腹水抗体制备一般流程-20120827
腹水抗体制备(实验室级别)
2012-8-27
一、实验原理：
将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。
二、实验材料：
药品：血清培养基、液体石蜡、生理盐水
仪器：电热恒温水浴箱、CO2培养厢、超净工作台、低速自动平衡离心机
三、制备步骤：
1.打石蜡
在细胞培养前两周，取8周-10周的Balb/C小鼠，按每个细胞株注射3只，1ml/只，以促进小鼠肠道蠕动，进行分笼，写好标记，十天后准备注射细胞；
2.杂交瘤细胞复苏与扩大培养
(1)12孔细胞培养板，每孔中加入的细胞培养液约2ml。
(2)按冻存细胞的液氮罐位置，取出冻存的细胞管，在37℃水浴箱中搅动1min左右，快速
融化冷冻的杂交瘤细胞。
(3)将融化的细胞吸入5mL的细胞培养液中，尽量收集细胞，装入EP管，然后平衡EP管，
800rpm，8min，进行离心。
(4)将离心好的细胞上清液吸除，吸取3mL细胞培养液混匀沉淀细胞，将该细胞液吸出，按
1ml/孔混匀到相应培养板孔中，显微镜下观察复苏后的细胞数量，生长形态和背景是否有污染及杂质，然后放入细胞培养厢中进行孵育。
3.杂交瘤细胞收集与注射
(1)待细胞处于对数生长期，即可收集。吸取上清1ml后，吹打细胞，使贴壁细胞脱落，
然后收集到15ml离心管中，800rpm，8min离心，
(2)吸取离心上清液(冻存备用)，然后每管加入4ml生理盐水，混匀后，同样条件再次离心，
弃去上清液，每管再加人2-3ml生理盐水，混匀后吸入5ml注射器，按约1ml-0.5ml/只，注射小鼠腹腔。从注射后起一周后，每天注意观察小鼠腹腔隆起程度和小鼠生命状态，防止小鼠死亡。
4.腹水收集
(1)取经过免疫的腹部隆起的小鼠，颈部处死，用消毒酒精浸泡，用剪刀剪开腹部上皮，撕
开腹部皮肤，挑起腹腔膜，剪开，注意不要全部剪开，将吸管插进去，挤压腹水后，再吸取腹水到15ml离心管中，800rpm，30min离心，收集油脂层一下淡黄液体，即为腹水抗体。
(2)正常情况下，每只小鼠可收集2-3ml腹水。抗体浓度0.5-5mg/ml。按1ml/管，用1.5mlEP
管分装后放-80℃冻存。
5.抗体纯化
(1)Protein G亲和层析柱准备:填料（1ml）装柱后，超纯水流洗3-5个柱床体积以洗掉乙
醇，用平衡缓冲液洗5-10个柱床体积平衡柱子。
(2)上样：将样品上柱，上柱前需将样品超滤浓缩至1ml上柱。
(3)洗涤：平衡缓冲液洗5-10个柱床体积，直至洗涤液用检测液检测无明显显色反应为止。
(4)洗脱：洗脱缓冲液洗脱吸附在填料上的目标抗体，收集洗脱峰(1-6管)，洗脱液立即用
中和缓冲液中和到中性。
(5)平衡层析柱：立即用5-10个柱床体积平衡缓冲液平衡柱子到中性。
(6)再生：再生缓冲液流洗2-3个柱床体积。
(7)保存：先后用平衡缓冲液、20%乙醇分别流洗3-5个柱床体积。层析柱内保留适当体积
的20%乙醇，置于4~8℃保存。
腹水浓缩回输腹腔治疗肝硬化顽固性腹水的效果评价
腹水浓缩回输腹腔治疗肝硬化顽固性腹水的 效果评价 【关键词】肝硬化顽固性腹水 【摘要】目的探讨腹水超滤回输腹腔在肝硬化顽固性腹水治疗中的应用效果。方法对32例肝硬化顽固性腹水患者在左下腹、右中腹进行腹腔穿刺，连接导管，通过滤过器，在负压泵作用下形成超滤，浓缩后的腹水经静脉导管自右中腹回输入腹腔。结果超滤后患者体重下降，腹围缩小，尿量增加，血肌酐下降，总蛋白、白蛋白上升（P＜0.05）。补体C3浓度上升（P＜0.05）。结论腹水超滤回输治疗肝硬化顽固性腹水有效、安全、简便、副作用少。 【关键词】肝硬化顽固性腹水；超滤浓缩；回输腹腔 肝硬化顽固性腹水在临床上比较常见，但有效的治疗方法并不多。我院自2004年开始应用腹水超滤浓缩回输腹腔治疗该病32例，取得了比较满意的疗效，现总结如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料所有病例均为我院明确诊断为肝硬化顽固性腹水的住院患者，男23例，女9例，年龄31～65岁，平均46岁。本
组病例经过限水、限钠、利尿、补充白蛋白和放腹水等常规治疗效果欠佳，腹水持续时间3个月以上，其中乙肝肝硬化腹水22例，酒精性肝硬化腹水7例，不明原因的肝硬化腹水3例。25例表现为少尿，2例无尿，10例有明显呼吸困难、腹胀难忍等压迫症状，2例并发脐疝。27例腹水为渗出液，5例为漏出液。
1.2 治疗方法采用WLFHY-520型电脑腹水超滤浓缩回输系统（北京伟力公司）。患者取平卧位，左下腹、右中腹常规消毒，将穿刺针与导管连接固定，腹水自左下腹导管引入动脉导管内，设置正压泵流速为150～250ml/min，腹水经滤过器时在负压泵的作用下形成超滤，将水及中、小分子物质滤出，浓缩后的腹水经静脉导管自患者右中腹回输入腹腔。全过程为密闭无菌操作，每次滤出液体4000～8000ml，每次治疗时间为1.5～3h，每1～2周超滤1次。 1.3 治疗效果的监测观察体重、腹围、24h尿量，血肌酐、尿素氮、总蛋白、白蛋白以及腹水中钾、钠、氯、总蛋白、补体C3的水平。 2 结果 2.1 治疗前后一般情况及腹水补体C3的水平变化见表1。
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
腹水超滤·浓缩回输装置产品技术要求weilixinshiji
腹水超滤·浓缩回输装置 适用范围：该产品适用于医疗单位，对各种顽固性腹水进行腹水超滤浓缩腹腔内回输治疗。 1.1 产品型号：WLFHY-500 1.2 型号划分说明： 1.3 产品构成 系统主机由电源部件、控制部件、驱动部件、蠕动泵和台车组成。 2.1 工作条件 2.1.1 环境条件 a)环境温度：5℃～40℃； b)相对湿度：≤80%。 2.1.2 电源条件 a)电源电压：交流220V； b)电源频率：50Hz。 2.2 蠕动泵流速（使用Ф8内径管路时） a)蠕动泵抽取及回输流速调节范围：50ml/min ～400ml/min，步长： 1ml/min； b)流速误差：±10%。 2.3 时间设定 a)时间设定范围：1min ～ 180min，步长1min； b)误差范围：±5%。 2.4 环境试验的要求 仪器的环境试验要求，应按GB/T 14710-2009《医用电器环境要求及试验方 法》中气候环境试验II组、机械环境试验II组，详见附录B表1规定。
2.5 安全要求 2.5.1 电气安全： 应符合GB9706.1-2007《医用电器设备第1部分：安全通用要求》的规定，基 本安全特征见附录A。 2.5.2 电磁兼容性要求： 应符合YY 0505-2012《医用电气设备第1-2部分：安全通用要求并列标准： 电磁兼容要求和试验》的要求。 2.6 外观 2.6.1 系统外表应整洁。文字、符号及标志清晰无明显划痕、剥落、腐蚀、破损及变形等缺陷。表面油漆不得有超过3处划伤，每处划伤的长度不大于10mm，或面 积不大于4平方毫米。 2.6.2 紧固件应连接牢固，功能开关等均应安排准确，调整可靠。
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
单克隆抗体制备流程
单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。 一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) ↓2～3周后 第二次免疫1×10７／0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射
│(一般0.8～1ml 0.2ml／点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二) 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 ↓
腹水回输综述
腹水浓缩回输综述 一定义： 腹水浓缩是利用超滤、透析和吸附的原理清除腹水中的水分、肌酐、尿素氮、胆红素等物质而达到浓缩的目的。超滤是利用半透膜两侧存在压力差的原理，借助负压将小于半透膜孔径的小分子电解质、肌酐、尿素氮以及水分子与大于半透膜孔径的大分子蛋白质等物质分离开；透析则是利用半透膜两侧分子浓度的不同，渗透压低的一侧液体中小于半透膜孔径的分子向高渗透压一侧扩散，从而达到保留蛋白质、清除水分、电解质、肌酐、尿素氮的目的；吸附则是利用透析液或透析膜中含有吸附力的物质，如活性炭、树脂等，直接对半透膜另一侧的小分子物质、毒素进行吸附。根据上述作用可制成腹水浓缩回输装置，浓缩后的腹水经静脉再回输给患者自身，从而达到清除腹水、缓解症状、补充蛋白等作用。 腹水浓缩回输是1961年首先由Britton等人用于腹水病人的治疗。自该疗法在国内开展以来，国内腹水浓缩回输术有很多方法。1975年上海中山医院首先报道用单纯腹水超滤装置进行回输术，可浓缩腹水1.08-4．9倍；1980年上海仁济医院用聚乙二醇作为透析刑，制成腹水透析超滤装置，浓缩腹水可达近10倍；1981年上海中山医院对于板型超滤器进行改良，加用羟烷基淀粉作为吸附透析剂，使其同时具有超滤、透析和吸附的作用，腹水浓缩倍数高达17倍。1998年，北京伟力公司研制出电脑腹水超滤回输机，其腹水浓缩器采用双泵设计，可准确控制腹水浓缩率，仪器体积小，操作简便安全，并减少了手术中的感染机会。 目前，国外腹水浓缩回输装置正向小型化发展，美国已有便携式回输装置放使用。腹水浓缩回输装置，基本结构均由动力系统，包括动力泵和调压器、超滤器、管路和其他辅助装置，如血压心率监测仪器等组成。 二、适应证和禁忌证 1．适应证肝炎肝硬化，包括病毒性肝炎肝硬化、酒精性肝炎肝硬化、血吸虫性肝炎肝硬化等，以及其他各种原因如心源性、肾性、Budd—Chiari综合征等所致的顽固性腹水均为腹水浓缩回输的适应证。腹水浓缩回输还可为外科手术和腹部其他检查创造条件。如上述患者有大量腹水，24h尿钠与尿钾比例 腹水超滤浓缩回输操作 流程 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT 腹水超滤浓缩回输操作流程及注意事项 1、连接管路：抽出腹水管路（红色带泵管）与透析器上端相连，回输管路（兰）与透析器下端相连，透明的废液管（带泵管）与透析器侧孔连接。 2、安装泵管：将抽出腹水管路（红）泵管安装到泵1上，将废液管泵管安装到 泵2上，注意泵管方向不要接反。 3、管路预冲：将透析器固定在机器上，用肝素盐水（20mg/1000ml盐水）预冲，充分将气体排净，具体操作如下： （1）抽出腹水管通过针头连接500ml盐水瓶，设置泵1流量120ml/min，泵2不转（泵盖打开）。 （2）启动泵1将盐水引入抽出腹水管内，当盐水流至透析器上端时，将透析器倒置以排空中空纤维内腔气体，当盐水从透析器兰端流出时适当 进行震荡以尽量排净气体。 （3）将透析器上端（红端）向上固定在夹子上使侧孔保持最高点，设置泵2流量为80ml/mim，启动泵2，夹住回输管（兰管），使盐水充满透 析器外腔及废液管。 4、腹腔穿刺：协助患者取舒适半坐卧位或平卧位，用静脉留置针进行双侧腹腔穿刺（带侧孔针穿左下腹与红管连接），固定好穿刺针后分别与回输管路的动、静脉端连接，开启泵Ⅰ及泵Ⅱ进行腹水滤过浓缩回输腹腔治疗。泵Ⅰ与泵Ⅱ的 流速比通常为1∶，例如：泵1流量为150ml/min，泵2为100ml/min。 5、术中观察： （1）水滤过浓缩回输过程中注意监测患者的血压、心率及管路是否通畅，注意为患者保暖 （2）在治疗过程中严密观察患者的生命体征变化，穿刺部位有无渗血、渗液及皮下漏液现象，要保证管路的通畅。 6、结束治疗：出量达到预定目标时，关闭泵Ⅰ及泵Ⅱ，拔除静脉留置针。穿刺部位覆盖消毒纱布并给予腹带包裹。 7、腹水超滤浓缩回输并发症处理 （1）水电解质紊乱 腹水浓缩回输治疗肝硬化顽固性腹水200例 摘要】目的：总结腹水浓缩回输治疗肝硬化顽固性腹水的临床效果。方法：回 顾性分析2014年5月—2017年5月我院消化内科收治的200例肝硬化顽固性腹 水患者临床资料，均于无菌条件下给予腹水浓缩回输方案治疗，评价此其临床疗效。结果：本组病例治疗时间为1～6周，平均时间（3.23±0.58）周，接受1～4 次浓缩回输，平均（2.36±0.37）次，所有病例腹水、浮肿均消除；治疗前后患者 呼吸、血压、脉搏水平差异无统计学意义（P＜0.04）；治疗前平均蛋白浓度水平 为（2.25±0.40）g/dI，经治疗后为（22.56±4.15）g/dI；尿量增加1000～1600ml/d。结论：对肝硬化顽固性腹水者采用腹水浓缩回输治疗具有可观疗效收益，有助于 纠正患者症状与体征，值得推广应用。 【关键词】腹水浓缩回输；肝硬化；顽固性腹水；疗效 【中图分类号】R575.2 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）22-0079-02 肝硬化顽固性腹水（KA）指的是一组腹水量较大，且持续≥3个月存在常规 利尿方法过失反应，对水钠无法耐受的临床疾患，具有典型的循环功能降低表现，尽管内脏血管床存在淤血，但心排血量、肾血流量、有效血容量明显减少。对此，若持续给予速尿等强利尿剂治疗，非但无法获得理想的利尿效果，同时可能加重 肾血浆血流量与肾小球滤过率的减少，引起肝肾综合征，危及患者生命[1]。腹水 浓缩回输技术是治疗各因素导致的顽固性腹水，有助于迅速缓解患者临床症状与 体征，降低腹腔压力。现阶段关于腹水浓缩回输技术的报道相对较少，鉴于此， 本文回顾性分析2014年5月—2017年5月我院消化内科收治的200例肝硬化顽 固性腹水患者临床资料，为临床提供参考。 1.资料与方法 1.1 一般资料 回顾性分析2014年5月—2017年5月我院消化内科收治的200例肝硬化 顽固性腹水患者临床资料；本组患者均表现血钠＜1300mmol/L，尿钠<10mmol/L，尿钠/尿钾＜1，自由水清除率＜1，肾小球滤过率和肾血浆血流量均低于正常等典型症状；本组患者男性168例，女性32例，年龄53～70岁，平均年龄 （57.36±1.35）岁；肝炎后肝硬化病史1～5年，平均病史（2.31±0.65）年。 1.2 方法 本组病例均接受腹水浓缩回输治疗，患者取半卧位，于左髂前与脐部连线 处1/3作手术穿刺点，常规准备皮肤与麻醉，先行链接输血器硅胶管腹穿针做腹 腔穿刺，并于远端置放大容积无菌烧瓶，瓶口采用无菌纱布封盖。吸引流速调整 为40～60ml/min，待腹水完全放出；在腹水引流前后座呼吸、血压、脉搏等测量，在完成引流后指导患者取平卧位休息2h，待无不适感后方可下床活动。腹水 2.0mg百分比含量加入肝素，通过血液透析机浓缩处理后，由无菌吊瓶，结合地 塞米松、庆大霉素完成静滴，流速为20～40mg/d，对于1次回输效果不明显者 应于7～10d行再次回输。 1.3 统计学方法 对数据采用SPSS21.0统计学软件包处理,差异存在统计学意义采用P＜0.05 表示，计量资料“率”采用独立样本检验。 2.结果 本组病例治疗时间为1～6周，平均时间（3.23±0.58）周，接受1～4次浓 实验室实验： 1.蛋白表达纯化过程见具体protocol， 2.蛋白纯化好后，跑胶鉴定，估计大概迁移量 3.将纯化好的蛋白跑一到两块胶，（大概需要1-2g蛋白，需要估计蛋白量） 4.跑完胶后，用100mM KCl浸泡，几分钟后会出现发白条带， 5.把该条带割下来，（原则：割带尽量小，减少等量蛋白中对应的胶块的含量，胶块含量 过高会导致兔子死亡） 6.在-80度冷冻1h以上，然后到三楼冷冻干燥仪冻干， 7.将冻干的胶块捣碎（方便注射），可以在割胶时先切成碎小块，在楼上用玻璃棒之类的 东西捣碎 8.分成四份，107路或317路送去中医药大学动物实验中心进行注射 9.抗体样品取回后，用纯化过的蛋白进行效价测定，并记录 10.抗体溶液用硫酸铵沉淀， 11.溶解后加50%甘油混匀，分管保存 12.管子上标记蛋白号，记录上详细记录抗体效价，质量，杂信号状况 附抗体制备 实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平 制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图: 单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6 月） 准备抗原 动物免疫——选择免疫动物 Elisa测抗血清--------- ? ￥ 分离脾细胞骨髓瘤细胞 细胞融合（融合剂：PEJ HAT培养基筛选杂交瘤细胞 筛选阳性细胞------- * （三天内做完流式）“ 阳性克隆并扩大培养呻—细胞冻存 性！ 扩大培养收集上清动物接种收集腹水 单克隆抗体纯化保存 1、抗原提纯与动物免疫： 选择BALB/c健康小鼠。如为细胞抗原，可取 1 X 107个细胞作腹腔免疫；可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。免疫3?4只小鼠，间隔一般2?3周，末次免疫后3?4天，分离脾细胞。 2、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择Sp2/0细胞株，将昆明鼠的腹腔细胞作为饲养细胞 3、细胞融合 将两种细胞混合后加入PEG（融合剂）使细胞彼此融合。其后用培养液稀释PEG 消除PEG的作用。注意：细胞比例、培养液成分、反应时间 4、有限稀释法筛选阳性株 筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株（一般稀释至0.8个细胞/孔）细胞培养至覆盖0 %?20%孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA 测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 5、单克隆抗体的制备与保存 筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠，先用液体石蜡进行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5?10ml的腹水，冻存。6、单克隆抗体的纯化 硫酸铵沉淀法 自体腹水浓缩回输术治疗肝硬化腹水的护理 发表时间：2011-06-23T11:56:08.473Z 来源：《中国健康月刊（学术版）》2011年第3期供稿作者：陈玲饶岁新 [导读] 术后用无菌纱布包扎穿刺口并用腹带加压包扎，以防腹水迅速再生和腹水外渗。 陈玲饶岁新【摘要】目的：探讨肝硬化腹水行自体回输的护理要点及效果。方法：对76例肝硬化腹水患者行腹穿引出腹水经佛力腹水浓缩回输治疗仪进行单纯超滤，然后将浓缩腹水回输患者体内，整个过程注意做好患者的准备、严密观察生命体征变化、控制腹水的引流及超滤速度、注意不良反应。76例患者共行腹水回输134例次，均顺利完成，腹水压迫症明显改善。结论：自体腹水浓缩回输简单易行，安全有效，加强术前、术中、术后的护理可确保治疗顺利进行。 【关键词】腹水浓缩回输;肝硬化;腹水；护理 【中图分类号】R463【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)03-0046-01腹水为肝硬化失代偿期最常见的临床表现之一。大量的腹水不但影响心肺功能，且易导致自发性腹膜炎、肝肾综合征而危及生命[1]。自体腹水浓缩回输是一种对顽固性腹水进行超滤，将其中的水份滤出，把蛋白质及其它有用成份回输体内的方法[2]。我院自2005年7月~2009年10月采用自体腹水超滤浓缩回输术治疗肝硬化腹水76例134次，取得较好疗效，现报告如下。 1 资料与方法 1.1一般资料：76例肝硬化腹水患者，经3种以上利尿治疗2周以上，疗效极差，其中男61例，女15例，年龄32~69岁，其中乙型肝炎肝硬化58例，酒精型肝硬化18例。肝炎病程1~15年，腹水持续时间1月~8年。 1.2方法：使用WLFHY-500治疗仪，配套管路，空心纤维滤过器及16mm×150mm多孔、单孔套管针各1根。治疗前连接管路和滤过器，用生理盐水冲洗管道系统。取左下腹作穿刺点，无菌操作下，分别刺入多孔针与单孔针，连接管道系统，从多孔穿刺针处往外引流腹水，经超滤浓缩后从对侧单孔穿刺针回输腹腔。整个过程为密闭式无菌操作，每次超滤液体3000~8000ml ,治疗时间1~4h，治疗全过程进行生命体征监测。 2结果 76例患者应用自体腹水浓缩回输腹腔134次，每例最少1次，最多为6次。所有患者在行腹水超滤浓缩回输腹腔后，腹水均逐渐减少，尿量明显增加，肾功能改善，其主要理化检测指标的变化详见表1。少数患者有低热，经过对症处理恢复正常，未发现其他不良反应。 表176例肝硬化腹水患者腹水浓缩回输腹腔治疗前后主要检测指标的比较(x士s) 治疗前后比较采用配对t检验，若方差不齐，则采用t'检验（welch's）校正；TP：血浆总蛋白；ALB：血浆白蛋白。 3护理 3．1术前护理： 3.1.1患者准备：详细了解患者基本资料，如病情、诊断、药物过敏史、血型。加强基础护理，嘱患者卧床休息。有针对性地实施心理护理，治疗前应向患者及家属做好解释工作，讲解治疗目的及过程，消除患者的紧张恐惧心理，使患者做好心理准备。完善治疗前检查，如T、P、R、BP、体重、24 h尿量、腹围、BUN、Cr、Tp、ALB、部分电解质、血常规和腹水常规检查。特别不要遗漏血常规和腹水常规检查，以区别其他性质的腹水[3]。 3.1.2环境准备该治疗在人工肝治疗室进行。人工肝治疗室应单独设立，严格消毒，每次进行人工肝治疗前1d应使用三氧消毒机对人工肝治疗室进行空气消毒2h;对室内地面及物体表面用含有效氯1000mg/L的“84”消毒液擦拭。 3．2术中护理: 3.2.1严格无菌操作，遵守操作规程。在进行腹水引流、超滤和回输的各个环节，必须严格遵守操作规程，连接透析管路时应避免污染，以免造成腹腔感染。 3.2.2在进行腹水回输时，首先调节好回输的速度。先低速回输观察10~20min，若患者无不适可适当提高回输速度，对老年患者，应注意其适应能力．避免产生不良反应。但回输不可过快，过快可导致门脉压力增高，CVP上升，致使心脏负荷加重而诱发胃底静脉曲张破裂出血、心力衰竭和腹痛不适等。超滤腹水后腹压下降，肠蠕动增加或同输液低温的刺激均可导致肠痉挛引起腹痛。一般降低泵速．使用解经药(如654~2 10 mg肌注)可缓解。超滤速度一般80~100 ml／min，防止腹水滤出过快使腹压突然下降出现低血压。若病人出现心慌不适，脉搏增快等症状时，应减慢滤出速度。 3.2.3密切观察患者的病情变化，每30 min观察T、P、R、BP各一次，同时观察面色、四肢温度、腹水量和色泽变化并作好记录，肝功能受损严重者易诱发肝性脑病及上消化道出血，若患者出现神志异常或有心慌、出汗、脉搏加快及血压下降等症状，应立即停止回输，配合医生做好相应的处理。 3.2.4保持管路通畅．如腹水引流不畅，考虑是穿刺针吸附大网膜发生包绕阻塞时．可关泵停止抽吸2 min，并适当调整穿刺针方向或病人体位[4]。若是超滤器被纤维蛋白等絮状物堵塞，可先用小剂量肝素(总量为625~1 250 U)从管路持续泵入。上述情况经处理无效，应立即停机，必要时可重做腹穿或更换超滤器．不可在机器运行时将穿刺针与管路接头分离，以免空气进入腹腔，造成气腹而继发感染。同时也要保持管路个连接处紧密，防止脱落。 3．3术后护理: 3.3.1术后用无菌纱布包扎穿刺口并用腹带加压包扎，以防腹水迅速再生和腹水外渗。嘱患者24小时绝对卧床休息，给予高热量、高维 腹水抗体制备(实验室级别) 2012-8-27 一、实验原理： 将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。 二、实验材料： 药品：血清培养基、液体石蜡、生理盐水 仪器：电热恒温水浴箱、CO2培养厢、超净工作台、低速自动平衡离心机 三、制备步骤： 1.打石蜡 在细胞培养前两周，取8周-10周的Balb/C小鼠，按每个细胞株注射3只，1ml/只，以促进小鼠肠道蠕动，进行分笼，写好标记，十天后准备注射细胞； 2.杂交瘤细胞复苏与扩大培养 (1)12孔细胞培养板，每孔中加入的细胞培养液约2ml。 (2)按冻存细胞的液氮罐位置，取出冻存的细胞管，在37℃水浴箱中搅动1min 左右，快速融化冷冻的杂交瘤细胞。 (3)将融化的细胞吸入5mL的细胞培养液中，尽量收集细胞，装入EP管，然后 平衡EP管，800rpm，8min，进行离心。 (4)将离心好的细胞上清液吸除，吸取3mL细胞培养液混匀沉淀细胞，将该细胞 液吸出，按1ml/孔混匀到相应培养板孔中，显微镜下观察复苏后的细胞数量，生长形态和背景是否有污染及杂质，然后放入细胞培养厢中进行孵育。 3.杂交瘤细胞收集与注射 (1)待细胞处于对数生长期，即可收集。吸取上清1ml后，吹打细胞，使贴壁细 胞脱落，然后收集到15ml离心管中，800rpm，8min离心， (2)吸取离心上清液(冻存备用)，然后每管加入4ml生理盐水，混匀后，同样条 件再次离心，弃去上清液，每管再加人2-3ml生理盐水，混匀后吸入5ml注射器，按约1ml-0.5ml/只，注射小鼠腹腔。从注射后起一周后，每天注意观察小鼠腹腔隆起程度和小鼠生命状态，防止小鼠死亡。 4.腹水收集 (1)取经过免疫的腹部隆起的小鼠，颈部处死，用消毒酒精浸泡，用剪刀剪开腹 部上皮，撕开腹部皮肤，挑起腹腔膜，剪开，注意不要全部剪开，将吸管插进去，挤压腹水后，再吸取腹水到15ml离心管中，800rpm，30min离心，收集油脂层一下淡黄液体，即为腹水抗体。 (2)正常情况下，每只小鼠可收集2-3ml腹水。抗体浓度0.5-5mg/ml。按1ml/ 管，用1.5mlEP管分装后放-80℃冻存。 5.抗体纯化 (1)ProteinG亲和层析柱准备:填料（1ml）装柱后，超纯水流洗3-5个柱床体积 以洗掉乙醇，用平衡缓冲液洗5-10个柱床体积平衡柱子。 (2)上样：将样品上柱，上柱前需将样品超滤浓缩至1ml上柱。 (3)洗涤：平衡缓冲液洗5-10个柱床体积，直至洗涤液用检测液检测无明显显 色反应为止。 腹水超滤浓缩回输术护理常规 【概述】 腹水超滤浓缩回输术是借助体外机械、化学或生物性装置将自体腹水超滤浓缩的方法，对肝硬化腹水进行超滤，同步将腹水中的水分滤出，并将腹水中的蛋白质及大分子物质回输入腹腔的操作技术。【术前护理】 1.患者准备： （1）详细了解患者的基本资料。 （2）有针对性地实施心理护理，治疗前应向患者及家属讲解腹水超滤浓缩回输术的优越性、治疗原理、治疗的目的及过程，消除患者恐惧、紧张心理，以更好地配合治疗。 （3）完善治疗前检查，如生命体征、体重、腹围、24小时尿量、电解质、血常规、凝血时间和腹水常规检查并作好记录。 （4）注意观察有无合并消化道出血、严重心功能不全、电解质紊乱、腹腔感染和肿瘤、肝性脑病等并发症的前驱表现。如有，暂停该治疗。 2.环境准备：病室或治疗间单独设立，治疗前用空气消毒机消毒两小时，对室内地面及物体表面用含氯消毒液2000mg/L 擦试，谢绝人员探视以防感染。 3.其它准备：检查机器的性能与运行情况，真空泵的压力是否合适。 【术中护理】 1.置患者平卧位，常规建立静脉通道，以利于病情变化及术后给药。 2.严格无菌操作，遵守操作规程。在腹腔穿刺过程中，配合医生在腹水流出通畅的内瘘针、留置针连接管路时，应避免污染，以免造成腹腔感染，并将针尖妥善固定后抬高床头30 o-40 o，以利腹水引出。 3.在进行腹水超滤浓缩回输时，应调节好泵的速度，先低速，观察10-20分钟，患者无不适时可提高泵的速度，但不应太快，尤其是老年人，超滤速度一般为80-100ml/min，输入的泵速为输出的1/3至2/3。 4.在治疗过程中嘱患者尽量减少翻身，手不能跨越无菌区域，一般嘱其放于身体两侧或交叉放于胸部为佳。 5.注意保暖，可通过提高室内温度或烤灯照射局部取暖。 6.保持管路通畅，防止扭曲、受压、脱落、折叠。如腹水引流不畅考虑是穿刺针包绕大网膜所致，可关泵暂停抽吸，并适当调整穿刺针的方向和更换病人体位，若是超滤器被纤维蛋白等絮状物阻塞，可用小剂量肝素（625-1250u）从管路持续泵入。如上述处理无效，应立即停机，必要时重新进行腹穿或更换超滤器，不可在机器运行时将管路和接头分离，以免空气进入腹腔造成气腹而引发感染，同时要保持管路连接处紧密，防止脱落。 7.密切观察病情变化：观察穿刺处有无渗血、渗液，加强患者意识、生命体征、四肢温度、腹水的量、性质及色泽变化的监测，并做好记录。防腹腔压力急剧降低导致有效循环血量相对不足引发休克；肝功能严重受损者易诱发肝性脑病及上消化道出血，若出现神志异常或有心慌、出汗、脉快、血压下降等应停止治疗，配合医生作相应处理；如发现腹水中有少量血性液，考虑针头损伤大网膜所致，可继续治疗，如有大量持续性血性液应立即停止治疗，及时报告医生并配合处理；及时倾倒滤出液，并做好记录。 【术后护理】 1.术后用无菌纱布包扎穿刺口并用腹带加压包扎，以防止腹水迅速再生和腹水外渗。嘱患者绝对卧床休息24小时，最好采取半卧位。 2.监测生命体征并观察有无休克症状和腹痛之主诉，以发现有无感染腹膜炎以及有无出血倾向；监测腹围、尿量、体重变化，以评价治疗效果。 【健康指导】 1.指导患者保持穿刺处皮肤清洁、干燥，避免潮湿和污染，避免剧烈运动。一旦发现穿刺部位潮湿或渗液、渗血、穿刺部位不适等及时报告医护人员，以便及时处理。 2.指导患者合理饮食，能量来源以碳水化合物为主，给予高热量、高蛋白、低脂、低盐或无盐饮食，适当控制水份摄入，保持体液平衡。 利用血透装置进行自体腹水浓缩回输治疗肝硬化顽固性腹 水 【中图分类号】r575【文献标识码】a【文章编号】1672－3783(2011)08－0014－02 【摘要】目的：探讨肝硬化顽固性腹水患者腹水浓缩自体回输治疗的疗效。方法：对48例顽固性腹水患者，进行142次自体腹水超滤浓缩回输腹腔治疗。结果：腹水超滤前后对腹水电解质无明显影响，治疗后对临床症状改善明显，患者血中白蛋白.总蛋白浓度较治疗前明显增高,差异具有非常显著性(p>0.01)，治疗后显效36（75%），有效10（20.8%）,无效2例（4.2%）总有效95.8%。结论：腹水浓缩自体回输术治疗肝硬化顽固性腹水有肯定的疗效，不良反应少,方法简单、易行，并能减轻患者的经济负担，可以在临床上广泛应用。 【关键词】肝硬化顽固性腹水腹水自体回输治疗血透装置how to treat the cirrhosis refractory ascites by the method of ascites concentration of autologous transfusion through hemodialyzer by yang yongzheng 【abstract】purpose: in this essay, the curative effect on how to treat the cirrhosis patients who suffer from refractory ascites by the method of ascites concentration of autologous transfusion is mainly discussed. method: 48 单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都腹水超滤浓缩回输操作流程
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