分子生物学研究技术

:分子生物学研究技术

文库

文库，代表了生物体某一器官或组织中所有的或绝大部分的遗传信息。其构建过程总共有个步骤（项技术）：、总的提取；、的纯化；、的合成；、文库构建；、基因文库筛选。

详细：

、总的提取：目前常用的提取方法是异硫氰酸胍苯酚提取法（提取法），提取步骤：（）首先用液氮研磨材料成匀浆，加入试剂，进一步破碎并溶解细胞；（）加入氯仿抽提，离心，收集含有的水相；（）用异丙醇沉淀，初步纯化，获得样品用于下一步的纯化；（：实验中还常将含有的细胞破碎物液通过硅胶膜纯化柱后，再通过低盐浓度下从硅胶膜上直接洗脱，获得纯度较高的总）；

总的浓度、纯度测定：通过分光光度计测其和值，为时相当于总量为μ；而的比值如果在之间，则表示所提取的纯度较好。

、的纯化：纯化原理，将真核细胞的分子具有‘端帽子（）和’端（）尾巴的特征结构，作为提取时的选择性标记。纯化提取方法：常用寡纤维素柱层析法获，该方法利用‘末端的（）尾巴的特点，当流经寡纤维柱时，在高盐缓冲液的作用下，或特异性结合到柱子上，之后再用低盐溶液洗脱，经过两次层析后可获得较高纯度的。

、的合成：利用技术，常以（）为引物，甲基化的（保证新合成的链被甲基化，防止构架克隆时被限制性内切酶切割）。合成基本过程：以为模板链，在逆转录酶的催化下以甲基化为原料合成第一条链；之后再以第一条链为模板，在聚合酶催化下合成第二条（常用切割杂链中的序列所产生的小片段为引物合成的第二条片段，再同过连接酶的作用连接成完整的链。（：最后，两端应加上不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得的具有方向性）、文库的构建：由于的长度一般为，所以常用质粒载体和噬菌体类的载体便能用于承载。基本过程：将合成的连接到特定的载体上，然后将载体转入宿主细胞（一般为大肠杆菌），然后筛选阳性克隆，最终获得文库。

：一般而言，文库的载体选择要根据文库的用途来确定，例如载体是一种噬菌粒载体，具备噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝白斑筛选的便利，可容纳片段插入。

、基因文库筛选：是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需要的重组分子的特定克隆的过程。目前主要的筛选方法有：核酸杂交法、筛选法和免疫筛选法。

核酸杂交法（最常用的筛选方法之一）：（）将圆形硝酸纤维素膜放在含有琼脂培养基的培养皿表面，将待筛选的菌落从其生长的平板上转移到硝酸纤维素膜上，后进行适当的温育（同时保留原菌板作为对照。）（）取出已长有菌落的硝酸纤维素膜，用碱液处理，裂解细菌并使变性；（）接着用蛋白酶处理硝酸纤维素膜上的蛋白质，形成菌落印迹；（）℃烘烤滤膜，将固定在膜上；（）将滤膜与放射性同位素标记的或探针杂交，通过放射自显影显示杂交结果。（射线底片上显黑色斑点的就是试验中寻找的目的克隆）（）通过比对显影的结果，可在对应的原菌板上获得相对应的克隆。

筛选法：使用前提，已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。基本过程：（）将整个文库（以质粒或菌落的形式均可）保存到多孔培养板上；（）用设计好的目的基因探针对每个样孔进行筛选，鉴定出阳性孔；（）把每个阳性孔中的克隆在稀释到次级多孔板中进行筛选。重复以上程序，直到鉴定出于目的基因对应的单个克隆为止。

免疫筛选法：基本步骤与核酸杂交检测类似，主要过程：先将菌落或噬菌斑影印到硝酸纤维

素膜上，再原位溶解菌落释放抗原蛋白，后用抗体与固定了抗原的膜杂交，抗原抗体结合后，再用标记好的二抗与之反应，最后通过对标记物的检测便可找到阳性克隆。

基因组文库的构建

基因组文库：是指把某种生物的基因组切成适当大小，分别与载体结合后导入微生物细胞，所形成的所有序列的克隆汇总。

应用：、分离特定的基因片段；、分析特定的基因结构；、研究基因表达调控；、构建全基因组物理图谱和全基因组序列测定。

主要过程：

、提取样品，将所提取的制备成大小适合的随机片段

、体外将这些片段与适当的载体连接成重组子

、将重组子转化到大肠杆菌或其他受体细胞

、从转化克隆群中筛选出含有靶基因的阳性克隆。

基因组文库的基本要求：必须具有一定的代表性和随机性，以保证能从文库中筛选到某个特定基因。

提高基因组文库代表性的策略：、用机械切割法或限制性内切核酸酶切割法随机断裂，保证克隆的随机性；、增加文库重组克隆的数目，以提高覆盖基因组的倍数。

实例：一般常用限制性内切酶部分消化法和?噬菌体载体来构建基因文库，具体：

①提取真核基因组，用可识别个核苷酸的限制性内切核酸酶部分消化基因组，②消化的产物经过琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心，收集范围的片段；④同时用消化噬菌体载体（和是同尾酶，前者产生的片段可插入后者切割的缺口）；⑤用连接酶将载体与片段相连接，形成重组子；⑥体外包装后用重组噬菌体侵染大肠杆菌受体细胞；产生噬菌斑，组成包含该真核生物基因组绝大部分序列的文库。

酵母杂交系统

、酵母单杂交系统：

原理：将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（，）的上游，把报告基因连接到下游；然后将编码待测转录因子与已知酵母转录激活域（）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活启动子使报告基因表达。

作用：（）用于确定某个分子与某个蛋白质分子之间是否存在相互作用；（）用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他位点的功能蛋白编码基因；（）验证反式转录调控因子的结合域；（）准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。

、酵母双杂交系统：

原理：利用酵母细胞转录调控因子具有组件式结构的特征，即该种蛋白由两种相互独立的结构域组成（结合结构域；转录激活结构域），转录因子要发挥功能需要两种蛋白相连接。

实验基本过程：首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的序列连接到带有酵母转录调控因子编码区的表达载体上；然后，导入酵母细胞中使之表达带有结合域的杂合蛋白，与报告基因上游的启动调控区域结合作为“诱饵”来捕获与已知蛋白相互作用的基因产物；再然后，将已知的编码的分别与带筛选的文库中不同插入片段相连接，获得“猎物”载体去转化含有“诱饵”的酵母细胞；一旦，酵母细胞中表达的“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，不同转录调控因子的和就会被牵引靠拢，进而激活报告基因的表达。

蛋白质相互作用技术