自来水中细菌总数的测定 (2)
自来水中细菌总数的测定
摘要：本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以某种培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是近似值【1】。目前一般采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用培养基制作平板，按菌落计数方法进行计数，通过实验测得的菌落数对照国家饮用水标准来判断水质【2】。良好的饮用水细菌总数应<100CFU/mL，而>500CFU/mL则不适宜饮用，我国饮用水卫生标准（GB5749—85）规定每毫升水样细菌总数37℃培养24h不得大于100个。对自来水用平板菌落计数技术测定细菌总数，通过观测得到如下结果：菌落数为61个/mL。
关键词：自来水普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板菌落计数技术细菌总数
0 引言
各种天然水中常含一定数量的微生物，而水是微生物广泛分布的天然环境。水中微生物的主要来源是：水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等【3】。水是生命之源，人的生存离不开水环境，水质的好坏对人们生活起着至关重要的作用，而判断水质的标准，微生物在水中的数量、种类是必不可少的。自来水的微生物学检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。水中细菌总数可说明被有机物污染的程度，细菌数越多，有机物质含量越大。细菌总数是指1 mL水样在普通营养琼脂培养基中，37℃经24h培养后，所生长的菌落数。本实验只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧细菌菌落总数【4】。微生物学指标是评价水中生物性污染的重要指标，是水质在流行病学上安全的保证。近年来随着环境污染加重我国水质不断下降，给居民饮水安全带来隐患。因此，我们想通过测定自来水中的细菌总数，了解水质情况，呼吁人们保护水资源。
1 材料和方法
1.1 时间与地点
本实验于2010年10月26～27日在太原师范学院微生物实验室完成。
1.2材料
1.2.1 实验材料自来水
1.2.2 实验试剂牛肉膏蛋白胨培养基1mol/LNaOH 1mol/LHCl 蒸馏水
1.2.3 实验仪器高压蒸汽灭菌锅培养皿三角烧瓶天平牛角匙pH试纸（pH5.5-9.0）量筒
玻璃棒电热炉温度计
1.3 方法
1.3.1灭菌
1.3.1.1首先将高压蒸汽灭菌锅内锅层取出，再向外锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。
1.3.1.2放回内锅层,并放入培养皿、三角烧瓶、量筒、移液管。
1.3.1.3加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺旋，使螺旋松紧一致，防止漏气。
1.3.1.4用电炉加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷气。待冷气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力上升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1MPa，121℃，20min灭菌。
1.3.1.5灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时打开排气阀，旋松螺旋，打开盖子，取出灭菌物品。
1.3.2水样的采取
放开水龙头使水流5min后，用已灭菌的三角烧瓶接取水样，以待分析。
1.3.3制备牛肉膏蛋白胨培养基
1.3.3.1称量
用天平称量33g牛肉膏蛋白胨培养基粉末置于烧杯中。
1.3.3.2溶化
在上述烧杯中加入1000mL蒸馏水，然后，在石棉网上加热，并用玻璃棒搅拌直至沸腾2分钟。
1.3.3.3调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH。如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加
入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/L HCl 进行调节。
1.3.4细菌总数测定
1.3.4.1灭菌移液管吸取1mL水样，注入其中一套灭菌的培养皿中。共做2个平皿。
1.3.4.2分别倾注约15mL已溶化并冷却到45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使自来水和培养基混匀。
1.3.4.3另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL，作空白对照。
1.3.4.4待培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24小时，进行菌落计数。
两个平板的平均菌落数，即为1mL自来水的细菌总数。
2结果与分析
2.1 结果
2.1.1 菌落照片
2.1.2实验数据
测得培养皿中细菌菌落数如下表：
自来水中菌落总数表实验数据
平板序号 1 2 对照组
菌落数目（个）112 110 50
自来水中细菌总数=（平板1菌落数+平板2菌落数）÷2-对照组菌落数
实验中对照组的菌落为50，处理上表中数据知，该自来水中细菌平均数为61个/ mL。
2.2分析
实验测的该自来水中的细菌总数为61个/ mL，符合国家饮用水标准。
3讨论
人的生存离不开水环境，水质的好坏对人们生活起着至关重要的作用，而判断水质的标准，微生物在水中的数量、种类是必不可少的。细菌是微生物界的一个大类群，它与人类的生活密切相关，其中有的有益，有的有害，为了我们更好的生活，我们必须研究细菌，并掌握一些方法，来使细菌向人类有用的方面发展【5】。
本实验对照组中的菌数应为0个，但实验测得数据为50个，这主要是因为有杂菌混入，杂菌来源可能：培养皿灭菌不充分；灭菌后在空气中放置又落入杂菌；培养基倾入培养皿后没有立即加盖；配置培养基时反复升降温（没有立即转移使培养基凝固），使一些杂菌产生抗性【6】。
虽然水中存在大量的细菌且种类繁多，但由于牛肉膏蛋白胨所提供的生长条件的限制，培养基中所得的细菌群落较单一为大肠杆菌，呈圆片状【7】。
实验过程中应做到：（1）将培养基倒置培养。这样绝大多数的细菌会着生在培养基表面。这是由于菌种在固体培养基上借助重力作用而形成的，有利于菌落计数。（2）倒置培养基时应降温至45 ℃，温度过高会烫死大肠杆菌，过低会使培养基凝固；（3）倾注培养基后要将平皿在桌面上做匀速旋转，将培养基和自来水样摇匀，在培养基中观察时可见一些菌苔就是平皿没有摇匀的结果；（4）培养基不能反复升降温，倾入培养皿后应立即加盖，且灭菌后不应在空气中放置，以免杂菌混入；（5）应在高温时在对照组中倒入培养基，否则对照组中会出现大量的菌落【8】。
测定水样是否符合饮用水的微生物方面的卫生标准，通常包括下列两项：细菌总数测定和总大肠菌群的测定。除采用平板菌落计数测定细菌总数外，现在已有许多快速、简便的微生物检测仪或试剂纸（盒或卡）等用来测定水中细菌总数【9】。
4结论
实验测的该自来水中的细菌总数为61个/ mL，符合国家饮用水标准。
通过此实验，我们可知平板菌落计数技术法是测定水样中细菌总数比较方便的方法，但它也存在一些无法避免的因素，比如在数菌落时，菌落太小且又处于培养基内部，这样就不能准确地观察
到菌落，从而影响实验结果；又如在培养过程中由于细菌之间的相互抑制也会使菌落计数的结果减少【10】。因此，只有我们在不需要精确的情况下才可使用此方法。
本实验的成败在于灭菌、无菌操作技术、培养基的温度等方面是否操作正确，所以，今后要更加注意其方法及原理。
参考文献
[1] 沈萍陈向东主编《微生物学实验》（第4版）高等教育出版社
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[5] 张清敏，李洪远，王兰. 环境生物学实验技术，2005
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[7] 张清敏，李洪远，王兰. 环境生物学实验技术，2005
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[10] 张秀绘，苏筱军，李庆平，等．生活饮用水细菌学指标的影响因素．环境与健康杂志，2006，23：152—153
菌落总数、大肠菌群测定方法
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
水中细菌总数的测定
水中细菌总数的检测 1.实验目的 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 2.菌落总数standard plate-count bacteria 水样在营养琼脂上、有氧条件下37°C培养48 h后，所得1 mL水样所含菌落的总数。 细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标，所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染。由于结果不能说明污染的来源，因此必须结合总大肠菌群数来判断污染源和安全程度。 3.培养基与试剂 营养琼脂成分 制法：根据实际需要量，按照上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH为~，分装于玻璃容器中（如用含有较多杂质的琼脂，应先过滤。），经 kPa（121°C,15 lb）湿热灭菌20 min，储存于冷暗处备用。 4.仪器和材料 4.1仪器：高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、水热恒温培养箱、电炉、天平、冰箱。 4.2材料：灭菌平皿（直径9 cm）、灭菌试管、刻度吸管、三角烧瓶、采样瓶、酒精灯、消毒水、 镊子、试管架等。 4.3放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、火柴或打火机。 5.样品采集 5.1自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌，打开龙头放水3-5 min， 用无菌空三角瓶接取水样200 ml。 5.2纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用无菌空三角瓶接取水样 200毫升。 5.3地表水的取样：应取距水面10—15 cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入 水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 6.检验步骤 6.1生活饮用水（自来水、纯净水）：以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1 mL充分混匀的水样，注 入灭菌培养皿中，倾注约15 ml已融化并冷却到45°C左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注培养基作为空白对照。 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36°C±1°C条件下连续培养48 h，进行菌落计数，即为1 ml水样中的菌落总数。 6.2水源水：以无菌操作方法吸取1 ml充分混匀的水样，注入盛有9 ml灭菌生理盐水的试管中，
水中细菌总数的测定
水中细菌总数的测定 一、目的要求 l．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。 2．了解水源水的平板菌落计数的原则。 二、基本原理 本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。 三、器材 l．培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水。 2.仪器或其他用具灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。 四、操作步骤 l．水样的采取 (1)自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流 5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。 (2)池水、河水或湖水应取距水面l0～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 2．细菌总数测定 (1)自来水
①用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。 ②分别倾注约15mL己溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。 ③另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。 ④培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24h，进行菌落计数。 ⑤两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。 (2)池水、xx或xx等 ①稀释水样取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10- 1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。 一般中等污秽水样，取10- 1、10- 2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10- 2、10- 3、10-4三个连续稀释度。 ②自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。 ③各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。
水中细菌总数的检测
水中细菌总数的检测 Revised by Jack on December 14,2020
水中细菌总数的检测 1.实验目的 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 2.菌落总数standardplate-countbacteria 水样在营养琼脂上、有氧条件下37°C培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数。细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标，所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染。由于结果不能说明污染的来源，因此必须结合总大肠菌群数来判断污染源和安全程度。 3.培养基与试剂 营养琼脂成分 制法：根据实际需要量，按照上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH为~，分装于玻璃容器中（如用含有较多杂质的琼脂，应先过滤。），经kPa（121° C,15lb）湿热灭菌20min，储存于冷暗处备用。 4.仪器和材料 仪器：高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、水热恒温培养箱、电炉、天平、冰箱。材料：灭菌平皿（直径9cm）、灭菌试管、刻度吸管、三角烧瓶、采样瓶、酒精灯、消毒水、镊子、试管架等。放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、火柴或打火机。 5.样品采集 自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌，打开龙头放水3-5min，用无菌空三角瓶接取水样200ml。
纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用无菌空三角瓶接取水样200毫升。 地表水的取样：应取距水面10—15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 6.检验步骤 生活饮用水（自来水、纯净水）：以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌培养皿中，倾注约15ml已融化并冷却到45°C左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注培养基作为空白对照。 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36°C±1°C条件下连续培养48h，进行菌落计数，即为1ml水样中的菌落总数。 水源水：以无菌操作方法吸取1ml充分混匀的水样，注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:10稀释液。 吸取1:10稀释液1ml，注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000、1:10000稀释液备用。如此递增稀释一次，必须更换一支刻度吸管。 用灭菌吸管吸取1ml未稀释的水样和2~3个适宜稀释度的水样，分别注入灭菌培养皿内，其余操作同生活饮用水的检验步骤。 7.菌落计数及报告方法 作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平
菌落总数测定
菌落总数的测定 基础知识： 菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。 菌落总数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每g（mL）检测样品所生长出来的细菌菌落总数。由于厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际其中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数、需氧菌数等。 菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生长过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。中国国家标准是国内常用的检验方法。 菌落总数测定的卫生学意义： 食品本身的新鲜程度 加工、贮存运输过程中是否受到污染 卫生学指标：食品中菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全 面的评价。 细菌在平板计数琼脂上的菌落特征蔓延菌在平板计数琼脂上的菌落特征方法来源：
GB 4789.2-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 1、范围 本标准规定了食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测定方法。 本标准适用于食品中菌落总数的测定。 2、术语和定义 菌落总数aerobic plate count 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。 3、设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36℃±1℃。 3.2 冰箱：2℃~5℃。 3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 3.4 天平：感量为0.1g。 3.5 无菌袋。 3.6 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。 3.7 无菌培养皿：直径90mm。 3.8 放大镜或/和菌落计数器。 4、培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基 按照称取23.5g培养基溶于1000mL蒸馏水的比例进行配置，分装到锥形瓶，121℃高压灭菌15min。 4.2 0.85%无菌生理盐水 称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水。一般用1000mL锥形瓶配置，称取6.8g的氯化钠，加入800mL蒸馏水，121℃高压灭菌15min。
水 中 细 菌 总 数 的 检 测
水中细菌总数的检测 一、实验的目的要求 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 二、实验原理 细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标。我国现行的生活饮用水标准检验方法GB5750—85规定水样中细菌总数测定是1ml水样在普通营养琼脂培养基中37℃经24小时培养所生长的细菌菌落的总数。所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染，但不能说明污染的来源。因此必须结合总大肠菌群数来判断水污染的来源和安全程度。 本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 平板菌落计数法的优点： 能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品和生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。 缺点：手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。 生活饮用水细菌卫生标准 我国饮用水卫生标准： ≤3个大肠菌群/1L饮水，≤100个细菌总数/1ml饮水
三、实验仪器和材料 1、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱、冰箱、无菌接种间。 2、消毒酒精、消毒水。 3、试管、三角瓶、平皿、刻度吸管、涂布器等（实验前包扎灭菌处理好备用） 4、培养基 蛋白胨10g 牛肉膏3g 氯化钠5g 琼脂10~20g 蒸馏水1000ml 制备方法： 按照实际的需要量，按上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH 为7.4~7.6，，分装于玻璃容器中，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min，倒制成平板后储存于冷处备用。 5、水样：自来水、中水。 四、实验内容： （一）、培养基的制备： 实验前事先准备好培养基平板（方法见上），每小组2-4个平板。（二）、取水样： 1、自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌， 打开龙头放水1-2分钟，用无菌空三角瓶接取水样200毫升。 2、纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用
食品中菌落总数的测定方法(参照材料)
食品中菌落总数的测定 一、实验目的 （1）学习和掌握测定食品中菌落总数的基本方法 （2）学会菌落总数的报告方式 二、实验材料 1、仪器与设备：恒温培养箱、托盘天平、电炉、吸管、三角瓶、平皿、试管、试管架、酒精灯、灭菌刀或剪刀、75%酒精棉球、玻璃蜡笔。 2、培养基和试剂：75%乙醇、0.85%生理盐水、琼脂培养基：胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、 琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH 7.0±0.2 3、检样：利乐包装鲜牛奶250ml 三、实验方法与步骤 1、检验程序 菌落总数检验程序： 检样→做成几个适当倍数的稀释液→选择2-3个适宜稀释度各以1ml之量分别入灭菌平皿内→每皿内加入46℃15-20ml营养琼脂→置36±1℃恒温箱内培养（48±2）h取出→菌落数→报告 2、检样稀释及培养 （1）以无菌操作，将检样包装打开，用吸管取25ml鲜牛奶，放于含有225ml灭菌生理盐水的500ml灭菌玻璃三角瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠），经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。 （2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。 （3）另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。 （4）根据食品卫生检验标准要求和检样的菌落数量，选择3个连续适宜稀释度即10、10－1、10－2，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。（5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿15ml~20mL，并转动平皿使与稀释检样混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 （6）等琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃恒温箱内培养（48±2）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1mL样品所含菌落总数。 四、检样中细菌菌落总数的计算与报告 1、菌落计算方法 （1）菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 （2）菌落计数的报告 ①平板菌落数的选择 选取菌落数在30～300 CFU之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，
水中细菌总数的检测
水中细菌总数的检测 1. 实验目的 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 2. 菌落总数standard plate-count bacteria 水样在营养琼脂上、有氧条件下37°C培养48 h后，所得1 mL水样所含菌落的总数。细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标，所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染。由于结果不能说明污染的来源，因此必须结合总大肠菌群数来判断污染源和安全程度。 3. 培养基与试剂 2.1 营养琼脂成分 2.2 制法：根据实际需要量，按照上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4~7.6，分装于玻璃容器中（如用含有较多杂质的琼脂，应先过滤。），经10 3.43 kPa（121°C,15 lb）湿热灭菌20 min，储存于冷暗处备用。 4. 仪器和材料 仪器：高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、水热恒温培养箱、电炉、天平、冰箱。材料：灭菌平皿（直径9 cm）、灭菌试管、刻度吸管、三角烧瓶、采样瓶、酒精灯、消毒水、镊子、试管架等。放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、火柴或打火机。 5. 样品采集 自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌，打开龙头放水3-5 min，用无菌空三角瓶接取水样200 ml。 纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用无菌空三角瓶接取水样200毫升。 地表水的取样：应取距水面10—15 cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 6. 检验步骤 生活饮用水（自来水、纯净水）：以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1 mL充分混匀的水样，注入灭菌培养皿中，倾注约15 ml已融化并冷却到45°C左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注培养基作为空白对照。 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36°C±1°C条件下连续培养48 h，进行菌落计数，即为1 ml水样中的菌落总数。 水源水：以无菌操作方法吸取1 ml充分混匀的水样，注入盛有9 ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:10稀释液。 吸取1:10稀释液1 ml，注入盛有9 ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000、1:10000稀释液备用。如此递增稀释一次，必须更换一支刻度吸管。用灭菌吸管吸取1 ml未稀释的水样和2~3个适宜稀释度的水样，分别注入灭菌培养皿内，
污水中细菌总数测定
污水中细菌总数测定 （一）实验目的： (1)了解和学习水中细菌总数 (2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法 （二)实验原理 水中的病菌如伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、钩端螺旋体等主要来自人和动物的粪便及污染物。因此，粪便管理在控制和消灭消化道传染病有重要意义。但直接检查水中的病原菌是比较困难的，常用测定细菌总数和大肠杆菌菌群数，来判断水的污染程度，目前我国规定生活饮用水的标准为1m1水中细菌总数不超过100个, 超过此数，表示水源可能受粪便等污染严重，水中可能有病原菌存在。 所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。 (三)实验器材 (1) 菌落总数的测定： 1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。 2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。 （四）实验方法 (1)水样的采集： 1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。 2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。 (2)细菌总数的测定： 1)水样稀释及培养： ①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释： ⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000 三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。
菌落总数的测定
实验九菌落总数的测定 一、目的要求 学习掌握菌落总数测定的基本原理和方法，了解食品上微生物的分布和繁殖动态。 二、实验说明 菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。 菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质等）去满足其要求才能将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去作。细菌菌落总数的测定，所得结果，只包括一君能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数。 三、实验材料 （1）培养箱 36±1℃ （2）恒温水浴 46±1℃ （3）天平。 （4）可调式电炉。 （5）吸管 1.0ml、10.0ml,标有0.1ml单位刻度。 （6）广口瓶 500ml，有盖。 （7）玻璃珠直径5mm。
（8）平皿皿底直径9.0cm。 （9）试管 18×200mm。 （10）酒精灯。 （11）试管架。 （12）研钵。 （13）灭菌刀和剪刀。 （14）灭菌镊子。 （15）酒精棉球。 （16）玻璃蜡笔。 （17）营养琼脂培养基。 （18）灭菌生理盐水、分装于试管中，每管9.0ml。 （19）食品检样。 四、检验程序（图9-1） 五、方法步骤 （一）检验稀释和培养 1、以无菌操作，将检样25g（或25ml）剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水的广口瓶内（瓶内置有适量玻璃珠）或灭菌研钵内，经充分振摇或研磨用成1：10的均匀稀释液。 2、用1.0ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1.0ml，沿管壁徐徐注入含有9.0ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内液面），振摇试管混合均匀，作成1：100的稀释液。 3、另取1.0ml灭菌吸管，按上述操作作10倍稀释，如此每递增
食品中菌落总数的测定实验
食品中菌落总数的测定实验 一、实验目的： 了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法，认识细菌、放射菌、霉菌、的菌落特征。 二、原理 平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 该计数法的缺点是操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是这种计数方法最大的优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等含菌指数或污染度的检测 三、试剂和材料 1.仪器 恒温培养箱：（36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。） 均质器或振荡器
无菌吸管：1 ml（0.01 ml 刻度）、10 ml（0.1 ml 刻度）或微量 移液器及吸头 无菌锥形瓶：容量250 ml、500 ml、 无菌培养皿：直径90 mm 菌落计数器 2.样品 1）平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基：蛋白胨 5.0 g 、酵母浸膏2.5 g 、葡萄糖1.0 g 、琼脂15.0 g、蒸馏水1 000 ml、pH 7.0±0.2。 将所有成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 ℃高压灭菌15 min。 注：用平板计数琼脂，称取23.5 g于1 000 ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121 ℃高 压灭菌20min，冷却至45~47℃左右备用。 2）无菌生理盐水：氯化钠（NaCl）5.875g 蒸馏水(纯净水) 500ml 称取5.875ｇNaCl溶于500ml蒸馏水中，121 ℃高压灭菌20min。 3.器材 100ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、天平、称样瓶、 记号笔、酒精灯等。 四、操作及实验步骤 1.样品的稀释：25 g(ml)样品+225 ml 稀释液，均质。 10倍系列稀释。每递增稀释一次，换用 1 次1 ml 无菌吸管或吸头。 （注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）选择2个～3个适宜稀释度 的样品匀液，各取1 ml分别加入无菌培养皿内。吸取 1 ml 空白稀释 液作空白对照。每皿中加入15 ml～20 ml 平板计数琼脂培养基，并 转动平皿使其混合均匀。
水中细菌总数的检测
建筑 水中细菌总数的检测 1.实验目的 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 2.菌落总数 standard plate-count bacteria 水样在营养琼脂上、有氧条件下 37°C培养 48 h后，所得 1 mL水样所含菌落的总数。细菌 总数是评价水质污染程度的主要卫生指标，所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污 因此必须结合总大肠菌群数来判断污染源和安全程度。 染。由于结果不能说明污染的来源， 3.培养基与试剂 2.1营养琼脂成分 2.2制法：根据实际需要量，按照上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4~7.6，分装于玻璃容器中（如用含有较多杂质的琼脂，应先过滤。），经 10 3.43 kPa（121°C,15 lb）湿热灭菌 20 min，储存于冷暗处备用。 4.仪器和材料 仪器：高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、水热恒温培养箱、电炉、天平、冰箱。材料：灭菌平皿（直径 9 cm）、灭菌试管、刻度吸管、三角烧瓶、采样瓶、酒精灯、消毒水、镊子、 试管架等。放大镜或菌落计数器、 pH计或精密 pH试纸、火柴或打火机。 5.样品采集 自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌，打开龙头放水 3-5 min，用无菌空三角瓶接取水样200 ml。 纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用无菌空三角瓶接取水 样 200毫升。 地表水的取样：应取距水面10— 15 cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸 入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出， 最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 6.检验步骤 生活饮用水（自来水、纯净水）：以无菌操作方法用灭菌吸管吸取 1 mL充分混匀的水样，注入灭菌培养皿中，倾注约 15 ml已融化并冷却到 45°C左右的营养琼脂培养基，并立即旋 摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种， 同时另用一个平皿只倾注培养基作为空白对照。 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36°C±1° C条件下连续培养 48 h，进行菌 落计数，即为 1 ml水样中的菌落总数。 水源水：以无菌操作方法吸取 1 ml充分混匀的水样，注入盛有 9 ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈 1:10稀释液。 吸取 1:10稀释液 1 ml，注入盛有 9 ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:100稀释液。按同 法依次稀释成 1:1000、1:10000稀释液备用。如此递增稀释一次，必须更换一支刻度吸管。 用灭菌吸管吸取 1 ml未稀释的水样和 2~3个适宜稀释度的水样，分别注入灭菌培养皿内，
食品中菌落总数的测定
【说明】蛋糕具有松软香甜，携带方便、食用简单等特点，因此成为人们居家生活特别是旅途中不可或缺的一种美食，深受人们的喜爱。测定蛋糕中的菌落总数可以用来判定其被微生物污染的程度及卫生质量，它反映蛋糕在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价，菌落总数的多少在一定程度上标志着蛋糕产品质量的优劣，因此，测定蛋糕中的菌落总数具有重要意义。目前应用于测定食品中菌落总数的方法有: 纸片法、电阻抗法等。本实验采用国标法(GB\T 对独立包装小蛋糕中菌落总数进行测定。并与GB 7099-2003糕点、面包卫生标准中规定的冷加工糕点中菌落总数≤10000（cfu/g）的数据对比初步判断样品是否符合卫生要求。 一、实验目的 1、学习并掌握测定蛋糕中菌落总数的方法及原理。 2、通过对比实验验证冷藏对蛋糕的保鲜及抑菌作用。 3、了解菌落总数测定在食品卫生学评价中的意义。 二、实验原理 菌落总数即为食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。 菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质等）去满足其要求才能将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法。细菌菌落总数的测定，所得结果，只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数。菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、实验设备与材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱：36 ℃±1℃，30℃±1 ℃。 冰箱：2 ℃～5 ℃。
微生物综合性实验__水中细菌总数的测定
微生物综合实验水中细菌总数的测定 一、实验目的 1．学习水样的采集和水样中细菌总数的测定方法。 2．了解和掌握平板菌落计数的原则。 3．复习、巩固微生物实验的各单元操作。 二、实验原理 水中细菌总数的测定是进行水质检验的必要项目之一，主要作为判定饮用水、水源水、地表水等被污染程度的标志。 本试验采用平板菌落计数技术来测定水中的细菌总数。该法是根据在固体培养基上所形成的菌落来进行计数。菌落总数是指在一定条件下，1 mL水样所生长出来的细菌菌落的总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基和在一种条件下，使水中的所有细菌均能生长繁殖，因此，这种方法所得到的结果只是一种近似值。目前一般采用营养琼脂培养基，在需氧条件下，37℃培养36-48 h，所得到的细菌绝大部分是腐生性的嗜中温性需氧菌和兼性厌氧菌。 三、实验材料 1．检样：矿泉水等饮用水、河水、湖水、井水等。 2．培养基：营养琼脂培养基（附录Ⅱ-1.3） 3．仪器与其它用具：三角烧瓶，广口瓶，吸管，培养皿，试管，培养箱等。 四、实验步骤 1. 水样的采集与处理 ⑴饮用水：采样前，先用酒精棉球擦拭瓶口灭菌，以灭菌移液管或移液枪取水样。 ⑵河水、湖水、池水：应取距水面10 cm~15 cm的深层水样。先将已灭菌的带玻璃塞的广口瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来使瓶口向上，拔去瓶塞，待水盛满后，将瓶塞盖好，再将瓶子从水中取出。在一定深度采水样时，需要用特制的采水器（图14-14）。采水器是一金属框，内装玻璃瓶，其底部装有重沉坠，可按需要坠入一定深度。瓶盖上系有一绳索，拉吊绳索即可打开瓶盖，待水样瓶中水盛满后，放松绳索，即自行盖上瓶盖。水样采集后，将水样瓶取出，并立即用无菌棉塞或灭菌胶塞塞好瓶口，以备检验。 水样采集后应立即检验，如需要保存或运送，应采取冰镇措施，但一般要求不得超过4 h。 图14-14 采水器 1-开瓶绳索2-铁框3-瓶盖4-水样瓶5-沉坠 2. 细菌总数的测定 ⑴饮用水： ①用灭菌吸管吸取0.2 mL水样，涂布于事先准备好平板中，共做2个平皿。 ②另取一空的灭菌培养皿，倾注15 mL~20 mL牛肉膏蛋白胨培养基，作为空白对照。 ③将平皿倒置于37℃培养箱内，培养24 h，进行菌落计数。 ⑵河水、湖水、池水等：
细菌总数的测定
细菌总数的测定（平皿计数法） 1.概述 本法适用于生活用水、循环冷却水及其它水中细菌总数的测定。也适用于反渗透脱盐水中细菌总数的测定。 敞开式循环冷却水系统细菌总数的要求：≤1×105个/mL。 2.方法介绍 本法采用25号浮游生物网收集循环冷却水中的黏泥，所得的黏泥用石英砂充分研磨使细胞分散，再利用平皿计数技术在（29±1）℃培养72h来测定黏泥中的细菌总数。 3.试剂和材料 3.1 牛肉膏，生化试剂。 3.2 蛋白胨，生化试剂。 3.3 NaCl. 3.4琼脂，生物试剂。 3.5 NaOH溶液，40g/L。 3.6 HCl，1＋11溶液。 3.7 乙醇溶液，75％。 3.8 牛皮纸。 3.9 医用脱脂棉。 3.10 医用脱脂纱布。 3.11 石英砂，210～150μm 。 4.仪器和设备
4.1 25号浮游生物网。 4.2 量筒，25mL和500mL。 4.3 转子流量计。 4.4 瓷研钵。 4.5 无菌箱（室）或超净工作台。 4.6 蒸汽压力灭菌器。 4.7 生化培养箱。 4.8 电热干燥箱，温度可控制在[（60～280）±2]℃. 4.9 刻度吸管，1mL和5mL。 4.10 磨口三角瓶，100mL。 4.11容量瓶，1000mL。 4.12 培养皿，d90mm 。 4.13 三角瓶，500mL。 4.14 搪瓷量杯，1000mL。 5.试验前的准备 5.1 培养基的制备 称取下列试剂：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,琼脂15.0g。将上述试剂加水约950mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中，并用热水补充至1000mL。用NaOH溶液或HCl溶液调节pH值至7.2±2，并分装在500mL三角瓶中，每瓶分装量不超过其总容量的2/3。塞上棉塞，用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器在（121±1）℃下灭菌15min,此为灭过菌的培养基。
实验 水中细菌总数的测定 水中大肠杆菌的测定
实验2 水中大肠菌群数的测定 一、目的要求 1．了解大肠菌群数量在引用水中的重要性 2．学习掌握多管发酵法和滤膜法测定大肠菌群数 二、原理 若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中容易死亡与变异，因此数量较少，要从中特别是自来水中分离出病原菌常较困难与费时，这样就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是较易检出的。若指示菌在水中不存在或数量很少，则大多数情况也保证没有病原菌。最广泛应用的指示菌是大肠菌群，它的定义是：一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌，并在乳糖培养基中，经37oC、24～48h培养能产酸产气，根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。我国规定每升自来水中大肠菌群不得检出；若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，其大肠菌群数平均每升不得超过10000个。 检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。多管发酵法使用历史较久，又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用；滤膜法是一种快速的替代方法，而且结果重复性好，又能测定大体积的水样，目前国内已有很多大城市的水厂采用此法。 三、实验仪器和材料 1．锥形瓶（500 ml）、试管（18 mm×180 mm）、大试管（容积150 ml）、移液管1 ml 及10ml、培养皿（直径90 mm）、接种环、试管架1个。 2．革兰氏染色液一套：草酸铵结晶紫、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液 3．显微镜 4．自来水（或受粪便污染的河、湖水）400ml 5．蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、无水亚硫酸钠、牛肉膏、氯化钠、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液、5％碱性品红乙醇溶液、2％伊红水溶液、0.5％美蓝水溶液。 6．10％NaOH、10％HCl、精密pH试纸6.4～8.4。 四、实验前准备工作 （一）配培养基 1．乳糖蛋白胨培养基（供多管发酵法的复发酵用） 配方：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1 ml、蒸馏水1 000ml、pH＝7.2～7.4。 制备：按配方分别称取蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1 000 ml蒸馏水，调整pH为7.2～7.4。加入1．6％溴甲酚紫乙醇溶液1 ml，充分混匀后分装于试管内，每管10 ml，另取一小倒管装满培养基倒放入试管内。塞好棉塞、包扎。置于高压灭菌锅内以0.7kg/cm2（115℃）灭菌20min，取出置于阴冷处备用。 2．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（供多管法初发酵用） 按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于试管中，每管5ml。再分装大试管，每管装50ml，然后在每管内倒放装满培养基的小导管、塞棉塞、包扎，置高压灭菌锅内以0.7kg/cm2（115℃）灭菌20min，取出置于阴冷处备用。 3．品红亚硫酸钠培养基（即远滕氏培养基），供多管发酵法的平板划线用 配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾3.5g、琼脂20～30g、蒸馏水1000ml、无水亚硫酸钠5g左右、5％碱性品红乙醇溶液。 制备：先将琼脂加入900ml蒸馏水中加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，加蒸馏水补足至l 000 ml，调整pH为7.2～7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测.docx
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测（1） 录入时间 :2010-9-25 11:17:29来源：生物信息网 （一 ) 实验目的 (1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。 (2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。 (3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。 （二 ) 实验原理 水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物( 如光合藻类 ) 、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的 排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。 水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过 3 个，细菌总数每mL不超 过 100 个。 所谓细菌总数是指算的是平板上形成的菌落 1mL或 1g 检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中 活菌的数量。 所谓大肠菌群，是指在 37℃24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总 称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。 水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄 物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排 泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进 行大肠菌群的检查。 水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操 作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻
微生物检测菌落总数测定方法(精)
微生物学检验菌落总数的测定 1 原理 微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。它是通过将样品制成均匀的一系列 不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。 2 材料和仪器 2.1 平皿：φ90mm 。 2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。 2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.4 灭菌锅。 2.5 恒温培养箱 2.6 涂棒。 2.7 酒精灯。 2.8 超净工作台。 2.9 磁力搅拌器。 2.10 漩涡振荡器 3 检验程序 菌落总数的检验程序见下图。 方法①↙ ↘方法② ↘ ↙
4 操作步骤 4.1 培养基和试剂的配制 4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用） 牛肉膏5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂20g 蒸馏水1L pH 7.0～7.2 将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。 4.1.2 无菌生理盐水的配制： 称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。 4.2 样品的稀释： 4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装 数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。 4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀 释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。 4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL 无菌吸管或吸头。 4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。 4.2 平板接种与培养 接种方法1： 用1mL无菌吸管或微量移液器分别吸取不同稀释度的菌悬液1mL于一个无菌培养皿中（每个稀释度做三个重复），再在培养皿中分别倒入10～15mL已融化并冷却至45~50℃的培养基，盖好平皿盖子，趁热轻轻转动培养皿，使菌液与培养基充分混合均匀，冷凝后在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以无菌水作空白对照。 注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：10-8，10-9，10-10。 接种方法2： 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取0.2ｍＬ稀释液均液于计数培养基平板上，将稀释液涂布均匀，吸附，在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以无菌水作空白对照。（计算时需要把0.2mL的倍数也计算在稀释倍数内） 注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：10-7，10-8，10-9。 ４.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时借用放大镜或菌落计数器，以防遗漏。记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units,CFU）表示 4.3.1 选取菌落数在30~300之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用3个平行平板的平均数。