靠培养基与培养箱来提供了。培养液中最重要得莫过—--－血清,特别就是对干细胞来说。所以为了最优得干细胞培养效果,推荐选用对应得干细胞专用血清。牛血清就是最常用得,但就是根据血清得来源不同又可以分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产得胎牛;新牛血清取自出生2４小时之内得新生牛;小牛血清取自出生10—30 天得小牛、显然,胎牛血清就是品质最高得,因为胎牛还未接触外界,血清中所含得抗体、补体等对细胞有害得成分最少,所以也成为了干细胞培养得首选、培养中如何正确得使用血清?避免不好得影响呢？
血清得浓度:对大部分得干细胞,最佳得血清浓度就是１０％。过高得血清浓度会导致细胞出现分化得现象,如果就是需要高浓度得血清,培养得时间也不能超过两周,否则会导致细胞分化能力下降。过低得血清会导致细胞得增殖速度下降。血清得溶解:必须在４℃进行,最好过夜溶解。这样可以减少沉淀得产生,避免营养物质得流式。同时也要避免血清得过滤,如果需要过滤可以与培养基一起过滤。细胞培养液中添加得血清有牛血清、马血清、人血清等,其中牛血清就是最常用得血清,分为胎牛血清与新生小牛血清。胎牛血清就是从母牛破腹取出得胎牛中分离出得血清,价格昂贵。新生小牛血清就是从刚出生得尚未哺乳得小牛中分离出来得血清,如厂家能做到这一点,新生小牛血清得质量与胎牛血清得质量相差不大。如小牛出生后已哺乳,从这种小牛中取出得血清中可能含有较多得生物活性物质,其质量明显不如前两种。
血清得质量,种类及使用得浓度都有可能影响细胞得生长,而不同批次得血清支持细胞生长得能力也不同,尤其就是对克隆细胞得生长,某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长得物质。注意以下几点:?(1)
需要长期保存得血清必须储存于－20℃或-80℃低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。由于血清结冰时体积会增加约１0%,因此,血清在冻入低温冰箱前,必须预留一定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。?(2)瓶装血清解冻需采用逐步解冻法:-20℃或-８0℃低温冰箱中得血清放入4℃冰箱中溶解1 天。然后移入室温,待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀得发生。切勿直接将血清从-２0℃进入３7℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀、影响使用效果!
(３)热灭活就是指56℃,30分钟加热已完全解冻得血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理得目得就是使血清中得补体成分(coｍｐlemｅｎt )灭活、除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清得质量。补体参与反应有:细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞与血小板释放组胺, 增强吞噬作用,促进淋巴细胞与巨噬细胞发生化学趋化与活化。?(4 )切勿将血清在37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中得有效成分会破坏而影响血清质量。?(5)血清中得沉淀物絮状物:主要就是血清中得脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身得质量、可用离心３0０0ｒpm, 5 分钟去除,也可不用处理。显微镜下“小黑点”:经过热处理过得血清,沉淀物得形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”,常误认为血清受污染。一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长。?
9。胎牛血清(F B Ｓ)就是否需要灭活
灭活得目得就是去除血清中得补体成分,避免补体对细胞产生细胞毒害作用。胎牛血清(FBＳ)对许多细胞系均有促生长作用,主要适用于细胞株得保藏及特殊用途得细胞株得体外培养。胎牛血清就是取自剖腹产得胎牛、因为胎牛还未接触外界,血清中所含得抗体、补体等对细胞生长有害得成分最少,质
?1０.细胞得细菌、真菌污染及排除?真菌污染就是细胞培养过程量就是最高得。所以不必要灭活。?
中最常见得一种,尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞得多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不混浊,倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行得丝状、管状、及树枝状菌丝,并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列得菌珠;念珠菌或酵母菌形态呈卵形,散在细胞周边与细胞之间生长。镜下瞧时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长得菌丝相混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
细菌就是一种原核细胞微生物,其大小以微米(μｍ)计。常见得污染细菌有革兰氏阴性菌与大肠杆菌、假单胞菌等,革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。一旦发生细菌污染较易发现,多数情况下培养液短期内颜色变黄,表明有大量酸性物质产生,出现明显混浊现象;有时静置得培养液液体初瞧不混浊,但稍加振荡,就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察,可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类;有得培养液改变不明显而又疑有污染,可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物得培养液接种,也可取10ml 细胞悬液以100rpm 离心5miｎ,沉淀中加入无抗生素得培养液2mｌ,置于37℃培养,24h 可得结果。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗, 最后变圆脱落死亡,造成试验失败与细胞株(系)丢失。
细菌与真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生,而且由于增生迅速,多再发生污染4８h 以内就已明显。在实验得最初两天密切观察实验样品就是否有污染发生,有利于及时采取措施予以补救或排除、培养细胞一经污染,多数较难处理。如果污染细胞价值不大,宜弃之;有细胞株留存得或可购置得,可在寻找原因后彻底消毒操作室与二氧化碳培养箱(若发现真菌污染,可在污染孔内加入1moｌ/L氢氧化钠或硫酸铜
11。细胞培养污染得预防?溶液处理(具体操作方法可参考细胞培养污染得预防),复苏或重新购置细胞,再培养、若污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采用5～1０倍于常用量得抗生素冲击,加入高浓度抗生素后作用２4～48h,再换入常规培养液,有时可能奏效。细胞培养中常用得抗生素及用量见下表。
常用抗生素用量与效应?抗生素抗菌谱浓度(量/ｍL) 细菌真菌支原体
青霉素G+ 100～100０μg
链霉素Ｇ—1０0～１00０μg?庆大霉素G+ /G—+ ５0～２00μg
四环素G+ ／G- + １0～５0μg
卡那霉素G+ /G—＋100~1００0μg?两性霉素+ 常用2μg/mL
制霉菌素+ 常用25μg/mL?+表示效应程度?高浓度得抗生素与抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素与抗霉菌素产生毒性得剂量水平、这点在使用抗生素如两性霉素 B 与抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面就是推荐得确定毒性水平与消除培养污染得实验步骤、(1)在无抗生素得培养基中消化、计数与稀释细胞,稀释到常规细胞传代得浓度、?(2)分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中、在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素Ｂ推荐下列浓度,0、２5,0、50,1。0,2.０,4、０,８、０mg/mｌ、
(3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降与变圆。
(4)确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度２～3倍浓度得抗生素得培养液培养细胞２～３代。
(5)在无抗生素得培养基中培养细胞一代。
(６)重复步骤4。
(7)在无抗生素得培养基中培养4～6代,确定污染就是否以已被消除。?
12.使用胰蛋白酶时加入E DTA得目得就是什么
体外培养得细胞受到严重污染时,有时即使想尽各种办法也难以挽回。因此,防止污染,预防就是关键。只有将预防措施贯穿于整个细胞培养得始终,才能将发生污染得可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手: ?(1)添加抗生素各种抗生素性质不同,对各种微生物得作用也不同,联合应用比单用效果好,预防性应用比污染后使用好(但迄今尚无对抗支原体特效抗生素)、但反复使用抗生素会使微生物产生耐药性,且对细胞本身也有
一定影响,因此为避免诱导抗药细菌,应定期更换培养系统中得抗生素,或尽可能不用抗生素处理。?(２)从物品、用品消毒灭菌着手细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底,各种溶液灭菌除菌要仔细,并在取样检菌一周后确认无菌才能使用。同时,在无菌过滤操作中,随着滤过体积得增大,滤膜破损得可能性增加,故应选择最后过滤得液体进行检测。定期对二氧化碳培养箱进行消毒。具体操作:７５%得酒精搽拭培养箱后,使用可移动得紫外灯至少消毒30mｉn,加入高压灭菌过得超纯水于培养箱水槽中保持湿度。也可配制３０0ml得饱与硫酸铜加3L 灭菌超纯水混合成硫酸铜溶液加入水槽中。
(3)从操作者做起?①进无菌室前要彻底洗手,按规定穿隔离衣。开始操作前要用75%酒精棉球擦手、擦瓶口与烧灼瓶口。
②操作者动作要轻,安装吸管帽、打开或封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意,金属器械不能在火焰中长时间烧灼,以防退火;烧过得器械要冷却后才能使用;已吸过培养液得吸管不能
再用火焰烧灼,因残留在吸管内得培养液成分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质,吸管再用时会将其带到培养液中;胶塞、橡皮乳头及塑料得细胞培养用品过火焰就是也不能时间太长,以免烧焦产生有毒气体,危害培养细胞,同时塑料细胞培养用品也会产生变形影响使用。
③使用培养液前不宜过早开瓶,开瓶后得培养液应保持斜位,避免直立,以防止下落细菌得污染。不再使用得培养液应立即封闭瓶口,培养得细胞在处理之前勿过早暴露在空气中。
④操作时尽量不要谈话,咳嗽以防止来自唾沫与呼出得气流所造成得污染。
⑤吸取培养液、细胞悬液时,应专管专用,一旦发现吸管口接触了手与其她污染物品应弃去,以防止污染扩大或造成培养物之间得交叉污染。?⑥操作完毕后应整理好工作台面,用消毒水浸泡得纱布擦拭台面。
(４)防止细胞交叉污染所有从别处转来得或就是自己所建得细胞系都要早期留有得充足得冻存储备,一旦怀疑发生交叉污染,可做细胞遗传学方面得鉴定,如发现原有得细胞遗传物发生改变,可以复苏早
期冻存得细胞使用、重要细胞系(株)得传代工作应由两人独立进行。
(5)无菌室得彻底消毒?①新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室。使用前应稀释即配即用。新洁尔灭与酒精相比,最大得优点就是便宜,因为新洁尔灭500ｍl只需5元,而且可以稀释50倍用,而同样量得酒精价格可能就是新洁尔灭得几十倍。
②甲醛熏蒸法:甲醛就是一种广谱灭菌剂菌,其水溶液与气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。甲醛价廉,熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、橡胶等。市售得甲醛水溶液中一般含37－４0％得甲醛。
?13。胶原酶得种类与选型?在细胞得取材中,各种消化酶经常用于组织得分散,在组织中取得目得细胞。例如脂肪间质干细胞(ADSCs )、软骨细胞培养等。其中胶原酶就是最常用得一种。?种类:I-IV 型选择:结缔组织I,IＩI 型;骨组织、脂肪组织I 型;软骨组织IＩ型;胰岛细胞IV 型。崩裂酶Dispａse 作用:用于增强胶原酶得消化能力,对细胞损伤最小。
?14.胶原酶V S胰酶?胰蛋白酶(Tｒypsin),简称胰酶,可使细胞间得蛋白质水解从而达到细胞离散得目得,就是目前应用最为广泛得消化剂,主要采自牛或猪得胰脏,呈白色粉末状,易潮解,应在低温干燥处保存、胰酶适用于细胞间质较少得软组织(如胚胎、上皮、羊膜、肝、肾等软组织)及传代细胞得消化,但对于纤维性组织或较硬得癌组织则效果较差。胰酶活性可用消化酪蛋白得能力表示,常见有1:125 与1:250,即一份胰酶可消化125 或２５0份酪蛋白、组织培养用胰酶溶液一般配制成0、１～0、25％浓度,常用0.25%,特别敏感得可以使用0.125％。胰酶得消化效果主要于pH 值、温度、胰酶得浓度、组织块得大小与硬度有关、胰酶作用及溶解得最佳pH就是8～9,配制胰酶溶液可将液体调至ｐＨ8 左右,充分溶解,过滤除菌,过滤后再调至ｐH７.4 左右。胰酶作用得最适温度为３7℃,在夏季室温2５℃以上对一般传代细胞也能达到消化效果。一般新鲜配制得胰酶消化能力较强。消化时间要根据不同得情况而定,胰酶对细胞得分离效果与细胞得类型、特性与瓶壁表面特性有关。一般来说,温度低,组织块大、胰酶浓度低者,消化时间长,反之则相应减少时间。酶得浓度过大或消化时间太长,会导致消化过度,对细胞得活性损伤较大,并有部分细胞漂浮,被消化掉;消化时间太短,消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性,也达不到分散细胞得目得。影响消化速度得因素较多,主要有胰酶溶液得活性(配制条件、冻存或4℃保存时间长短、就是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等)、消化时得温度(气温、细胞培养瓶及胰酶溶液得温度)以及所加胰酶溶液得多少等。在使用胰酶进行消化时,可改变不同参数以确定出最佳消化效果。
胰酶得配置方法: ?(１)称取胰酶:按胰酶液浓度为0。25 ％,用电子天平准确称取粉剂溶入ＰBS 或
D-hanks 中,低速搅拌３～4小时或者置于４℃过夜混匀(低速很重要,机械搅拌对酶就是一种冲击,如果起沫严重,有可能导致酶得变性)、
(0)调节ｐH 值为7.4 左右。用注射滤器过滤除菌,因蛋白制剂不宜4℃长期保存,忌反复冻融,建议分装成小瓶(离心管)于－２0℃冻存或置4℃保存备用、
注意事项:
①就是否需要4℃放置过夜,取决于胰酶得纯度。过去得胰酶纯度不高,所以难以溶解,需要4℃过夜。而现在得胰酶纯度都很高,就没有必要4℃过夜。从理论上来说,4℃放置过夜,给细菌生长得机会,尽管过滤可以除去细菌,但除不掉其代谢产物。
②如果胰酶不溶、有絮状物,考虑可能得原因有:胰酶过期或就是已经部分变性;溶液pH 值不对;在没过滤之前得絮状沉淀就是正常现象,因胰酶多取自动物胰腺,沉淀为组织块,过滤后即可、?③Ｃａ2+、Ｍg2+、血清与蛋白质对胰酶得活性有一定得抑制作用,所以需用不含Ca2+、Mｇ２＋、这些离子得BＳS 如Ｄ-Hａnks 或者PBS 来配制。正就是这个道理,开始消化前,需用PBS 将培养液冲洗干净后方加入胰酶进行消化,否则会大大影响胰酶得作用效果、终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞得作用、?④对于一些贴壁特别牢固得细胞,可在上述配方中,加入０。02％得EDTA,将胰酶与ＥDTＡ(乙二胺四乙酸)混合来进行消化、EDTA 可通过结合(螯合)细胞间质中得二价阳离子从而破坏细胞连接从而增加消化效力、但因ＥＤTA 不能被血清中与,终止消化后,需用培养
液或PＢS 彻底冲洗培养瓶(板),使得更好得再次利用培养瓶(板),否则再培养时可能会导致细胞容易
脱壁。EＤTA在常温下难溶于酸,微溶于水(20℃时溶解度只有0、02g ),但在碱性溶液中溶解性较大。因此为了更快得溶解EDＴA可采取调节PH或者就是加热得办法。但须注意:由于胰酶不耐高温,因此待EDTＡ溶解后,温度有所下降才能加入胰酶。如果就是单独配置EDTA 溶液,配制后可过滤除菌,也可高温消毒灭菌、
胶原酶(ｃollagenasｅ)就是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备得,主要水解结缔组织中胶原蛋白
成分。当拟消化得组织较硬,内含较多结缔组织或胶原成分时,用胰蛋白酶解离细胞得效果较差,这时可采用胶原酶解离细胞法。胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大、因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织,可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。常用剂量为最终浓度20０U ／ml(约为1ｍg/mL )或0、03％～0、３%。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶,要根据所要分离消化得组织类型选择胶原酶类型、具体可见胶原酶得种类与选型。胶原酶消化缓与、无须机械振荡,因而可进一步提高细胞成活率,但胶原酶价格较高,大量使用将增加实验成本。胶原酶得配置胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌与储藏。关于胰蛋白酶配置方法可见:胰蛋白酶消化法、
注意:因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。钙、镁离子与血清成分不会影响胶原酶得消化作用,因而可用ＢSS(如D—hａｎkｓ或者ＰBS)或含血清得培养液配制。
胶原酶得使用:
(1)将漂洗、修剪干净得组织剪成１~2mm３左右小块?(２)将组织块放入离心管(三角烧瓶)中加入3０~50 倍体积得胶原酶溶液,旋紧盖子(密封烧瓶)、
(3)将烧瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱内,每隔３min 振摇一次,如能放在３7℃得恒温震荡水浴箱中则更好。消化时间与组织得类别很有关系,对于某些肿瘤组织或其她较致密结缔组织,消化时间4～48ｈ,对于容易消化得组织可以采用3７℃震荡消化15~45ｍｉn,也可以根据具体情况而定。如组织块已分散而失去块得形状,一经摇动即成细胞团或单个细胞,可以认为已消化充分。上皮组织经胶原酶消化后,由于上皮细胞对此酶有耐受性,可能仍有一些细胞团未完全分散,但成团得上皮细胞比分散得单
个上皮细胞更易生长,因此,如无特殊需要可以不必再进一步处理。
(4)收集消化液(有时含个别组织块及没有充分消化得组织碎屑则需用1０0目不锈钢网过滤),离心1000r/miｎ,５min,去除上清,用Hankｓ液或者无血清培养液离心漂洗1～2 次,去除上清,加培养液制
?胶原酶Vs 胰蛋白酶胰蛋白酶与胶原酶消化时间与浓度上得差异,依消化成细胞悬液,接种培养瓶。?
温度而异。另外这两种酶也可混合应用,浓度为:胰蛋白酶0。1mg+胶原酶0、２5ｍｇ/ｍL。两酶相比得差别见表１与表2、?表1 胰蛋白酶与胶原酶生物活性得差别项目胰蛋白酶胶原酶?消化特性适用于消化软组织适用于消化纤维多得组织
用量０、0１％~0。５% 0.1～0。3 mｇ／mL(２00 U/mＬ)
消化时间0、5 ~2h １～１2ｈ?ｐH 8～９6、5~7、0
作用强度强烈缓与
细胞影响时间过长有影响无大影响
血清抑活有无
Ｃa2+与Mg2+ 有影响无影响?
表２胰蛋白酶与胶原酶在不同温度下消化各种组织小块(0、5～1cm3 )时所需时间(h)
酶种类与用量较硬组织软组织
4℃室温37℃ 4℃室温37℃?胰蛋白酶(0.2５％) 24~４８1~6 1~2 １2~2４1~２０、5～１?胶原酶(12０0 U/mL) 2４6 0。5 1２3 0。25?胰蛋白酶(0。25％)+胶原酶(200Ｕ／ｍL)１
15.干细胞得种类与表面标记
2～46 12～２44~12 12~24 6～１2 1~2?
?
通过流式细胞仪分析,间充质干细胞特异性表面抗原有:SH2、ＳH3、CＤ2９、ＣD4４、ＣD7１、ＣD9０、ＣＤ１06、CD120a、CD1２4、ＢMＳC:就是骨髓中除HSC 以外得非造血性干细胞,骨髓中绝大多数就是ＨSＣ,BMSＣ只占骨髓有核细胞得0。０0１%～0。０１% 。因此鉴定ＢMSC 得方法就是在骨髓得干细胞中排除ＨSC——ＢMSC:CD45—、CＤ３4-、ＣD29+、CD14+／HＳＣ:C Ｄ34＋、
?１6。间质干细胞培养原理概述?间质干细胞(ｍesｅnchymal steｍｃell,MSC)就是一群中胚层来源得具有自我更新与多向分化潜能得多能干细胞,在适宜得培养条件下可分化成多种组织细胞,包括成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。
间质干细胞最早就是从骨髓中分离得到得,正常情况下,它在骨髓中得比例非常低,仅占单核细胞得1/
１05 ～1/１０4 。骨髓中单个核细胞包括淋巴细胞与单核细胞,其体积、形态与密度与其她细胞不同,红细胞与多核白细胞密度较大,为1、０90 g／ｍｌ左右,而淋巴细胞与单核细胞密度为1。0７5～1。09０g/ml,血小板为1。０３０～1、035 g/ml。为此利用一种密度介于1。075~1.092 g／ｍl之间而近于等渗得溶液(分层液)进行密度梯度离心,使一定密度得细胞按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。常用得分层液有Ｆｉｃｏｌｌ与Peｒcｏlｌ两种。?在骨髓得原代培养物中,除了贴壁生长得成纤维细胞样得间质干细胞外,还混杂着一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等,要得到较均一得间质干细胞,必须除去其她细胞、根据其她细胞得特性,可采用不同得方式排除它们。对于红细胞,因其不贴壁,可通过换液除去。对于贴壁得单核巨噬细胞,可根据其黏附能力得不同,通过调整Ｔrypｓｉn/ＥＤTA 得消化时间,保证间质干细胞在短暂得作用时间内与塑料培养瓶壁分离,而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等仍贴附于培养瓶壁,从而使间质干细胞与其她得贴壁细胞得到分离、
在传代培养中,接种密度就是影响体外培养间质干细胞增殖潜能得重要因素。低密度接种时,间质干细胞得增殖能力明显提高,而诱导细胞分化时则需要较高得细胞密度,这可能与分化时细胞与细胞间得相互作用有关、而在培养过程中,若细胞过度融合会促进其分化趋向,故要保持干细胞未分化状态,要及时17。间质干细胞成脂与成骨诱导分化
传代。?
?
成骨与成脂诱导就是鉴定干细胞得一种重要得方法,也就是最常用、报道见得最多得方法、成骨最常用得染色方法就是茜素红染色(碱性磷酸酶),成脂诱导最常用就是OｉｌRed Ｏ(油红O)染色法。下面我介绍一下这两种染色方法得原理与步骤。茜素红染色方法与原理:成骨诱导得过程就是使钙离子能够以钙盐得方式沉淀下来,这就就是我们常说得“钙结节”、鉴定钙结节得染色方法常用“茜素红”。?步骤: ?(1)吸去诱导液,再PBS 洗一到两次;?(2)加入10％中性甲醛,固定30mｉn-６0miｎ;
(３)吸去固定液,加入０、１％得茜素红染色液,染色６-1０ｍｉn;
(4)用PBS 洗两次,去处残留得染色液;?(5)加入PＢS,完成染色; ?茜素红:茜素磺酸钠,茜素S,茜素红S,茜素胭脂红,1,2—二羟基蒽醌—3-磺酸钠,1,2-二羟基蒽醌—3－磺酸钠盐。橙黄色或黄棕色粉末。易溶于水,微溶于乙醇,不溶于苯与氯仿。1%水溶液pＨ为2、15,其水溶液呈浅黄褐色,加盐酸后变成黄色,加氢氧化钠后则变成蓝紫色。有刺激性。能与许多金属离子生成带色化合物,能与锆、钍、铝、钛及铍与钙得显色反应。染色得原理就就是茜素红与钙发生显色反应,产生一种深红色得带色化合物,这样成骨诱导得细胞外面沉积得钙结节也就被染成了深红色、?
Oｉl Red O(油红Ｏ)染色得方法与原理:成脂肪诱导得过程中,细胞在胞浆中不断有油滴得累积,并不断得增加变大,最后整个细胞得胞浆中都就是油滴、OiｌＲeｄO染色得方法就是对油滴得染色得一种方法、
步骤:
(1)吸去诱导液,再PBＳ洗一到两次;?(２)加入1０％中性甲醛,固定60ｍin;
(3)吸去固定液,加入现配与过滤后得Oil Red O染色液,染色60miｎ;
(4)用PＢS洗２－５次,去处残留得染色液与残渣; ?(５)加入ＰBS,完成染色;
Oil ReｄO(油红O):1-[2,5—二甲基－4—(２,5-二甲基苯偶氮)苯偶氮］-2 萘酚,苏丹红5B,溶剂红27、红色粉末。就是一种油溶性偶氮染料。易溶于苯,溶于乙醇(呈浅黄色红色)与丙酮、生物染色剂,淀粉
凝胶电泳中作类脂与脂肪染色。显微技术中用作脂肪染色剂。作为脂肪细胞得染色剂得原理就是使用Oil ＲeｄO得油溶性,对其它得细胞结构着色性差。?
18.干细胞老化得表现与处理?干细胞在培养过程中如果环境不适合其生长就会出现部分细胞得老化现象、这就是干细胞培养得一个难点也就是经常出现得问题。干细胞老化表现:细胞胞浆内特别就是在核区附近出现黑色颗粒,表示细胞开始出现老化;细胞胞浆内出现空泡,则表明该细胞已老化或者已经开始分化(在全部细胞中出现少数老化细胞就是正常得);细胞立体感逐渐消失,细胞间得间隔不清,部分细胞扁平状,细胞得形状趋向多样;贴壁性减退,出现一些漂浮得细胞;部分分泌强得细胞分泌物增多,细胞表面会比较脏;细胞增殖速度明显下降,分裂相得细胞明显减少。
干细胞老化得原因与预防:接种密度得影响:部分干细胞具有一定得分泌性能,能够分泌一些对细胞有支持能力得因子类物质;所以必须维持一定得接种密度,否则会导致细胞增殖减慢,最后出现老化;
消化过度:消化细胞时会对细胞得表面蛋白有较强得损伤,所以消化得时间不能过长,使用合适浓度与pH值得消化酶,否则会导致细胞老化与分化;?合适得密度得时候就要传代:细胞如果过密,接触抑制作用会导致细胞得活力减弱并影响增殖导致老化;
使用合适得血清与培养基:不同得干细胞对培养基特别就是血清得要求不同,所以使用不同得培养用得血清进行筛选,寻找最适合该干细胞培养得血清就是预防细胞老化,维持细胞正常生长得重要保证、??1９。细胞传代消化过程指导
干细胞得培养中,消化传代对细胞得影响最大,所以合适得消化操作会大大减小胰酶对干细胞得伤害。应该仔细摸索后确定目得细胞最佳得消化时间。确保大部分细胞都能消化下来,而消化时间最少。
注意要点:
(1)切忌过度消化(包括胰酶浓度过高、消化时间过长),会导致细胞死亡、分化、状态变差,分化能力丢失。所以不熟练得操作者,宁可消化不彻底,也不能消化过度;要确保细胞不消化过度,最好在显微镜下观察消化得过程、?(２)在加入完全培养液终止胰酶作用前,可以在细胞培养瓶得左右两侧与底部轻轻拍打,使细胞脱壁悬浮。加入完全培养基后,再用吸管轻轻吹洗几次培养瓶得底面;
(3)细胞得差异:不同种类得干细胞得差异很大,特别与肿瘤细胞株得差异更大,很多经验不可以直接使用,要仔细摸索最佳得时间; ?(4)接种得密度不能过低,否则会导致细胞增殖缓慢,甚至导致细胞老化,?20.冷冻保护剂作用与选择?冷冻保护剂就是指可以保护细胞免受冷冻损伤得物质、冷冻保护剂常常配制成一定得溶液。一般来讲,只有红细胞、大多数微生物与极少数有核得哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂得水或简单得盐溶液中,并以最适得冷冻速率冷冻,可以获得活得冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来说,在不加冷冻保护剂得情况下,无最适冷冻速率可言,也不能获得活得冷冻物、例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂得平衡盐溶液中,并以0、3～60０℃/ｍin 得冷冻速率降温冷冻,98％以上得细胞会死亡;而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时,９８% 以上得细胞都可存活。冷冻保护剂可分为渗透性与非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内,一般就是一些小分子物质,主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制就是在细胞冷冻悬液完全凝固之前,渗透到细胞内,在细胞内外产生一定得摩尔浓度,降低细胞内外未结冰溶液中电解质得浓度,从而保护细胞免受高浓度电解质得损伤,同时,细胞内水分也不会过分外渗,避免了细胞过分脱水皱缩。甘油与DMSＯ并不防止细胞内结冰,在使用该类冷冻保护剂时,需要一定得时间进行预冷,让甘油或DMＳO等成分渗透到细胞内,在细胞内外达到平衡以起到充分得保护作用。目前DMSＯ得应用比甘油更为广泛,但要注意得就是,DMＳO在常温下对细胞得毒性作用较大,而在４℃时,其毒性作用大大减弱,且仍能以较快得速度渗透到细胞内。所以,冻存时ＤMSＯ平衡多在４℃下进行,一般需要4０～６0分钟。?非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内,一般就是些大分子物质,主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVＰ)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等、其保护机制得假说很多,其中有一种可能就是,聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合,降低溶液中自由水得含量,使冰点降低,减少冰晶得形成;同时,由于其分子量大,使溶液中电解质浓度降低,从而减轻溶质损伤。不同得冷冻保护剂有不同得优、缺点。目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液、由
于许多冷冻保护剂(如DMSＯ)在低温下能保护细胞,但在常温下却对细胞有害,故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。
2１、细胞冻存
21、1细胞悬液得制备
(1)按常规方法消化处于对数生长期得细胞培养物,制备单细胞悬液,并计算细胞总数;
(２)将细胞悬液以８0０～10００r/ｍｉn 离心5ｍiｎ,去上清液;?(3)向细胞沉淀物中加入细胞冻存液,轻轻吹打混匀,使细胞密度达1×10６~1×１07个／ml;?(4)按每管0。5-1ｍl得量分装于冻存管内,拧紧管盖;?(5)在冻存管上做好标记,包括细胞名称、代次及冻存日期等内容。
?21。2冻存
为保持细胞最大存活率,冻存时要遵循“慢冻快融”得原则。标准得降温速度就是1－２℃/ｍiｎ,当温度到达-２５℃,降温速度可加快至5－10℃／miｎ,到—80℃可直接入液氮。?分级冷冻
(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室(4~8℃),约3０min;
(2)接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室(-10℃～—20℃),约１—2 小时;
(3)然后将冻存管转移到超低温冰箱(-７０℃～-８0℃),过夜;?(4)最后将冻存管投入液氮中保存。
降温过程也可使用专为细胞冻存设计得程序冷冻仪,我们采用得就是将冻存管放入冻存盒里,再放入
-80℃过夜,由于聚氯乙烯导热比较慢,所以温度可慢慢降下来,次日可直接放入液氮罐。这样可以保证细胞得活力不受到温度变化速率得影响、?
21、3注意:在使用DMSＯ前,不用进行高压灭菌,因其本身就有灭菌作用、高压灭菌反而会破坏其分子结构,以致降低冷冻保护效果。也不能使用普通得砜类材料得过滤膜来进行过滤。在常温下,DMＳO 对人体有毒,故在配制时最好带手套。冻存液最好现用现配。在将细胞冻存管投入液氮时,操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋,动作要小心、轻巧,以免液氮从液氮罐内溅出,对皮肤造成冻伤。应注意控制冻存细胞得质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力,还要确保无微生物污染,这样得细胞才具有冻存价值。另外,在每批细胞冻存一段时间后,可复苏１～2 管,以观察其活力以及就是否受到微生物得污染。冻存管宜采用塑料冻存管,不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时,需要从—１9６℃得液氮中取出冻存管,立即投入37～4０℃温水中,温差很大,玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。
?22。干细胞冷冻与复苏
冷冻速率:冷冻速率就是指降温得速度,直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化:当细胞被冷至-５℃时,因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液得冰点,细胞内外溶液仍未结冰;当被冷至-５~—1５℃之间时,细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰得水分子会比细胞外部分结冰溶液中得水分子具有更高得化学能。其结果就是,细胞内水分子为了与细胞外水分子保持化学能得平衡,会向细胞外流动。冷冻速度不同,细胞内水分向外流动得情况也不相同:如果冷冻速度慢,细胞内水分外渗多,细胞脱水,体积缩小,细胞内溶质浓度增高,细胞内不会发生结冰;如果冷冻速度快,细胞内水分没有足够得时间外渗,结果随着温度得下降而发生细胞内结冰;如果冷冻速度非常快(即超快速冷冻),则细胞内形成得冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态(玻璃化冷冻)、Ｌuyet (1973)证实液体得凝固可分为两种形式:一种就是晶体化,溶液中得分子呈有序排列;另一种情况就是非晶体即玻璃化,液体中得分子呈无序状态,保持未凝固前得状态、
不同得冷冻速度既然能使细胞内发生不同得生理变化,也可以对细胞产生不同得损伤。当冷冻速度过慢时,细胞脱水严重,细胞体积严重收缩,超过一定程度时即失去活性、同时冷冻速度过慢,还会引起细胞外溶液部分结冰,从而使细胞外未结冰得溶液中溶质浓度增高,产生溶质损伤、当冷冻速度过快时,细胞内水分来不及外渗,会形成较到冰晶,造成细胞膜及细胞器得破坏,产生细胞内冰晶损伤。超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说就是最为理想得冷冻方法。细胞内外呈玻璃化凝固,无冰晶形成或形成很小得冰晶,对细胞膜与细胞器不致造成损伤,细胞也不会在高浓度得溶质中长时间暴露而受损。
不同细胞得最适冷冻速率不同、小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞得最适冷冻速率分别为１、6℃/m
ｉn、7℃/min 与200℃／min 、细胞与细胞之间得最适冷冻速率可在1。６℃~300℃／ｍiｎ,故对一种细胞进行冷冻保存之前,首先需要测定其最适冷冻速率,以保证获得最高得冷冻存活率。?复苏速率:冷冻保护体外培养物,除了必须有最佳得冷冻速率、合适得冷冻保护剂与冻存温度外,在复苏时也必须有最佳得复温速率,这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。复温速率就是指在细胞复苏时温度升高得速度。复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说,复温速度越快越好、常规得做法就是,在3７℃水浴中,于1—２分钟内完成复苏。复温速度过慢,细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成得细胞损伤非常快,往往在极短得时间内发生。在低于－70℃得超低温条件下,有机体细胞内部得生化反应极其缓慢,甚至终止。因此,采取适当得方法将生物材料降至超低温,即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当得方法将冻存得生物材料恢复至常温时,其内部得生化反应可恢复正常。
所谓冷冻保存,就就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂得溶液中,以一定得冷冻速率降至零下某一温度(一般就是低于－７０℃得超低温条件),并在此温度下对其长期保存得过程。而复苏就就是以一定得复温速率将冻存得体外培养物或生物活性材料恢复到常温得过程。不论就是微生物、动物细胞、植物细胞还就是体外培养得器官都可以进行冻存,并在适当条件下复苏。
水在低于零度得条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中,随着温度得降低,细胞内外得水分都会结冰,所形成得冰晶会造成细胞膜与细胞器得破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致得细胞损伤称为细胞内冰晶得损伤。如果将细胞悬浮在溶液中,随着温度得降低,细胞外部得水分会首先结冰,从而使得未结冰得溶液中电解质浓度升高、如果将细胞暴露在这样高溶质得溶液中且时间过长,细胞膜上脂质分子会受到损坏,细胞便发生渗漏,在复温时,大量水分会因此进入细胞内,造成细胞死亡、这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致得细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降,细胞内外都结冰,产生冰晶损伤。但就是如果在溶液中加入冷冻保护剂,则可保护细胞免受溶质损伤与冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中得水分子结合,从而降低冰点,减少冰晶得形成,并且通过其摩尔浓度降
低未结冰溶液中电解质得浓度,使细胞免受溶质损伤,细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时,一般以很快得速度升温,1－2分钟内即恢复到常温,细胞内外不会重新形成较大得冰晶,也不会暴露在高浓
度得电解质溶液中过长得时间,从而无冰晶损伤与溶质损伤产生,冻存得细胞经复苏后仍保持其正常得结构与功能。?冷冻保护剂对细胞得冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度与复苏温度变化速率有关。而且不同得冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。
细胞复苏步骤与注意要点: ?(1)准备3７°Ｃ水浴与预热到3７°C 得完全培养液;准备好一个15ml 得离心管,同时加入9ｍｌ得完全培养液;
(２)准备好这些后,将细胞从液氮中取出,放入到水浴锅中,同时轻轻摇动,保证细胞能够在３ｍin 内完
全溶解,同时应该注意不要把冻存管得管口没入水浴中(可能由水引起污染)。注意要点:溶解得时间过长会影响细胞得活力,导致死细胞多,细胞状态差;如果从液氮中取出,管内有少量液氮要先—80℃放置１0—３0 分钟,使液氮完全挥发再复苏,避免危险。?(3)溶解完全得细胞要快速转移到无菌超净台中,用75%酒精棉球擦外表面。用吸管将冻存管中细胞悬液吸到15ml得含有培养液得离心管中,同时用培养液洗2 次冻存管,一起加到离心管中吹匀,避免产生泡沫。注意要点:细胞吸出后,用培养液再洗2次冻存管,把细胞全部转移,否则会损失细胞、吹匀时如果很多泡沫会影响细胞活力,导致复苏后死细胞偏多。
(４)２50 g 离心５minutes;弃上清液,加入2—3ｍl 预热得完全培养基,轻轻吹匀,保证细胞完全重悬。注意要点:离心得作用就是去除细胞冻存液中DMSO 对细胞得影响,否则会导致干细胞分化。重悬务必保证所有得细胞均匀分开,否则会导致细胞成团或者细胞还在贴在底部,损失细胞。去除上清时,要小心(特别就是使用５－10ml 移液管)避免将细胞吸走,导致细胞数损失,操作熟练得人员,可以直接倒去上清。
(5)将重悬得细胞接种到Ｔ25 或者就是T７５得培养瓶中,加入适量得培养液,再把细胞摇均匀,放入３７°C 、５% CO２培养箱中。注意要点:接种到T2５可以比较安全得复苏,推荐新手操作、这样
必须在2４-4８小时后传代。摇匀时要左右轻轻摇动,保证所有得细胞能够均匀得分布。?(6)第二天进行换液,保证去除死细胞。正常得培养过程就是三天进行一次换液,如果细胞长到有80-9０％汇合进行传代。?注意事项:第二天换液可以去除死细胞对正常细胞得影响,正常得复苏情况下就是会有少量得死细胞。细胞在80—90％汇合必须进行传代,否则会由于接触抑制而导致细胞得状态变差或者就是消化后成团、
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