基于杂质谱的仿制药质量一致性评价流程研究_张明媛.

基于杂质谱的仿制药质量一致性评价流程研究

张明媛1，2， 张军东3，陆峰1*

1第二军医大学药学院药物分析学教研室，上海 200433；

2 福建医科大学附属南平第一医院药学部，福建 南平 353000；

3.上海信谊药厂有限公司药物研究所，上海201206

摘要

目的利用杂质谱理念，参考化学计量学中评价中药指纹图谱相似度的方法，研究一套用于仿制药质量一致性评价的流程与方法。方法采用相关系数法、夹角余弦法、主成分分析法（PCA）、系统聚类分层法（HCA）、加权相关系数法等化学计量学方法对7个厂家16个批次的硝苯地平缓释片样品中杂质谱信息进行计算分析。结果经过色谱方法的选择、样品检测与数据采集、批次内相似度评价、仿制药相似度评价、加权后仿制药评价等5个步骤，逐步筛选出了仿制水平较高的仿制厂家。结论拟定的评价流程与方法可逐步筛选出仿制相对最优的厂家。

关键词杂质谱，一致性评价，化学计量学，硝苯地平缓释片

Evaluation procedure for quality consistency of generic drugs based on the impurity profile

Zhang Mingyuan1，2， Zhang Jundong3，Lu Feng1*

1 School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433;

2

Department of Pharmacy, the First Hospital of Naping, Fujian Medical University, Nanping 353000;

3 Shanghai Sine Pharmaceutical Laboratories Co., Ltd, Shanghai 201206 Abstract

[第一作者] 张明媛，研究生，从事药物分析研究。

[通讯作者] * 陆峰，教授，E‐mail：fenglufeng@https://www.360docs.net/doc/cc8013653.html,，从事药物质量信息学研究。

[基金课题] 上海市科委产学研医合作项目（12DZ1930504）

OBJECTIVE To research a procedure to evaluate the quality consistency of generic drugs this based on the impurity profile and the similarity analysis methods. METHODS The data which purchased from 7 factories (16 batches) were calculated by correlation coefficient, cosine, principal component analysis (PCA), hierarchical clustering analysis (HCA) and weitht-correlation coefficient. RESULTS After screening by the procedure: choice of chromatographic methods, data collection and conformity test, evaluation of intra-batch similarity, evaluation of generic drugs with the original drug, and weighted similarity evaluation of generic drugs, the better generic factory was pick out. CONCLUSIONS This step-by-step is suitable for evaluating the consistency of generic drugs.

Key Words impurity profile, consistency evaluation, chemometrics, nifedipine extended-release tablets

仿制药是指与原研药在剂量、安全性和有效性、质量、作用以及适应症上相同的一种仿制品。然而，一些仿制药的质量却无法与原研药相匹配。常见的不同在于仿制药含有新的杂质或杂质的含量高于原研药品[1, 2]，造成这种差异的原因是传统评价仿制药质量，只要求仿制药符合相关的质量标准，使得仿制药未达到原研药质量也可生产上市。然而，这些杂质可能导致生物利用度的降低或改变，也有可能影响药品的安全性。

2002年，ICH将“杂质谱”这一概念引入药品研发过程[3]。药品中的诸杂质的种类与含量被总称为杂质谱。它不再仅仅关注某一或某些杂质是否超过限度，而是从杂质的整体出发，找出各杂质归属，在药物合成、纯化、工艺、储存、流通等各个环节全面控制药品质量。高质量的仿制药应做到“生物等同，临床等同，安全等同”。若能控制原料药或制剂中的杂质含量，做到仿制药中各组分与原研药相同，便能一定程度上保障仿制药与原研药在安全性上一致，也为生物等同，临床等同提供基础。目前，各个国家对于仿制药质量一致性评价多从释放度及临床疗效上加以评价，未有从杂质谱角度予以关注。

本文旨在利用杂质谱理念，以硝苯地平缓释片为例，参考化学计量学中评价中药指纹图谱相似度的方法[4]，拟定一套用于评价仿制药仿制水平的评价思路，对仿制药杂质谱相似度进行初步探究，期望能为仿制药质量一致性评价提供一种新的研究思路。

1.仪器与试药

对照品：硝苯地平对照品（批号100338-201103），硝苯地平杂质Ⅰ（批号100339-201103），硝苯地平杂质Ⅱ（批号100340-201103）均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈和氯仿均为Merck色谱纯，水为重蒸水，破坏试验所用辅料由第二军医大学药学院药剂教研室提供。

用于仿制药质量一致性的供试品（硝苯地平缓释片（Ⅱ）（20mg））及阴性对照样品（硫酸阿米卡星注射液（0.2g/2ml））的相关信息见表1。

表1 药品来源及编号

编号厂家批号生产日期有效日期

A1

Bayer HealthCare AG BXFZX21 - 201408

A2 BXFZX25

-

201501

B1

仿制药厂1 X 110505 20110512 20130511

B2 X

110705

20110717

20130716

B3 X

120202

20120210

20140209

C1 仿制药厂2 110504

20110521

201304

D1 仿制药厂3 1103122

20110310

201302

E1

仿制药厂4 96120801 - -

E2 96110902

20110830

201307 E3 96120701

20120625

201405

F1

仿制药厂5 120314 1 20120314 20140313

F2 120517

2

20120517

20140516

F3 120416

2

20120416

20140415

G1

仿制药厂6 120510 20120515 201404

G2 120403

20120409

201403 G3 120509

20120514

201404 N1 阴性对照样品 110524

20110524

201405

Agilent 1200高效液相色谱仪，可变波长检测器，Agilent Chemstation色谱工

作站。采用MATLAB R2008a、PASW 18.0、SIMCA 11.0完成相似度分析。

2.方法与结果

2.1.评价方法的选择

从杂质谱的角度评价仿制药的质量一致性，首先要从所选择的方法入手，根

据各国药典，新药标准等质量标准，选择一种相对能全面考察各厂家杂质水平的

方法。本文按照收集到的美国药典（USP-34）[5]及中国国家食品药品监督管理局

国家药品标准WS1-（X-058）-2004Z[6]进行实验，根据色谱图中可检测的杂质峰

个数，各峰的分离度，塔板数，前处理方法的简便程度、安全性，空白辅料及溶剂是否对峰检测有干扰等，最终选择USP-34中的检测方法对硝苯地平缓释片的杂质谱一致性进行考察。

2.2.样品检测与数据采集

按照所选方法对所有批次样品进行含量和杂质测定，若测定不合格，则认为该样品无需进行相似度评价。每批次样品平行操作3份用于仿制药相似度评价，其中A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1批次样品平行操作6份同时用于批次内相似度评价。所有样品均在高效液相色谱仪上一次连续完成，并记录自动积分的峰面积，典型图谱见图1。阴性对照样品采用BP2010[7]中记载方法采集数据。结果表明，各批次的硝苯地平缓释片在含量和杂质检测方面都能满足USP-34要求，并且某些厂家的杂质含量远低于限度。但综合评价各厂家的产品，杂质含量参差不齐，相较于原研产品A，出现一些未知杂质。

图1 各厂家的高效液相色谱图

2.3.批次内相似度评价

良好的产品质量应该有稳定的工艺水平，批次内的相似度可作为产品质量的首要考察指标。本文采用夹角余弦法、相关系数法计算批次内相似度，使结果将批内差异转化为相似系数大小的比较。一般认为，同一批次的样品在相同的分析条件下相似度是一致的，相似度越大则表示工艺越稳定，可进一步与原研药进行对比。本文比较了色谱指纹图谱数据点（点对点）与色谱峰面积（峰对峰）分别

作为计算矢量的结果差异。

2.3.1. 色谱数据点计算

与中药指纹图谱中不同的是，化学药品色谱图中主药峰常常是杂质峰的数千数万倍，需要去除主峰数据以排除计算时主峰对杂质峰信息的掩盖。

由于仪器状态的变化，如梯度洗脱，易导致基线波动，因此采用数据点计算时，相似度差异较大，必须经过必要的数据预处理。本文借鉴常用的基线校正，峰位校正方法：自适应迭代加权惩罚最小二乘（Adaptive Iteratively Reweighted Penalized Least, airPLS）[8,9]及相关性优化规整（Correlation Optimized Warp，COW）[10]对原始色谱数据进行预处理，以G1批次为例，校正前相关系数及夹角余弦系数范围依次为：0.1230-0.9578、0.0077-0.9212；校正后相应数据为：0.7954-0.9741、0.6966-0.9528。

2.3.2. 杂质峰面积计算

记录各样品中共有杂质峰面积，若某厂家或某批次存在特殊杂质峰，则其他样品在此保留时间上的峰面积记为0.00001，以便于满足计算要求。经计算相关系数法与夹角余弦法的结果是一致的，各厂家的批次内结果较为接近，G1批次相关系数与夹角余弦系数范围分别为：0.971-0.999、0.964-1，表明同批次样品质量是稳定的。

2.4.仿制药的相似度评价

2.4.1．PCA

对各样品中杂质峰面积做主成分分析，对前两个主成分作图，得到杂质谱相似度的PCA图（图2），越接近A1，A2批次，相似度越高。

图2 8个厂家各批次样品的PCA图

结果显示，阴性样品与供试品得到明显分离，同批次样品分布较接近。D，F及B2批次的样品远离原研样品。C、E、G与原研厂家样品距离较近。可认为C、

E、G的杂质情况与原研药更为接近。前五个主成分依次为：48.36%，22.13%，

12.60%，8.36%与5.94%。然而，此结果无法进一步区分C、E、G的质量优劣程度。

2.4.2．HCA

对各样品中杂质峰面积进行系统聚类分析，得到树状图（图3）。与A1,A2

批次归为同类的样品，可认为仿制质量较好。

图3 8个厂家各批次样品的HCA树状图

结果显示，阴性样品与供试品亦得到明显分离，每个厂家的同批次样品都被归为同类（除E3-3被错判），并且G厂家的3个批次样品都与原研样品归为同类。其他厂家所有样品都未完全归为同类，无法对其仿制质量优劣进行评价。

由于F厂家的3个批次与原研厂家相距较远，认为无需进行进行进一步评价，因此，本文对B，C，E，G作了进一步研究。

2.5.加权后的仿制药相似度评价

对于仿制药而言，某些杂质峰在谱图中含量较低，但它们常常是仿制药独有的杂质峰，药典中常以“总杂”控制，然而它们却是合成或工艺差异的“标志”。在相似度计算时，由于其量低，容易被其他峰的信息掩盖，因此，本文引入“权重”的概念，以显示这些工艺杂质峰的重要性。

以E2批次为例，对制剂、原料、辅料进行破坏，得到各杂质在高温（105℃，

4h）、光（4500lx，1h）、酸（1 mol L-1 HCl溶液，22h）、碱（1 mol L-1NaOH溶液，22h）、氧化（15% H2O2，22.5h）各种剧烈条件下的变化情况。

结果显示，空白辅料对杂质检测无干扰。样品经破坏后产生的降解产物与主峰分离良好，色谱条件能满足杂质的检测要求。样品中变化最大的是杂质Ⅰ、Ⅱ，说明杂质Ⅰ、Ⅱ对于外界较敏感，也是药典中重点质控的杂质，而后4个杂质峰在各破坏条件下均变化不大，为工艺杂质峰。从杂质谱的角度出发，本文以原研药的药典质控最小杂质平均峰面积与最大工艺杂质平均峰面积之比（本文为：2.8）为加权系数的上限（以避免过度加权）对工艺杂质峰面积进行加权（图4）。

图4 加权前后各厂家的相关系数变化图（权重值为2.8）

结果显示，各厂家的相似度在加权后均减小，但G厂家的降幅最小，平均相似系数从0.84降至0.83。而D的平均相似系数从0.85降至0.66，从而与G的质量得到区别。观察图1，B，C厂家都存在特殊的杂质峰，E厂家虽然很好的控制了杂质A、B，但其他单杂大于A厂家，三者经过加权计算后差异增大，因此，相似度明显下降。

根据以上实验与结果，仿制药相似度评价流程总结如图5：

图5 仿制药一致性评价流程图

3.讨论

实验前，仪器经过了2小时以上的平衡，然而在实验过程中仍出现基线波动，这可能与色谱柱、流动相有密切关系。因此点对点的相似度结果差异较大，经过数据预处理，可有效的消除基线、峰位漂移影响，但结果仍显示样品间存在较大差异。而采用峰对峰计算结果，各厂家同批次平均系数值均>0.9，表明各厂家的工艺稳定，这也与样品测试的杂质、含量结果一致。本文认为以色谱峰面积计算能排除环境或仪器状态微调时引起的基线改变且不需要导出数据，截取主峰等繁琐步骤，对于基线分离的色谱峰，分析软件自动积分，更为方便。

同时，本文计算了权重值为2~3的各样品的相关系数变化，结果显示变化趋

势并无显著性差异，加权评价更能反映仿制过程中杂质峰变化的差异。

4.结论

本文借鉴了中药指纹图谱中常用的计算相似度的评价方法，初步探究了一套基于药品杂质谱、用于评价仿制药质量一致性的流程。采用峰面积作为计算矢量能有效消除由于基线波动引起的色谱差异；夹角余弦法、相关系数法评价仿制厂家的批次内工艺稳定性，在批次内稳定的前提下进行仿制水平的评价；PCA、HCA法直观地显示各厂家与原研厂家的差异，同时也显示出厂家批次间的差异；对工艺杂质进行加权后计算相似度，进一步筛选出仿制水平更高的厂家。由此得到评价流程为：色谱方法的选择、样品检测与数据采集、批次内相似度评价、仿制药相似度评价、加权后仿制药评价。本文的研究成果能为仿制药质量一致性评价提供一种新的研究思路和方法。

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