实验六 蛋白质家族序列模式及多序列比对

实验六、多序列比对及进化树的构建（3学时）

目的：

1、了解蛋白质序列模式二级数据库的结构、内容及基本使用方法。

2、了解多序列比对工具ClustalW/X的使用方法并学习对比对结果进行编辑与分析。

3、学习如何构建系统进化树。

内容：

一、蛋白质功能位点数据库PROSITE、蛋白质序列指纹图谱数据库Prints的内容、结

构及使用。

1、熟悉PROSITE数据库的数据结构。

从生物学院-国家生物学理科基地-课件下载处下载最新的课程相关内容.rar,解包后打开实验数据-实验二中的CBI EMBL format_P02753，找到Database cross-references项中的PROSITE，点击PS00213的链接。则显示PROSITE数据库中Lipocalin 模式（AC号为PS00213）的记录信息。利用网上的PROSITE user manual

（https://www.360docs.net/doc/cf11270567.html,/prosite/prosuser.html#convent36）理解每一个字段及内容的含义。回答问题：

A、Lipocalin pattern的长度是多少？

B、请解释/TAXO-RANGE=??EP?的含义。

C、分别解释NR字段中三行数据的含义。

D、Q28133蛋白（ALL2_BOVIN）是否符合此pattern？

E、Is this a good pattern? Why?

2、PROSITE数据库的检索。

ExPaSy(https://www.360docs.net/doc/cf11270567.html,/prosite/) 及SRS（https://www.360docs.net/doc/cf11270567.html,，https://www.360docs.net/doc/cf11270567.html,）都提供了对PROSITE数据库的检索服务。可以通过AC、ID、description、author等信息进行数据库检索，你还可以通过各序列数据库中的交叉引用链接（cross-references or xref等）找到相应的PROSITE pattern, profile or rules 信息。

ScanProsite工具（https://www.360docs.net/doc/cf11270567.html,/tools/scanprosite/）则可以分析查询序列中可能包含的序列模式或序列谱，以作为进一步鉴定的基础。同时，ScanProsite 还可以利用特定的序列模式进行对SWISS-PROT、TrEMBL及PDB数据库的搜索以获得相应数据库中所有具有此模式的序列。利用ScanProsite的help页面了解有关的使用方法。

回答问题：

F、如果查找PLEK_HUMAN序列中所包含的序列模式或序列谱？

G、如何利用ScanProsite在SWISSPROT中查找有多少个人类（homo sapiens）序列包含

有与PLEK_HUMAN相同的序列谱？请写明过程。此查询执行的过程很慢，预先作过的结果可从实验六-prosite-ScanProsite Results Viewer of PLEK_HUMAN PROFILE.html文件中查看。

3、蛋白质序列指纹图谱数据库Prints的数据内容及查询工具。

利用课程相关内容-实验数据-实验二中的CBI EMBL format_P02753，找到Database cross-references项中的PRINTS，点击PR00179的链接，即显示PRINTS数据库中Lipocalin 蛋白序列指纹信息。利用PRINTS数据库的用户指南

（https://www.360docs.net/doc/cf11270567.html,/dbbrowser/PRINTS/printsman.html）熟悉其中的内容与含义。利用FingerPrintScan（https://www.360docs.net/doc/cf11270567.html,/fingerPRINTScan/）进行查询序列中的序列指纹鉴别（以实验五中的蛋白质查询序列为例）：

MSTA VLENPGLGRKLSDFGQETSYIEDNCNQNGAISLIFSLKEEVGALAKVLRLFEEN DVNLTHIESRPSRLKKDEYEFFTHLDKRSLPALTNIIKILRHDIGATVHELSRDKKKDTV PWFPRTIQELDRFANQILSYGAELDADHPGFKDPVYRARRKQFADIAYNYRHGQPIPR VEYMEEEKKTWGTVFKTLKSL YKTHACYEYNHIFPLLEKYCGFHEDNIPQLEDVSQF LQTCTGFRLRPV AGLLSSRDFLGGLAFRVFHCTQYIRHGSKPMYTPEPDICHELLGHVP LFSDRSFAQFSQEIGLASLGAPDEYIEKLATIYWFTVEFGLCKQGDSIKAYGAGLLSSFG ELQYCLSEKPKLLPLELEKTAIQNYTVTEFQPL YYV AESFNDAKEKVRNFAA TIPRPFS VRYDPYTQRIEVLDNTQQLKILADSINSEIGILCSALQKIK

回答问题：

H、此序列包含了哪种序列指纹？

I、此序列指纹包含了几个motif?

二、利用网上或下载的ClustalX/W进行多序列比对，并对结果进行编辑与分析。

1、多序列比对。

1）利用BLAST进行比对序列的收集。（当然，你也可以利用SRS系统进行某家族序列的收集，并通过SRS整合的clustalW进行多序列比对。）在你的多序列比对中，可能希望包含两种类型的序列：已经过鉴定的具有良好注释及实验信息的序列，以及你感兴趣的未鉴定的序列（但必须属于此序列家族）。将后者加入多序列比对的主要目的是确定序列中不会发生突变的保守位点，同时确定重要性相对小一些的那些区域。

进入ExPASy的BLAST server (https://www.360docs.net/doc/cf11270567.html,/tools/blast/),在检索框内输入P20472（如果在检索框内输入的是蛋白质序列，使用blastp程序，如果输入的是CDS序列，则选择tblastn程序）, 从options选项中的Number of best scoring sequences to sho w以及Number of best alignments to show的下拉菜单中选择1000。点击RUN BLAST。

2）从结果中选择少于10条序列进行第一次的多序列比对。注意选择的序列要在具有良好的E值（10-40）与不太好的E值（10-5）之间平均分配，同时查看具体的alignment 以确定选择的目标序列与查询序列（P20472）之间具有全序列范围内的相似性。在选择的序列前打勾，如P20472，P80079，P02626，P02619，P43305，P32930，P91482，P02620，P02622。在Send selected sequences to项目的下拉菜单中选择合适的序列输出选项，如clustalW是将序列发送到EMBnet的ClustalW服务器上，点击提交查询内容，则将所选序列装填入ClustalW服务器的检索框内，利用默认参数，点击RUN ClustalW，则可以得到以不同格式保存的多序列比对结果以及.dnd格式的向导树（guide tree）或称dendogram，它并不是真正的系统进化树。

T-coffee也是一个多序列比对工具，采用的是与ClustalW相类似的渐进式比对算法，它产生的比对结果准确度要比ClustalW高，但运行速度要比ClustalW慢。利用默认参数，我们可以看到T-coffee产生的结果不仅包含了各种格式的多序列比对情况以及向导树，还有用颜色标记比对质量的html文件及相应的PDF文件。在这些文件中，红色表示高质量的片段，而兰色则表明比对的区域不可信。

3）将上步所选的序列以FASTA格式进行保存，并将多序列比对结果中的aln格式结果及.dnd文件进行保存。

4）接入EBI的clustalW服务器（https://www.360docs.net/doc/cf11270567.html,/clustalw/index.html），将

另一个蛋白质P19132的FASTA格式加入到刚才下载的FASTA格式序列文件中。如果查看刚才利用P20472序列进行对库搜索的结果中，这个蛋白的E值为4.4！而且其与查询序列的同一性仅为在33个连续残基中的39%，因此进化关系上与P20472很远。将这些序列进行多序列比对分析，必要时进行相关参数的设置。在Phylogenetic tree选项中的tree type选择phylip或dist，使用帮助参见课程相关内容-实验数据-实验六中的EBI Help-clustalW.html，将比对结果进行保存，并与前一步骤得到的结果进行比较。

5）解包课程相关内容-实验数据-实验六-clustalX1.83，打开ClustalX黄色图标，装入上述FASTA格式文件（file菜单中的load sequences），进行比对、构建向导树（alignment菜单中的前两项）。并利用邻位相连算法构建进化树（tree菜单中的Draw D-J tree）。利用njplotWIN95.exe查看3、5步骤所分别形成的向导树及进化树，并将步骤4与步骤5形成的进化树进行比较。

2、多序列比对结果的分析。

在多序列比对结果中，我们希望发现一些很好的无空位插入的比对区块（blocks），这些区块对应了蛋白质结构中的核心区域，而那些富含空位的区域可能对应着相对进化较快的loop区域。那么，如何判断区块的好坏呢？

在ClustalW/X及T-coffee的比对结果中，我们可以发现最后一行包含了三种符号：（*），（：），（.）。* indicates a entirely conserved column, : indicates columns where all the residues have roughly the same size and the same hydropathy, .

indicates columns where the size or the hydropathy has been preserved in the course of evolution。一个好的区块在10-30个氨基酸残基中至少表现出1-3个星号（*），5-7个冒号（：）以及一些(.)。

如果多序列比对显示在大约50个氨基酸残基中有4-5个保守的位点，那么我们就可以相信它是一个真实的信号。而这时的序列同一性还不到10%！而利用双序列比对时我们至少需要25%的序列同一性才能确信比对有意义。因此，多序列比对要比双序列比对灵敏得多。

另一个评价多序列比对的标准是了解保守残基的类型。下表给出了多序列比对中可能遇到的保守列的一般特性。

Table. Patterns of Conservation in Multiple sequences alignments

Amino Acid Characteristic

W,Y,F It is common to find conserved tryptophans. Tryptophan is a large hydrophobic residue that sits deep in the core of proteins. It plays an

important role in their stability and it therefore difficult to mutate. When

tryptophan mutates, it is usually replaced by another aromatic amino acid,

such as phenylalanine or tyrosine. Patterns of conserved aromatic amino

acids constitute the most common signatures for recognizing protein

domains.

G, P It is common to find conserved columns with a glycine or a praline in a multiple alignment. These two amino acids often coincide with the

extremities of well-structured beta strands or alpha helices.

C Cysteines are famous for making C-C (disulphide) bridges. Conserved

columns of cysteines are rather common and usually indicate such bridges.

Columns of conserved cysteines with a specific distance provide a useful

signature fro recognizing protein domains and folds.

H, S Histidine and serine are often involved catalytic sites, especially those of proteases. Conserved histidine or a conserved serine are good candidates

for being part of an active site.

K, R, D, E These charged amino acids are often involved in ligand binding. Highly conserved columns can also indicate a salt bridge inside the core of the

protein.

L Leucines are rarely very conserved unless they’re involved in protein-protein interactions such as a leucine zipper.

3、学习课程相关内容-实验数据-实验六中的进化树使用综述一文。

4、安装课程相关内容-实验数据-实验六中的BioEdit 软件，这是一个免费软件，非常

适合序列比对、编辑和分析。集成了多种序列分析程序，如对DNA序列的翻译，得到互补链、酶切图谱分析、质粒图制作等。有关蛋白质分析的程序很多，可以获得

一些基本的参数，进行亲疏水性分析等。程序里集成了BLAST和ClustalW。提供了很多通过著名序列分析程序的网络接口。

利用中文及英文说明熟悉BioEdit的界面，并进行多序列比对的手工编辑。

三、利用MEGA3练习系统发育树的构建。

从https://www.360docs.net/doc/cf11270567.html,/mega.html MEGA3处下载并安装MEGA3软件，或直接从课程相关内容-实验数据-实验六中的MEGA3SETUP中安装。参考教材P64-P73的内容及软件自带的HELP文件学习利用不同的算法构建系统进化树并进行进化树的可信度评估。