厌氧微生物菌种保藏技术规程[1] 2
厌氧微生物菌种保藏技术规程
引言
厌氧微生物是一类需要在无分子氧或低氧化还原电势的条件下才能正常生长繁殖的微生物，在自然界中分布广泛，种类繁多。有些厌氧微生物具有临床致病性，有些却能在维持人畜肠道正常的微生态、清洁能源开发、环境治理、石油开采等方面发挥重要的作用，作为一类重要的特殊微生物资源日益引起重视。由于厌氧微生物的生理特殊性，其培养和保藏技术的关键是要使该类微生物处于无氧或氧化还原势低的环境中。对厌氧微生物菌种资源进行长期有效的保藏是这类资源实施有效共享的前提，采用操作简便、保藏周期长、遗传变异率低的保藏方法是首要选择。
制定本规程是为了规范厌氧微生物菌种资源保藏技术操作，加强厌氧微生物资源的安全与质量管理，以达到保护、利用和实现资源共享的目的。
厌氧微生物菌种保藏技术规程
1范围
本规程规定了厌氧微生物菌种保藏技术基本原则、技术要求、方法及步骤。
本规程适用于各类厌氧微生物菌种的保藏。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB 19489 实验室生物安全通用要求
科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件微生物菌种常规保藏技术规程（试行）
3术语和定义
下列术语和定义适用于本规程。
3.1厌氧微生物Anaerobes
厌氧微生物是一类需要在无分子氧或低氧化还原电势的条件下才能正常生长繁殖的微生物。
3.2菌种保藏culture preservation
是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。
3.3定期移植保藏法subculturing
亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4℃－6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
3.4冷冻干燥freeze-drying
将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
3.5液氮超低温保藏preservation in liquid nitrogen
液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮，或在-150℃的液氮气相中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物处在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。
3.6-80℃低温冷冻保藏preservation at -80℃
将菌种保藏在-80℃冰箱中以减缓细胞生理活动进行冷冻的一种保藏方法。
3.7液体干燥保藏liquid-drying
无需将微生物冷冻，直接在常温状态下，通过减压利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态的一种保藏方法，适合于对低温冷冻敏感的厌氧微生物资源的保藏。
4保藏方法
4.1定期移植法
参见附录A
4.2真空冷冻干燥法
参见附录B
4.3液氮超低温冻结法
参见附录C
4.4-20℃～-80℃低温冷冻保藏法
参见附录D
4.5液体干燥保藏法
参见附录E
附录1 定期移植法
1原理
低温条件下保藏可减缓微生物菌种的代谢活动，抑制其繁殖速度，达到减少菌株突变、延长菌种保藏时间的目的。
2技术要求
2.1.1不同菌种应根据要求选择合适的培养基。容器应当选择带异丁胶塞的厌氧试管或血清瓶。
2.1.2接种时应采用亨盖特厌氧技术或在厌氧操作箱内进行，要求做到厌氧、无菌操作。
2.1.3保藏期间要定期检查菌种存放的房间、冷库、冰箱等的温度、湿度，厌氧试管胶塞有无漏气现象，如发现异常应取出该管，重新移植培养后补上空缺。
2.1.4大量菌种同时移植时，各菌株的编号、所用培养基要进行核对，避免发生错误。
2.1.5每次移植培养后，应与原保藏菌株和菌株的登记卡片逐个对照，检查无误后再存放。
2.1.6斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。
3方法与步骤
3.1培养基制备
3.1.1血清瓶与厌氧管的准备
清洗血清瓶与厌氧管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后贴上标签，标上菌号及时间，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
3.1.2溶解培养基配料
先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素等材料加入水中溶解，最后加足水量。
3.1.3调pH值
配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸或稀碱调节pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
3.1.4加凝固剂
配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
3.1.5加厌氧指示剂
在保藏严格厌氧菌，如产甲烷菌种时，须在培养基中加入指示剂刃天青（Resazurin），每升培养基加0.2%刃天青1ml，刃天青在氧化态时为紫色或粉红色，在还原态时为无色。在培养基中通入无氧氮气并煮沸，当培养基没有刃天青紫色时，表明培养基中无氧。
3.1.6煮沸和分装
培养基煮沸按亨盖特（Hungate）厌氧技术进行，培养基的分装既可以在厌氧操作箱中进行，也可按Hungate厌氧技术进行操作。培养基配制好后，在培养基中通入无氧氮气并煮沸，然后在无氧气体封闭条件下再煮沸5-10 min，停止加热后加入0.02～0.05%的半胱氨酸盐酸作为还原剂，培养基则退至无色，冷却到50℃以下，在无氧氮气的保护下进行厌氧分装并迅速加盖异丁基胶塞，培养基冷却后如未变红，则说明厌氧操作无误。
3.1.7包扎标记
将血清瓶或厌氧试管塞好胶塞后，加上铝封或者盖好螺口盖，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
3.1.8灭菌
根据要求将培养基灭菌。灭菌后摆放斜面时，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
3.1.9无菌检查
将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，同时检出因漏气而变红的培养基。
3.2接种
3.2.1斜面接种
3.2.1.1中央划线
在厌氧和无菌条件下，从斜面中部自下而上划一直线。
3.2.1.2稀波状蜿蜒划线法
在厌氧和无菌条件下，从斜面底部自下而上划“之”字形线。
3.2.1.3密波状蜿蜒划线法
在厌氧和无菌条件下，从斜面底部自下而上划稠密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞。
3.2.2穿刺接种
在厌氧和无菌条件下，用直接种针从原菌种斜面上挑取少量菌苔，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。
3.2.3固体滚管接种
利用Hungate厌氧操作技术，将原种稀释液接入厌氧管固体培养基中，趁热在滚管机上迅速滚动，使固体培养基均匀凝固在厌氧试管壁上，培养至长出单菌落。
3.2.4液体接种
在厌氧和无菌条件下，挑取少量固体斜面菌种或用无菌无氧注射器等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。
3.2.5接种物是否处于厌氧状态的检查
接种后，如果培养基没有红色或紫色出现，说明培养基中没有氧气进入，可继续下步操作。如果培养基变为红色或紫色，说明培养基中有氧气进入，应检查厌氧装置后再行接种。
3.3培养
在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行））。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜。
3.4保藏温度和时间
培养好的菌种于4℃－6℃保存，按要求每3－6个月移植一次。对于某些菌种，须1－3个月移植一次。
3.5移植培养
在无氧无菌操作条件下，将培养物转接到另一新鲜培养基中，再在适宜条件下培养。
附录2 真空冷冻干燥保藏技术
1冷冻干燥管的制备
安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下加压灭菌15-20分钟，备用。
2保护剂的选择和准备
保护剂种类要根据微生物类别选择,通常使用去纤维羊血、20%的脱脂乳、含7.5%葡萄糖血清等。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶为成品的脱脂牛奶，或普通牛奶先脱脂，用离心方法去除上层油脂，湿热灭菌，一般为115℃，15分钟。保护剂使用前应在通入无氧无菌N2流的情况下在100℃沸水中煮沸15分钟左右，然后后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。
3冻干样品的准备
在最适宜的培养条件下将待保藏的厌氧细菌培养至静止期或成熟期，无氧条件下与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜。采用较长的毛细滴管，滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。
分装时应注意在无菌与厌氧（厌氧操作箱）条件下操作。
4预冻
预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1℃。一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。
5冷冻干燥
将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。终止干燥时间应根据下列情况判断：
——安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；
——真空度接近空载时的最高值；
——样品温度与管外温度接近；
——选用1-2支对照管，内装蒸馏水，其水份装量与菌悬液同量，当水分完全升华后，可视为干燥完结；
——选用一个安瓿管，装1-2%氯化钴，如变深兰色，可视为干燥完结。
冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。
6真空封口及真空检验
将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。
7保藏
安瓿管应低温避光保藏，保藏温度一般为4－8℃。
8质量检查
冷冻干燥后抽取1－2支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。
9保藏周期
不同微生物复苏周期不同，一般10年左右。
10复苏方法
——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，
——将安瓿管顶部烧热，
——用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，
——用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。
操作过程应在在厌氧工作箱中完成。
附录3 液氮超低温保藏技术
1安瓿管或冻存管的准备
用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净，121℃下加压灭菌15-20分钟，备用。
2保护剂的准备
保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采用10-20%甘油。
3微生物保藏物的准备
微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。分装时注意应在厌氧无菌条件下操作。菌种的准备可采用下列几种方法：
刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；
接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；
在小安瓿管中装1.2-2.0毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。
以上操作均要在厌氧操作箱中完成。
4预冻
预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1℃为好、使样品冻结到-35℃。目前常用的有三种控温方法：
——程序控温降温法：应用电子计算机程序控制降温装置，可以稳定连续降温，能很好地控制降温速率；
——分段降温法：将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却，或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温，将安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小时，然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5℃；
——对耐低温的微生物可以直接放入气相或液相氮中。
5保藏
将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150℃，液相中温度为-196℃。
6保藏周期
一般10年以上。
7复苏方法
从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。应当在厌氧操作箱中进行。
8适用范围
各类厌氧微生物。
9液氮保藏应注意事项
——防止冻伤，操作注意安全，带面罩及防冻手套；
——塑料冻存管一定要拧紧螺帽；
——运送液氮时一定要用专用特制的容器，绝不可用密闭容器存放或运输液氮，切勿使用保温瓶存放液氮；
——注意存放液氮容器的室内通风，防止过量氮气使人窒息；
——防止安瓿管或塑料冻存管破裂爆炸，如液氮渗入管内，当从液氮容器取出时，液态氮体积膨胀约680倍，爆炸力很大，应特别小心；
——注意观察液氮容器中液氮的残存量，定期补充液氮。
附录4 -20℃～-80℃低温冷冻保藏
1安瓿管或冻存管的准备
参见B1
2保护剂的准备
参见B2
3微生物保藏物的准备
参见B3
4冻结保藏
将安瓿管或塑料冻存管置于-20℃～-80℃冰箱中保藏。
5保藏周期
一般1-5年。
6复苏方法
从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。以上操作应在厌氧操作箱中进行。
附录5 液体干燥保藏技术
1液体干燥管的制备
安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
2保护剂的选择和准备
保护剂种类要根据微生物类别选择,通常使用去纤维羊血、20%的脱脂乳、含7.5%葡萄糖血清等。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂。保护剂使用前应在100℃沸水中煮沸15分钟左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。
3液体干燥样品的准备
在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。
分装时应注意在无菌与厌氧（厌氧操作箱）条件下操作。
4预热
液体干燥样品置于水浴中20mins左右，使温度达到20℃到25℃左右。
5液体干燥
利用厌氧液体干燥机进行干燥。在操作过程中，对于严格厌氧微生物来说，要求始终保持厌氧状态。
将预热样品安瓿管置于厌氧干燥箱内，置于20℃水浴中，5mbar下干燥30mins。接着在0.1到0.05mbar下干燥1－2hrs。
终止干燥时间应根据下列情况判断：
——安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；
——真空度接近空载时的最高值；
——样品温度与管外温度接近；
——选用1-2支对照管，内装蒸馏水，其水份装量与菌悬液同量，当水分完全升华后，视为干燥完结；
——选用一个安瓿管，装1-2%氯化钴，如变深兰色，可视为干燥完结。
安培管干燥完毕后，取出样品安瓿管置于放好硅胶和棉花的软玻璃套管中，在0.1到0.05mbar条件下下继续干燥2－3hrs，然后准备真空封口。
6真空封口及真空检验
将装有安培管的玻璃套管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。
熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。
7保藏
安瓿管应置于4－10℃避光保藏。
8质量检查
冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。
9保藏周期
不同微生物复苏周期不同，一般3年左右。
10复苏方法
——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部；
——将安瓿管顶部烧热；
——用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端；
——用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。
操作过程应在在厌氧操作箱中完成。