第五章 核酸的分离纯化

第五章核酸的分离纯化

核酸分离纯化的原则:

保持核酸一级结构的完整性

尽可能提高核酸制品的纯度

DNA与RNA在分子大小、理化性质等方面不同分离方法存在差异。

DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象

DNA和RNA的分离与纯化技术是分子生物学研究中重要的基本技术。

核蛋白：核酸+蛋白质

DNP：DNA+蛋白质

RNP：RNA+蛋白质

第一节核酸分离纯化的设计及原则

（一）材料与方法的选择

不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、

产量及浓度有不同的要求。

?需考虑制备核酸所需的时间与成本

?应选择安全的试剂与制备方案

（二）选择原则

1.保持核酸碱基序列的完整性

2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度

3.保持核酸的完整性

尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间

尽量避免各种有害因素对核酸的破坏

二、技术路线的设计

（一）核酸的释放

DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。

（二）核酸的分离与纯化

应该清除的杂质主要包括:

1.非核酸的大分子污染物

蛋白质、多糖及脂类物质等

2.非需要的核酸分子

分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质

3.加入的有机溶剂和某些金属离子

（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤

沉淀是浓缩核酸最常用的方法

常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁

常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇

核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除

三、核酸的鉴定与保存

（一）核酸的鉴定

1.浓度鉴定

（1）紫外分光光度法：

核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。

DNA或RNA的定量

OD260=1.0相当于：

50μg/ml双链DNA

40μg/ml单链DNA（或RNA）

33μg/ml寡核苷酸

适用于>0.25μg/ml的核酸溶液

（2）荧光光度法：

A:溴化乙锭（EB)

核酸的荧光染料溴化乙锭（EB)嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV 激发下发出红色荧光。凝胶电泳中荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。该法灵敏度可达1ng～5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。

注：溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。使用时必须戴手套操作。

B、Sber Green I

与dsDNA亲和力较高，结合后荧光强度大大增强，特别适用于对溶液dsDNA 的检测、分析。特点为：

灵敏度高，至少可检出20pg dsDNA分子。高于EB 25~100倍。

受ssDNA、RNA及其他物质的影响小。

对Taq酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶没有抑制作用。

C、GoldView(GV)

GoldView(GV)作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于

20pg的双链DNA。

GoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5μl GoldView?即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。

通过Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验，致突变性结果均为阴性。

通过凝胶电泳回收DNA片段时，建议使用GoldView染色，在自然光下切割DNA条带，避免紫外线与EB对目的DNA产生的损伤，可明显提高克隆、转化、转录等分子生物学下游操作的效率。

虽然未发现GoldView有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。

2.纯度鉴定

（1）紫外分光光度法：

主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质等的污染。比值升高或降低均提示制备的核酸纯度不佳。

判断核酸样品的纯度

DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8

RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0（1.8~2.1）

当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280，计算其比值来衡量样品的纯度。

经验值：

纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用其他方法进行估算。

另外，鉴定RNA纯度所用溶液的pH值会影响A260/A280的读数。如RNA在

水溶液中的A260/A280比值就比其在Tris缓冲液（pH 7.5）中的读数低0.2～0.3。荧光光度法：

EB等荧光染料示踪的核酸电泳可判定核酸制品的纯度。

3.完整性鉴定

琼脂糖凝胶电泳：

以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性

基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状

完整的或降解很少的总RNA电泳图谱

中，三条带荧光强度应呈特定的比值。

?沉降系数大，电泳迁移率低，

荧光强度高

?沉降系数小，电泳迁移率高，

荧光强度低

?28S（或23S）RNA的荧光强度

一般约为18S（或16S）RNA

的2倍，否则提示有RNA的降解

?若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染

（二）核酸的保存

1.DNA的保存

溶于TE缓冲液中的DNA在-70℃冰箱可保存数年。

TE的pH值为8.0时，可减少DNA的脱氨反应；

低于7.0时DNA容易降解。

EDTA：螯合Mg2+、Ca2+等可抑制DNA酶的活性；

低温保存：-4 ℃；-20 ℃；-70 ℃

加少量氯仿：有效避免细菌与核酸的污染。

2.RNA的保存

RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃保存

RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延长保存时间

用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理

第二节真核基因组DNA的分离纯化哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线

生物体组织细胞

玻棒缠绕法

酚抽提法

基因组DNA粗品

PFGE分离

特定的DNA片段

AGE分离PAGE分离

乙醇沉淀洗涤

基因组DNA纯品

精分离

粗分离

前处理

离子交换层析纯化

有机溶剂抽提

细胞裂解蛋白质变性沉

淀降解DNA释放

甲酰胺解聚法

哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线

第二节真核基因组DNA的分离纯化

PFGE:脉冲场凝胶电泳法

一、酚抽提法

1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法

以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞

经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提，获得DNA粗制品

细胞裂解液

20ml细胞裂解液[20mmol/L EDTA ,100 mmol/L Tris,pH8.0, 0.8%(W/V)SDS] 给出的摩尔浓度都是终浓度，W/V为质量体积比，知道了所要配制液体的体

积，就可以根据它给出的浓度算出所需要的摩尔数以及其质量，比如说要配制20ml的裂解液，所需每种成分的质量如下：

EDTA: 0.02L×0.02mol/L×372.5g/mol=0.149g

Tris: 0.02L×0.1mol/L×121.1g/mol=0.2422g

SDS: 20×0.8/100=0.16g

将0.2422gTris溶于蒸馏水中，调节其PH值为8.0，然后加入0.149gEDTA和0.16gSDS，即为所要的裂解液

苯酚/氯仿提取DNA

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA 的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。

当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。

酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/10 3mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA 沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

Tris

中文品名: 三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇; 缓血酸胺

英文品名: Tris; Tris(Hydroxymethyl)aminomethane

英文别名: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol

SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS 能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须

把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。例：培养细胞DNA提取

1 .贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2，细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。

3，重复2。

4，加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。

5，加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀，50℃水浴30min, 6，用等体积的酚抽提一次，2500r/min 离心收集水相，

用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min 离心收集水相。

用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。

7，加入等体积的5mol/L 的LiCL,混匀，冰浴，10min.

8， 2500r/min,离心10min. 转上清与一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10分钟。

9， 2500r/min,离心10min。弃上清。加入0.1倍体积3mol/L 乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20分钟。

10， 12000r/min, 室温离心5分钟。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA 周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。

因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的

沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。

一般在室温下放置15－30分钟即可。

为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。

磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定

提取产量：

运用该法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于10μg至大到数百μg的DNA样品。由于分离纯化的每一步都有剪切力的影响，最后得到的DNA样品中分子量超过100kb～150kb的很少，但这种大小的DNA 足以作为PCR反应的模板和进行Southern blotting分析以及构建以λ噬菌体为载体的基因组DNA文库。从5×107个培养的非整倍体哺乳动物细胞（如HeLa细胞）大约可以制备分子量在100kb～150kb的DNA 200μg，自20ml血液可得250μg。

二、甲酰胺解聚法

1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提。

而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与DNA的复合物，还可使释放的蛋白质变性。但甲酰胺对蛋白酶K的活性无显著影响。本法因操作步骤少，尤其省却了酚的多次提取，所得DNA分子量一般可以大于200kb。

中文名称：甲酰胺；氨基甲醛

英文名称：Formamide；formic acid amide。

分子式：HCONH2；CH3NO

分子量：45.041

甲酰胺是甲酸衍生出的酰胺.

基本性质：

沸点：210℃（180°C开始部分分解成一氧化碳和氨气）

熔点：2-3℃

闪点：154°C

比重：1.1334(20°C)。

折射率：1.4468

溶解情况：能与水和乙醇混溶，微溶于苯、三氯甲烷和醚。

性状与味道：无色透明油状液体，略有氨味。

其他：本品具有吸湿性。

生产方法：

方法1：

第一步由一氧化碳与甲醇在甲醇钠作用下生成甲酸甲酯。第二步甲酸甲酯再氨解生成甲酰胺，反应条件为80-100℃和0.2-0.6MPa。此法问题较少。

方法2：

甲酸与甲醇先进行酯化反应生成甲酸甲酯，然后经氨解生成甲酰胺，再进行精馏分离出甲醇和杂质后即得成品。此法由于成本高已趋向淘汰。

方法3：

由一氧化碳与氨在甲醇钠催化作用下，经高压（10-30MPa）和80-100℃温度直接合成甲酰胺

方法4：

甲酸和尿素法。

三、玻棒缠绕法

玻棒缠绕法是在Bowtell(1987)方法的基础上经改进而来

四、其它方法

有些分子诊断技术并不需要高分子量的DNA样品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法广泛使用。

1.异丙醇沉淀法

2.玻璃珠吸附法

五、DNA片段的纯化

常用的纯化方法：

有机溶剂抽提法

柱层析法（column chromatography）

纯化的方法包括透析、层析、电泳及选择性沉淀等。其中电泳法简单、快速、易于操作、分辨率高、灵敏度好、易于观察及便于回收，在DNA的进一步纯化中占有重要的地位。

由于聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）与琼脂糖凝胶（agarose gel）可以制成各种形状、大小和孔径不一的支持体，并可以在多种装置中进行电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）与琼脂糖凝胶电泳（AGE）广泛用于核酸的分离、纯化与鉴定。

六、DNA片段的回收

目前，琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶是最常使用的电泳支持体，电泳分离的DNA处于凝胶的三维网状结构中。

原则与要求:

1.提高片段的回收率

2.清除回收的DNA样品中的杂质

回收的DNA样品往往因支持介质的不纯、回收溶液的使用及不慎操作等因素而引入污染，这些污染可能严重影响后继的实验。根据实验要求，应对回收的DNA样品进行纯化，以除去污染物。常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法。其中柱层析法采用阴离子交换层析的原理，主要是利用带负电荷的DNA在低离子强度的缓冲液中与阴离子交换树脂结合，洗去杂质，然后再用高离子强度的缓冲液洗脱下来。上述两种纯化方法以及其它回收DNA片段的方法，最终均要在有盐的情况下进行乙醇沉淀，并以70%的乙醇除去有机分子与共沉淀的盐。

（一）从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法

DEAE纤维素是一种阴离子交换纤维素，可以结合带负电荷的DNA分子。将DEAE纤维素膜插入到经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸条带前，继续电泳直至所需回收的DNA片段刚好转移到膜上。取出DEAE纤维素膜，低盐条件下洗去杂质，高盐条件下洗出DNA分子。该法操作比较简单，可同时回收多个DNA 片段，对500bp～5kb的DNA片段回收率好，纯度高，能满足大多数实验的要求。但DNA片段大于5kb时，因结合力增大而回收率下降。至10kb或为单链DNA时，其与膜的结合变得很牢固而难以回收。因此，本法不适合于分子量大于10kb的DNA片段的回收，也不能回收单链DNA。

2．电泳洗脱法

电泳洗脱法包括两个主要步骤，一是将待回收的DNA片段电泳出凝胶介质，使其进入一个便于回收的小容积溶液中；二是分离纯化出DNA片段。按是否使用透析袋可分为透析袋电泳洗脱法与非透析袋电泳洗脱法两大类。其中，透析袋电泳洗脱法需要切下含待回收DNA片段的凝胶条，然后放入透析袋内进行电泳，使DNA分子迁移出凝胶条进入透析袋的溶液中，最后经抽提纯化回收DNA分子。该法操作很不方便而且不适合于同时回收大量不同的DNA片段，但可有效回收从200bp至大于50kb的DNA，尤其对大于5kb的DNA有良好的回收率。

3、低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法该法是从低熔点琼脂糖凝胶中切出含待回收DNA的凝胶块，利用其纯度高、熔点低（65℃）及凝固温度低（30℃）的

特点，在室温大于30℃，琼脂糖仍为液态的情况下，对DNA片段进行回收的方法。根据不同的提取纯化方案，又可分为有机试剂提取法、玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法和琼脂水解酶（agarase）法。有机试剂法以酚、氯仿抽提DNA，可以有效回收0.5kb～5kb的DNA片段。玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法是将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠（NaI）溶液或高氯酸钠溶液中，然后加入玻璃珠（或玻璃粉）以结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下来。玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法较有机试剂提取法快，但回收率略低。琼脂水解酶法对切下的含DNA的凝胶块进行消化，将琼脂糖水解为二糖，释放的DNA用酚抽提，乙醇沉淀回收。

4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法

目前，有许多能从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法与改良方案，但至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效去除凝胶中酶促反应抑制剂（如多糖类）。每种方法各有其特点，各有其适用范围，应根据不同的要求选择不同的方法并对某些步骤做出相应的调整。

（二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段

标准方法是压碎与浸泡法。费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。

它是将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。该法能很好回收小于1kb的单链或者双链DNA，且纯度很高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。依分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。如果将切下的聚丙烯酰胺凝胶块包埋于琼脂糖凝胶中，再进行DEAE纤维素膜插片法电泳或透析袋电泳洗脱，可以缩短双链DNA的回收时间。

基因组DNA分离纯化的方法学评价与质量保证

有关基因组DNA分离纯化的方法很多，每一种方法下又可衍生出许多具体的实验方案。对每一个具体的实验方案，大体上我们可以从方法的可行性与可靠性两个方面来加以考察。可行性方面包括方法是否简便、快速、安全及成本如何。

可靠性则包括了方法的稳定性、重复性、特异性、产出比、最大产量及最小样品用量等。另一方面，由于酚具有高度的腐蚀性，需要采取特别的安全防护措施。

第三节质粒DNA的提取与纯化

质粒DNA的提取与纯化的方法很多，经典的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。这些方法主要由细菌的培养（质粒DNA的扩增）、细菌的裂解（质粒DNA的释放）及质粒DNA的分离与纯化等三个步骤组成。按制备量的不同，质粒DNA提取与纯化的方法可分为质粒DNA的小量（1ml～2ml）制备、质粒DNA的中量（20ml～50ml）制备及质粒DNA的大量（500ml）制备。

一、碱裂解法

在强碱（pH12.0～12.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。

碱裂解法利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA 处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时（酸中和），质粒DNA 迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。当K+取代Na+时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。

细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物

当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋结构

在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中

二、煮沸裂解法

将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。

质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA, 然后回收上清液中的质粒DNA 质粒大量提取之煮沸裂解法

试验步骤：

1、将500ml 培养物的细菌沉淀物重悬于用冰预冷的10mlSTET【（0.1mol/L

NaCl 10mmol/L Tris·Cl（pH8.0）1mmol/L EDTA（pH 8.0）, 5% Triton X-100】中。将悬液移入50ml锥瓶中。

2、加入1ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,沉淀于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。

如溶液的pH值低于0.8溶菌酶不能有效地发挥作用。

3、用一个夹子把锥瓶放在酒精灯的明火上加热，直至液体恰好开始沸腾，

不停地摇晃锥瓶。

4、立即把瓶浸入装有沸水的大烧杯（2L）中，将瓶放在沸水中，时间恰为

40s。

5、将瓶浸入用冰预冷的水中５min，使之冷却。

6、将粘稠状内容物从瓶中转移到超离心管，于4℃以12 000rpm离心30min。

原有的细菌物生长得越密，应越难将粘稠状裂解物转移到离心管中。必要时，可用长刀片和剪刀将裂解物剪成大小适于操作的大团块，或抽入10ml注射器的针筒中使之部分剪切。从用氯霉素处理的细菌培养物中分离质粒ＤＮＡ时，一般不会出现这样的问题。如果细菌碎片没能形成紧密的团块，可以以12 000rpm再度离心20min，然后尽可能将上清转移到另一管内，弃去残存在管内的粘稠状液体。

7、将上清转移到另一管内，纯化质粒ＤＮＡ。

三、SDS裂解法

将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁

用SDS裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中

用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA

由于条件温和，SDS裂解法特别适用于大质粒DNA（>15kb）的提取。但由于部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。

四、其他方法

(一) 小量一步提取法

直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA

简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析

（二）牙签少量制备法

用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA

由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定

五、质粒DNA的纯化

１.CsCl-EB法

EB-CsCl密度梯度离心法

在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质

经离心平衡后得以分开。

蛋白质由于密度小而浮于液面（1.3 g/cm3～1.4g/cm3）

RNA密度大而沉于管底（2.0g/cm3）

各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间，处于中部1.7g/cm3左右

２.聚乙二醇沉淀法

３.柱层析法

第四节真核细胞RNA的分离纯化

模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。

DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。

试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT 的试剂不能DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。

配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。

此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。

一、RNA制备的条件与环境

RNA易被RNase水解，RNase除细胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中

RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase 的活性又可恢复

去除RNase的污染和抑制其活性是RNA制备成功与否的关键

在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活细胞内RNase的活性

选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）

使用蛋白酶K

使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠

二、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法

总RNA产量取决于标本的起始量，每mg组织大约能制备4～7μg总RNA，每106个细胞大约能制备4～10μg总RNA。

三、商品化试剂单相裂解法

是异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改进方案

以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相

变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来

保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备

目前，该法已成为实验室最常用的总RNA提取法，其产量及质量与酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法相当。

四、mRNA的分离纯化

除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3′末端带有长短不同的poly（A）尾巴

利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA

（一）oligo(dT)-纤维素柱层析法

oligo(dT)-纤维素柱层析法是mRNA制备的一个标准方法。它是以oligo(dT)-纤维素填充层析柱，加入待分离的总RNA样品，其中poly(A)+RNA在高盐条件下，通过碱基互补，与oligo(dT)-纤维素形成稳定的RNA-DNA杂交体，洗去未结合的其它RNA，然后在低盐缓冲液中洗脱并回收poly(A)+RNA。从哺乳动物细胞提取大量的非放射性RNA 时，oligo(dT)-纤维素柱层析法是首选方法，回收的poly(A)+RNA量可达总RNA的1%～10%。但该法分离速度慢，易阻塞，不适合同时对多个标本的处理，而且很难回收全部的poly(A)+RNA，故不适合对少量RNA样品的分离。

（二）oligo(dT)-纤维素液相结合离心法

为适应同时对多个标本进行处理的要求，应选用批量的层析法。oligo(dT)-纤维素液相结合离心法不经填柱，而是直接将oligo(dT)-纤维素加入到一系列的含

不同RNA样品的微量离心管中，通过离心收集吸附有poly(A)+RNA的oligo(dT)-纤维素，经漂洗后，用含70%的乙醇洗脱液将吸附的poly(A)+RNA从oligo(dT)-纤维素上洗脱并沉淀出来。该法可同时批量处理多个样品，而且能从少量的RNA 样品中分离出poly(A)+RNA。用本法分离poly(A)+RNA时，应选用等级较高的oligo(dT)-纤维素，如oligo(dT)18-30纤维素，而一般的柱层析填充的是oligo(dT)12-18纤维素。