分子标记技术的类型及其原理

分子标记技术的类型及其原理

08农生1班陈耀光 200830010403

所谓分子标记就是基于基因组DNA 存在极其丰富的多态性而发展的一类可以直接反映生物个体间DNA 水平上差异的新型的遗传标记方法。在遗传学发展过程中，先后出现了形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记，其中以分子标记最为理想、可靠，因为DNA分子中碱基的缺失、插入、易位、倒位或是长短与排列不一的重复序列等产生的差异，都可以通过分子标记进行检测。DNA 分子标记较以往的形态标记其优越性表现在：(1)以核酸为研究对象，不受季节、环境限制，不存在基因表达与否的问题，也没有组织或器官特异性；(2)数量的丰富性，遍及整个基因组，标记的数量几乎是无限的；

(3)多态性高，自然存在丰富的等位变异；(4)许多标记表现为共显性，能很好地鉴别纯合基因型与杂合基因型；(5)检测手段简便、快速，并且重复性好；(6)既不对目标形状的表达造成影响，也不会与不良性状之间产生必然的关联。

1 分子标记的类型及其原理

分子标记技术自诞生以来，短短的几十年时间中得到突飞猛进的发展，至今被发展和利用的分子标记技术已有二十余种，为不同研究领域提供了有效的技术手段，同时也发挥着至关重要的作用。目前，根据对DNA 多态性检测手段和所应用序列范围的不同，对部分分子标记技术分类如下。

1.1 基于全基因序列的分子标记

RFLP (restriction fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性)：RFLP 作为最早发展的分子标记技术由Grozdicker 等于1974 年创建，并由Bostein 等再次提出。RFLP 技术的出现开创了直接在DNA 水平上进行遗传研究的新时代。其基本原理是：基因组DNA中限制性内切酶所识别的序列由于出现碱基变化而致使酶切位点的数量也变化，从而使酶切片段长短发生差异产生长度多态性。利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，由于不同个体中酶切位点的差别就得到了长短相异的片段DNA，电泳分离后，借助Southern 杂交将DNA 片段转移至硝酸纤维素膜上，将具有放射性标记的探针与膜上的片段杂交，通过放射自显影技术就可以获得显示物种特异性的多态性图谱。RFLP 标记的等位基因是共显性的，能区分纯合基因型和杂合基因型，结果稳定可靠，重复性好，适合于连锁图谱的建立。但是对DNA 要求较高，检测步骤多，操作复杂，耗时费资，而且需要放射性同位素等，这都在很大程度上限制了RFLP 技术的应用。

RAPD (randomly amplified polymorphic DNA,随机扩增多态性DNA)：1990 年Williams 等(1990)与Welsh 和McClelland (1990)两个研究小组分别提出RAPD 标记技术，该技术是建立在PCR 基础上，对未知序列的全基因组进行多态性分析的一种新型分子标记技术。其基本原理是利用一个人工合成的随机寡核苷酸(一般为8~10 bp)为引物，通过PCR对基因组DNA 进行体外扩增，产生大小不同的DNA 片段，再经凝胶电泳分析扩增产物呈现DNA 片段的多态性。与RFLP 相比，RAPD 技术的优点是技术简单，检测迅速，安全性好，DNA 用量少，设计引物不需知道序列信息等，但RAPD 标记为显性遗传，不能区分纯合基因型与杂合基因型，且易受多种因素影响，结果的稳定性和重复性难以保证。

AFLP (amplification fragment length polymorphism,扩增片段长度多态性；又称选择性限制片段扩增：AFLP 技术是1993 年由荷兰科学家Zabeau等创建的一种将限制性酶切和PCR 技术相结合的检测DNA 多态性的分子标记方法。其实质是对基因组DNA 限制性酶切片段进行选择性扩增，具体过程为基因组DNA 经两种或两种以上的限制性内切酶酶切，产生大小不等的随机片段，将人工双链接头连接到这些片段的末端，从而作为扩增反应的模板，再根据接头的序列和酶切位点设计引物实现选择性PCR 扩增。AFLP 技术可以说是集RFLP 和RAPD 技术与一身，兼备两者的优点，既有RFLP 的可靠性，又具有RAPD 的高效性，且重复性好，是一种十分理想的遗传标记，但与此同时也给试验带来了昂贵的费用和复杂的操作过程，尽管如此，该技术依然在遗传多样性研究、遗传图谱的构建、基因定位和品质鉴定等方面已得到广泛的应用，经过人们近年来不断地改进和完善，AFPL 被认为是迄今为止最有效的分子标记。

1.2 基于简单重复序列的分子标记

SSR (simple sequence repeat, 简单序列重复, 又称微卫星DNA)：一般是指基因组中存在的由2~6 个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。这种序列广泛分布于真核生物基因组，含量丰富，且随机均匀分布，其重复次数的不同产生了等位基因之间的多态性。微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成，可以根据SSR 两侧的保守序列设计引物进行PCR 扩增，由于不同品种SSR 基序的重复次数不同，导致PCR 扩增条带差异性，即简单重复序列长度多态性(simple sequencelength polymorphism, SSLP)。SSR 标记具有以下优点：表现多为共显性遗传，遵循孟德尔遗传法则；数量丰富，广泛分布于整个基因组；对DNA 数量及纯度要求不高，易于利用PCR 检测；实验操作简便，结果稳定，重复性强。然而，SSR 引物具有高度的种属特异

性，开发和合成新的SSR 引物费用高、难度大，但由于其优点众多，在遗传图谱构建、基因定位、品种鉴定、种质资源保存和利用等方面均有十分广泛的应用。

ISSR (inter-simple sequence repeat, 内部简单序列重复)：ISSR 技术是对SSR 的进一步发展，利用SSR 本身设计引物，其基本原理就是在SSR 的3' 或5' 端锚定1~4 个随机选择的核苷酸，从而保证引物对两个相距较近、方向相反的SSR 之间的DNA 区段进行PCR 扩增，然后进行电泳、染色，观察谱带情况分析不同样品间的多态性，因此这类标记又被称为锚定简单序列重复(anchored simple sequence repeat,ASSR)或锚定微卫星引物PCR (anchored microsatellite-primed PCR)。该技术具有引物设计简单，多态性较RFLP、SSR、RAPD 丰富，可重复性和稳定性好于RAPD 等特点。

SPAR (single primer amplification reaction, 单引物扩增反应)：是与RAPD 技术相似的一种分子标记技术，SPAR 也只用一条引物，不同在于所用引物不是随机的，而是根据SSR 序列设计，通过PCR 扩增SSR 之间的序列，然后电泳分析其多态性。另外，还有一种与SPAR 技术十分相近的标记技术，即ISTR(inverse sequence-tagged repeat, 反向序列标签重复技术)，在反向重复序列基础上设计引物，进而扩增反向重复序列之间的DNA 序列。

1.3 基于已知的特定序列的分子标记

STS (sequence tagged site, 序列标签位点)：是指基因组上一段已知序列的、作为位置标志的单拷贝短DNA 片段，长度多在200~500 bp 之间。这种序列通常在染色体上只出现一次，从而可以作为基因组中的特异位点，以此判断DNA 的方向和其它特定序列的相对位置。理论上说，任何单拷贝序列，只要知道其在基因组中的位置，都可以转变为STS 标记。依据单拷贝DNA 片段两端序列设计一对长度为20 bp左右的特异引物，进行PCR 扩增以显示STS 特异片段。STS 标记的特点是操作简单，信息量大，多态性好，呈共显性标记，在人类基因组物理图谱作图中发挥着重要的作用。

EST (expressed sequence tag, 表达序列标签)：EST 技术于1991 年由美国国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health, NIH) 的生物学家Venter 首次提出。EST 是指对cDNA 文库中随机挑选克隆，对其5'端或3' 端进行一步法测序后获得的长约150~500 bp的表达序列片段。一个EST 可代表生物体某种组织某一时期的一个表达基因。以EST 为基础的分子标记除具有一般分子标记的特点外，还有开发简便、信息量高和通用性好等优势。

EST 标记根据开发的方法不同可以分为4 类：(1) EST-PCR 和EST-SSR (微卫星)

标记，是以PCR技术为核心，操作简便、经济，是目前研究和应用最多的一类；(2) EST-SNP (单核苷酸多态性)标记，是以特定EST 区段内单个核苷酸差异为基础的标记，可依托杂交、PCR 等多种手段进行检测；(3) EST-AFLP标记，是以限制性内切酶技术和PCR 相结合为基础的标记；(4) EST-RFLP 标记，是以限制性内切酶和分子杂交为依托，以EST 本身作为探针，与经过不同限制性内切酶消化后的基因组DNA 杂交而产生的。

1.4 基于反转录转座子的分子标记

SSAP (sequence-specific amplification polymorphism,特异性序列扩增多态性)：SSAP 是一种基于反转录转座子插入位点与邻近限制性内切酶位点之间的DNA 多态性，其基本步骤是将基因组DNA 酶切后，连接与酶相对应的接头，预扩增后利用基于长末端重复序列的特异性引物和加选择性碱基的酶切引物进行PCR 扩增。SSAP 技术是目前应用最广泛的一种基于转座元件的分子标记，具有标记数量多、稳定性高等优点，但其结果受多种因素影响，难以保证结果的有效性和可靠性。

IRAP(inter-retrotransposon amplified polymorphism,逆转录转座子插入位点间扩增多态性)：Kalendar等(1999)提出的一种能够检测逆转录转座子插入位点间多态性的分子标记。原理是根据逆转录转座子的长末端重复序列中的保守序列设计引物，检测基因组中相邻的同家族逆转录转座子成员之间的片段，还可以根据逆转录酶基因中相对保守区域设计引物进行扩增。

REMAP(retrotransposon-microsatellite amplifiedpolymorphism, 逆转录转座子微卫星扩增多态性)：REMAP 技术是一种基于反转录转座子的标记技术，基本原理是利用逆转录转座子的长末端重复序列中的保守序列与SSR 序列分别设计引物，以便扩增出逆转录转座子与相邻的SSR 间的片段，进而可以检测逆转录转座子插入位点上长末端重复序列与简单重复序列之间的多态性。

1.5 基于单核苷酸的分子标记

SNP (single nucleotide polymorphism, 单核苷多态性)：SNP 是指基因组上同一位点不同等位基因之间的单个核苷酸变异引起的DNA 序列多态性，这种变异可以由单碱基的转换(以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤)或颠换(嘌呤与嘧啶互换)，也可由单碱基的插入或缺失，但通常所说的SNP 不包括后两种情况。SNP 作为一种新型的分子标记在理论研究和实际应用上均具有极大的潜力，被认为是应用前景最好的遗传标记。SNP 具有数量多、分布广泛、稳定性好、检测快速、可进行自动化检测等优点，另外，SNP 不再以DNA 片段长短作为检测手段，而是直接以序列的变异为标记，

同时摒弃了经典凝胶电泳分子，取而代之的是最新的DNA 芯片技术。

SSCP (single-strand conformation polymorphism,单链构象多态性)：SSCP 是一种基于DNA 构象差异来检测点突变的分析技术。在自然状态下，单链DNA 碱基序列决定其特定的空间构象。如果扩增的目的DNA 片段序列发生碱基变异，就可能造成其单链的空间构象发生改变，从而通过其单链电泳时不同的迁移速率显示出不同生物个体DNA 之间的特异性。该方法快速、简便，不足之处是只能作为突变检测的手段，需要进一步测序才能确定突变的位置与类型。

2 展望

分子标记技术是目前最为有效和理想的标记手段，由于克服了传统遗传研究方法的繁琐程序以及容易受外界因素干扰等弊端而使其在遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等方面得到相当广泛的应用，展现出广阔的应用前景。与此同时，分子标记技术本身也有待加强提高，如一些技术存在着操作繁琐、周期长、成本高和稳定性差等缺点，另外，伴随着我们对基因组序列的不断深入了解，人们必然趋向于建立一个标记位点即代表一种特定基因或特定形状这样的分子标记技术，也必将开发出操作更加简便快捷、成本更低、重复性与稳定性更高的分子标记技术。相信随着分子生物学理论认识和技术手段的不断发展，分子标记技术会变得更高效、更可靠，使其在各个领域发挥更大的作用。