《生化分离工程》思考题及答案

第一章绪论

1、何为生化分离技术？其主要研究那些内容？

生化分离技术是指从动植物组织培养液和微生物发酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方法和手段的总称。

2、生化分离的一般步骤包括哪些环节及技术？

一般说来，生化分离过程主要包括4个方面：①原料液的预处理和固液分离，常用加热、调PH、凝聚和絮凝等方法；②初步纯化(提取)，常用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作；③高度纯化(精制)，常选用色谱分离技术；④成品加工，有浓缩、结晶和干燥等技术。

3、生化分离工程有那些特点，及其重要性？

特点：1、目的产物在初始物料（发酵液）中的含量低；2、培养液是多组分的混合物，除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等；3、生化产物的稳定性低，易变质、易失活、易变性，对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感；4、对最终产品的质量要求高

重要性：生物技术产品一般存在于一个复杂的多相体系中。唯有经过分离和纯化等下游加工过程，才能制得符合使用要求的产品。因此产品的分离纯化是生物技术工业化的必需手段。在生物产品的开发研究中，分离过程的费用占全部研究费用的50％以上；在产品的成本构成中，分离与纯化部分占总成本的40～80％；精细、药用产品的比例更高达70～90％。显然开发新的分离和纯化工艺是提高经济效益或减少投资的重要途径。

4、生物技术下游工程与上游工程之间是否有联系？

它们之间有联系。①生物工程作为一个整体，上游工程和下游工程要相互配合，为了利于目的产物的分离与纯化，上游的工艺设计应尽量为下游的分离纯化创造条件，例如，对于发酵工程产品，在加工过程中如果采用液体培养基，不用酵母膏、玉米浆等有色物质为原料，会使下游加工工程更方便、经济；②通常生物技术上游工程与下游工程相耦合。发酵-分离耦合过程的优点是可以解除终产物的反馈抑制效应，同时简化产物提取过程，缩短生产周期，收到一举数得的效果。

5、为何生物技术领域中往往出现“丰产不丰收”的现象？

第二章预处理、过滤和细胞破碎

1、发酵液预处理的目的是什么？主要有那几种方法？

目的：改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速率；出去大部分可溶性杂质，并尽可能使产物转入便于以后处理的相中(多数是液相)，以便于固液分离及后提取工序的顺利进行。

方法：①加热法。升高温度可有效降低液体粘度，从而提高过滤速率，常用于粘度随温度变化较大的流体。控制适当温度和受热时间，能使蛋白质凝聚形成较大颗粒，进一步改善发酵液的过滤特性。使用加热法时必须注意加热温度必须控制在不影响目的产物活性的范围内，对于发酵液，温度过高或时间过长可能造成细胞溶解，胞内物质外溢，而增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化；

②调节悬浮液的pH值，pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH可以改善其过滤特性；③凝聚和絮凝；④使用惰性助滤剂。

2、何谓絮凝？何谓凝聚？何谓混凝？各自作用机理是什么？

3、常用的凝聚剂有哪些？常用的絮凝剂有哪些？

(1)凝聚作用:凝聚作用是指在某些投加的化学物质的作用下，胶体粒子脱稳并

使粒子聚集成1mm大小块状凝聚体的过程。这些物质称为凝聚剂。

凝聚剂的作用机理:凝聚剂的加入可使胶粒之间双电层电位下降或者使胶体表面水化层破坏或变薄，导致胶体颗粒间的排斥作用降低，吸引作用加强，破坏胶体系统的分散状态，导致颗粒凝聚。

工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型,无机盐类:AlCl3·6H2O、FeCl3·6H2O 、Al2(SO4)3·18H2O、K2SO4·Al2(SO4)3·24H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4，MgCO3等；金属氧化物类：氢氧化铝、氢氧化铁等；聚合无机盐类：聚合铝、聚合铁凝聚值：电解质凝聚能力可用凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmol/L）称为凝聚值。阳离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能力越强。

(2)絮凝作用:絮凝作用是利用带有许多活性官能团的高分子线状化合物（絮凝

剂）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小凝絮团的过程。

絮凝作用的机理：实现絮凝作用的关键在于长链状结构的多个活性官能团，包括带电荷的阴离子（如—COOH）或阳离子（如—NH2）基团以及不带电荷的非离子

型基团。它们通过静电引力、范德华力或氢键作用，强烈地吸附在胶粒表面。即架桥作用。

工业上使用的絮凝剂分类：①有机高分子絮凝剂:聚丙烯酰胺,聚丙烯酸类衍生物阴离子型絮凝剂;②无机高分子聚合物,如聚合铝盐、聚合铁盐等;③生物絮凝剂,主要有蛋白质、粘多糖、纤维素和核酸等.

(3)混凝:在实际应用中，絮凝剂与无机电解质凝聚剂经常搭配在一起使用，加入

无机电解质使悬浮粒子间的排斥能力降低而凝聚成微粒，然后加入絮凝剂，两者相辅相成，二者结合的方法称为混凝。混凝可有效提高凝聚和絮凝效果。

4、何为惰性助滤剂？其使用方法有哪些？

惰性助滤剂是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质，用于扩大过滤表面的适用范围，使非常稀薄和非常细小的悬浮液在过滤时发生的快速挤压和介质堵塞现象得到减轻，易于过滤。

原理:助滤剂能吸附胶体，且形成的滤饼具有网格型结构，不可压缩，滤孔不会被堵塞，从而提高过滤效率。

常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等。最常用的是硅藻土

助滤剂的使用方法:①将助滤剂在支持介质（滤布）的表面上预涂薄层1～2mm;

②将助滤剂分散在待过滤的悬浮液中.

补充:生化产品固液分离方法：过滤、沉降和离心分离。过滤是以某种多孔性物质作为介质，在外力的作用下，悬浮液中的流体通过介质孔道，而固体颗粒被截留下来，从而实现固液分离的过程;沉降是依靠外力的作用，利用分散物质（固相）与分散介质（液相）的密度差异，使之发生相对运动，而实现固液分离的过程;离心分离是利用装臵所提供的惯性离心力的作用来实现固液分离的过程。5、深层过滤和饼层过滤的异同点？

依据过滤介质所起主要作用不同可分为：饼层过滤或深层过滤。

深层过滤:过滤介质(如硅藻土、砂、颗粒活性炭等)起主要过滤作用,当悬浮液通过过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层颗粒上，使滤液得以澄清,这种方法适合于固体含量少于0.001g/mL，颗粒直径在(5～100)μm的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料的过滤澄清; 饼层过滤:沉积于过滤介质上的饼层

起主要过滤作用,过滤介质为滤布，当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布所阻拦而逐渐形成滤饼，滤饼至一定厚度时即起过滤作用，此时滤布主要起支撑作用。这种方法常用于分离固体含量大于0.001g/mL的悬浮液。

6、影响过滤的因素及改善措施？

影响过滤性能的因素主要有:①混合物中悬浮微粒的性质和大小;②混合液的粘度;③操作条件：固液分离操作中温度、pH、操作压力、滤饼厚度等;④助滤剂的使用;⑤固液分离设备和技术

改善过滤性能的方法:工艺上一般采用降低混合液粘度的方法、增大被分离颗粒的粒度或者在混合液中加入助滤剂的方法、提高离心机的转速或提高操作压力、增大真空度、降低滤饼层的厚度，或除去滤饼等方法以改善过滤性能。

7、真空过滤机与压力式过滤机的适用范围？

真空转鼓过滤机特别适合于固体含量较大（>10%）的悬浮液的分离。由于受推动力(真空度)的限制，真空转鼓过滤机一般不适合于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，而且采用真空转鼓过滤机过滤所得固相的干度不如加压过滤。

应用：大规模生物分离的主要过滤设备，用于较难分离的低黏度发酵液

板框过滤机比较适合固体含量1%～10%的悬浮液的分离。板框过滤机过滤面积大，过滤推动力能大幅度调整，能耐受较高的压力差，固相含水分低，能适应不同过滤特性的发酵液的过滤。

应用：用于很难处理的、高黏度、高细颗粒含量的发酵液的固液分离

8、机械法细胞破碎与非机械破碎相比有何特点？

9、细胞破碎主要有那几种方法？

10、何谓化学法破碎细胞？其原理是什么？包括那几种？

细胞破碎技术:（一）机械法①珠磨法:在磨腔中装入小玻璃球或小钢球，由电动机带动搅拌碟片高速搅拌微生物细胞悬浮物和小磨球而产生剪切力，将细胞破碎，释放出内含物。一般有立式或卧式两种珠磨机;②高速匀浆法:利用高压使悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。设备是高速匀浆器，由高压泵和均压阀组成;③超声破碎法:另一种液相剪切破碎法，常为实验室方法.当通过超声探头向悬浮液输入声能，大量声能转化成弹性波形式的机械能，引起局部的剪切梯度，使细胞破碎。（二）非机械方法①酶法溶胞:利用酶分解细胞壁上特殊的化学键使之破裂。②化学法:用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分，改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来。包括酸碱条件改变pH、有机溶剂法、表面活性剂法等。③物理法如渗透压冲击法、冻融法、干燥法等。

11、何为包涵体？包涵体中分离产物一般包括哪几个步骤？

所谓包涵体是指蛋白质分子本身及与其周围的杂蛋白、核酸等形成不溶性的，无活性的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白。

从包涵体中分离产物的处理步骤为：收集菌体细胞→细胞破碎→离心分离→包涵体的洗涤→目标蛋白的变性溶解→目标蛋白的复性。

第三章萃取单元

萃取是利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。液液萃取是以液体为萃取剂，含有目标产物的原料也为液体。液固萃取或浸取是以液体为萃取剂，含有目标产物的原料也为固体。

反萃取:调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作。

萃取方法分物理萃取(溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。例如，用乙酸丁酯萃取青霉素);化学萃取(用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。萃取剂与溶质之间的化学反应，包括离子交换和络合反应等).

1、何谓溶剂萃取？溶剂萃取是利用物质在互不相溶的水相与有机相间的分配系数不同而达到分离的过程，也称溶媒萃取。特点是浓缩倍数和纯化倍数较高，可

连续、多级操作，溶剂耗量大，对设备、安全要求高；应用在生物小分子物质如抗生素、有机酸、氨基酸等。操作的一般过程:萃取–洗涤–反萃取

2‘分配定律及其适用条件是什么？

分配定律:在温恒压条件下,溶质A在互不相溶的两相中达到分配平衡时,如果两相中以相同的分子形态存在,则在两相中的平衡浓度之比为常数,称为分配常数,这就是溶质的分配定律.K=y/x,y是A在萃取相E中的浓度mol/L,x是A在萃余相中的浓度mol/L

适应条件：一定温度和压力下，相同分子形态（相对分子质量相同）存在于两相中的溶质浓度之比。不合适弱电解质的萃取；也不适合于化学萃取，因溶质在各相中并非以同一种分子形态存在

2、在溶剂萃取过程中pH值是如何影响酸碱弱电解质的提取和离子交换（化学）萃取？

弱电解质分配定律公式推导得出:有机相和水相表面的K表与温度压力有关，还与萃取达到平衡时水相的pH密切相关

①酸性电解质:K表＝[AH]/[AH]+[A-]=K/1+10(pH-pKp)

②碱性电解质:K表＝[AH]/[AH]+[A-]=K/1+10(pKp-pH)

化学萃取目的:由于氨基酸aa和一些极性较大的抗生素的水溶性很强，在有机相中的分配系数很小甚至为零，利用一般的物理萃取效率很低，甚至无法萃取。化学萃取有阴离子交换萃取和阳离子交换萃取

水相条件的选择:pH值影响分配系数 K和分离因子β以及稳定性

3、何谓乳化现象？生物料液萃取时形成乳化形成的原因？

乳化:水或有机溶剂以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象。发酵产物的萃取操作中产生乳化后使有机相和水相分层困难，出现两种夹带：①发酵液中夹带有机溶剂微滴，使目标产物受到损失；②有机溶剂中夹带发酵液给后处理操作带来困难。产生原因:发酵液中存在的蛋白质和固体颗粒等物质，这些物质具有表面活剂性的作用，使有机溶剂和水的表面张力降低，水易于以微小液滴的形式分散于油相称为油包水型W/O乳浊液；相反，为O/W型乳浊液。在发酵液溶剂萃取中,有蛋白质引起的乳状液是水包油型(O/W)的,此界面乳状液可放数月不凝聚

4、何为反胶团和反胶团萃取？

反胶团：是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。

反胶团萃取:是利用表面活性剂在有机相中形成分散的亲水微环境,使蛋白质类生物活性物质溶解于其中的一种生物分离技术.其本质仍是液液有机溶剂萃取。反胶团萃取蛋白质的基本原理:反胶团萃取是有机相-水相间的分配萃取,是从主体水相向溶解于有机溶剂相中反胶团微水相中的分配萃取,时也是一个浓缩操作,改变水相条件可实现反萃取。蛋白质融入反胶团的推动力主要包括表面活性剂与蛋白质分子的静电作用力(影响因素是pH值和离子强度)和位阻效应(与含水率W 有关)

影响反胶团萃取的主要因素:水相pH值;离子强度;表面活性剂类型及其浓度

5、反胶团萃取的特点是什么？其中尤其突出的优点(见划线)是什么？

反胶团萃取技术的突出优点：①有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；②分离、浓缩可同时进行，过程简便；③能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题；④表面活性剂往往具有细胞破壁功效，可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；⑤成本低，溶剂可反复使用等。

6、水相的pH值和离子强度是如何影响反胶团萃取的？影响的机理是什么？

①水相pH值对萃取的影响:蛋白质溶入反胶团的推动力是静电引力,而决定蛋白质表面电荷的状态是水相的pH值,因此水相的pH值是影响反胶团的最主要因素.当pH＞pI时，蛋白质不能溶入胶团内，但在等电点附近，急速变为可溶。当pH ＜pI时，即在蛋白质带正电荷的pH范围内，它们几乎完全溶入胶团内。但当pH 很低时萃取率急速减小,这是由于蛋白质和微量的AOT在静电、疏水性等的相互作用下，在水相中生成了复合体而变性所造成的。

②离子强度对萃取的影响:反胶团相接触的水溶液离子强度以不同方式影响着蛋白质的分配。如添加KCl等无机盐，萃取率下降。机理:随着离子强度(即盐浓度)的增大,反胶团内表面的双电层变薄,减弱了蛋白质与反胶团内表面的静电吸引,从而减弱了蛋白质的溶解度；另外,离子强度增加时,反胶团的含水率降低,使反

胶团变小,同时增大了离子向反胶团内”水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向,蛋白质从反胶团内被盐析出来。

7、何谓双水相萃取？目前常用的体系有那两种？

双水相系统是指某些亲水性高分子聚合物之间或亲水性聚合物与无机盐之间,在水中超过一定浓度后形成不相容的两相，并且两相中水分均占很大比例.典型的例子是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)形成的双水相系统。双水相萃取是利用物质在互不相溶的两个水相之间分配系数的差异实现分离的方法。

目前常用的体系:聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)体系和聚合物与无机盐的混合溶液形成的双水相体系如PEG/磷酸钾、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等。

8、为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分离？

在双水相系统中,两相的水分都在85%-95%,且成相的高聚物与无机盐都是生物

相容的生物活性物质或细胞在这种环境下,不仅不会丧失活性,而且还会提高它们的稳定性。

9、影响双水相萃取的因素有那些？

①聚合物及成相盐的种类及浓度②聚合物的平均分子量③体系的pH值及其他盐的种类及浓度④菌体或细胞的种类及含量、体系温度等。

10、何谓超临界流体萃取？其特点有哪些？

超临界流体萃取：使用介于气体和液体之间的流体作为萃取剂，从固体或液体中进行萃取，以达到分离和提纯的目的。

超临界流体：温度和压力略超过或靠近临界温度（Tc）和临界压力（pc），介于气体和液体之间的流体。临界温度：高于此温度时，无任加压多大也不能使气体液化；临界压力：是指在临界温度下，液化气体所需的压力。

超临界流体特点：流体在超临界状态下,其密度接近液体,具有液体溶剂相当的萃取能力,因此萃取能力强;其粘度接近气体,传质阻力小,传质速率大于其处于液态下的溶剂萃取速率,因此传质性能好

11、二氧化碳作为重要的超临界介质的原因？

CO2在工业上应用广泛。它无毒，无腐蚀性，不可燃烧，纯度高且价格低。又有优良的传质性能，扩散系数大，粘度低，而且和其他用做超临界流体的溶剂相比，

CO2具有相对较低的临界压力和临界温度，适合于处理某些热敏性生物制品和天然物产品。

第四章膜分离

1、何谓膜分离？常用和新型膜分离方法那几种？

用天然或人工合成的无机或有机薄膜 ,以外界能量或化学位差为推动力 ,对双组分或多组分溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和富集的方法通称为膜分离法. 膜分离实质：物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依赖于膜孔径大小和分离物质。

常用膜分离技术：微滤、超滤、反渗透、电渗析、纳滤

新型膜分离技术：亲和膜过滤、渗透蒸发、膜蒸馏、膜萃取、液膜分离

2、简述各种膜分离技术的原理及其应用!(纲领性语言即可)(见笔记)

各种膜分离按动力本质分类:

①以静压力差为推动力的过程:微滤（MF)、反渗透（RO)、超滤（UF）、纳滤（NF)

②以蒸汽分压为推动力的过程:膜蒸馏（MD)、渗透蒸发（PV）

③以浓度差为推动力的过程:渗析（D)

④以电位差为推动力的过程:电渗析（ED)

3、膜在结构上可分为那几种？各自的特点？

在一定流体相中，有一薄层凝聚相物质，把流体相分隔开来成为两部分，这一薄层物质称为膜

膜在结构上可分为：①对称膜：结构与方向无关，厚度0.2mm。

②不对称膜：非对称膜有一个很薄的(0.2 m )但比较致密的分离层和一个较厚的(0.2mm)多孔支撑层。两层材质相同。

③复合膜：这种膜的选择性膜层(活性膜层)沉积于具有微孔的底膜(支撑层)表面上，但表层与底层的材质不同。复合膜的性能受上下两层材料的影响。

4、膜组件在形式上主要有那几种？

管式膜组件、螺旋卷式组件、中空纤维（毛细管）式膜组件和平板式膜组件

5、何谓截留率和膜截留分子量？

截留率：是指对一定相对分子质量的物质，膜能截留的程度。δ = 1－C

P / C

B

,

C P 是指某一瞬间透过液浓度（kmol/m3）；C

B

是指截留液浓度（kmol/m3）。

截留分子量 ( MWCO):相当于一定截留率（通常为90％或95％）的相对分子质量。

6、何谓浓差极化现象和凝胶极化现象？它是如何影响膜分离的？减少浓差极化现象的措施？

浓差极化:浓差极化是指在膜分离过程中，所有溶质均被透过液传送到膜表面，不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用，使膜表面附近浓度升高，这种膜表面附近浓度高于主体浓度的现象称为浓度极化。影响:膜表面附近浓度升高，增加了膜两侧的渗透压差，使有效压差减小，渗透通量降低。

措施：为了减少浓差极化，通常采用错流操作如错流过滤。

凝胶极化：膜表面附近浓度超过溶质的溶解度时,溶质呈最紧密排列,或析出形成凝胶层,使流体通过膜的阻力增大,渗透通量降低。在分离喊有菌体、细胞或其它固形成分的料液时,也会在膜表面形成凝胶层,这种现象叫凝胶极化。影响:凝胶层的形成对透过形成附加的传质阻力

7、膜性能降低的原因及清洗方法？

原因:①膜的劣化.包括化学性劣化(水解,氧化)和物理性劣化(挤压,干燥)以及生物性劣化(供给液中微生物或其代谢产物引起),另外还有PH值,温度和压力等

②水生物(附生)污垢.形成附着层和堵塞等外因而引起的膜性能变化

清洗方法:①物理方法：将海绵球通到管式膜中进行洗涤，或利用供给液本身间歇地冲洗膜组件内部，并利用其产生的剪切力来洗涤膜面附着层。

②化学清洗:根据所形成的附着层的性质,可分别采用EDTA和表面活性剂、酶洗涤剂、酸碱洗涤剂等。

8、亲和膜技术中的亲和膜分离与亲和膜过滤的工作原理和区别

膜亲和层析包括两个分支：

①亲和膜分离技术：制备带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离；

将带有亲和配基的分离膜直接进行底物分离。该技术首先要在膜的某些官能团上联接一个“间隔臂”分子,合适的亲和配基与间隔臂分子以共价键结合,形成带有亲和配基的亲和膜。亲和膜分离过程:当样品混合液缓慢地通过膜时,样品中欲分离的目标物与配基产生生物特异性结合,生成复合物而被保留,其它分子则随流动相被冲洗掉。最后,改变流动相的组成 ,使被吸附的生物分子从配基上选择性地解吸出来从而被分离。分离膜的改性→亲和膜的制备→亲和络合→洗脱→

亲和膜再生.需要解决的关键问题:膜表面有足够数量的可利用化学基团 ,以便接着间隔臂和配基;有足够高的表面积、足够大的孔径;孔分布窄而均匀;有一定机械强度;耐酸、碱、高浓度的缓冲液和有机溶剂。应用:亲和膜分离配体如单克隆抗体、肝素、胶原、胰蛋白酶等配基.其与被分离的生物分子间的亲和作用模拟了生物体内发生的特异性作用 ,可在温和的条件下洗脱 ,并保留生物分子的天然构象,因此它适应用生物分子的制备.

②亲和-错流膜过滤：将水溶性或非水溶性高分子亲和载体与产物进行特异反应，然后用膜进行错流过滤。将亲和层析与超滤技术结合 ,高分子底物经专一可逆的亲和反应后 ,用膜进行错流过滤 ,兼有亲和层析和膜过滤的优点。原理:基质常是聚合物(多为亲水性聚合物如聚丙烯酰胺等)组成的内核;大分子的亲和配基连接在内核表面;配基对目标物专一可逆的吸附，形成复合体;用膜对混合液进行错流过滤 ,复合体因分子巨大可被保留，杂质则随液体透过膜;洗脱，分离得到产物。所用的膜需具备的条件:对溶剂具有高渗透压;分子截流范围窄;具有相应的机械强度、化学及热稳定性;抗污染能力强;容易清洗和灭菌;操作寿命长。第五章泡沫分离

1、泡沫分离的定义

泡沫分离是以气泡为介质，利用组分的表面活性差进行分离的一种分离方法。2、泡沫分离的原理及其本质

基本原理：泡沫分离过程是利用待分离物质本身具有表面活性（如表面活性剂）或者能与表面活性剂通过化学的、物理的力结合在一起（如金属离子、有机化合物、蛋白质和酶等），在鼓泡塔中被吸附在气泡表面，得到富集，籍气泡上升带出溶剂主体，达到净化主体液、浓缩待分离物质的目的。

分离作用主要取决于：组分在气-液界面上吸附的选择性和程度。

本质：各种物质在溶液中表面活性的差异。

基本过程:待分离的物质吸附到气－液界面;被泡沫吸附的溶质进行收集并用化学、热或机械的方法破坏泡沫，将溶质提取出来。

3、泡沫分离的主要设备和操作方式

主要设备:泡沫塔和破沫器

操作方式:间歇式泡沫分离过程和连续式泡沫分离过程

第六章蛋白质沉淀

1、蛋白质沉淀的主要方法

①盐析法②有机溶剂沉淀法③|pH水–pI|Value调节法④亲水聚合物沉淀法

⑤聚电解质絮凝法⑥高价金属离子沉淀法⑦亲和沉淀法

2、盐析法沉淀的作用机理

盐析是指在高浓度中性盐存在下，使目标产物的溶解度降低而产生沉淀的过程。盐析沉淀机理:减弱静电斥力;去水化膜.亲水胶体在水中稳定的因素有两个,即电荷和水膜,蛋白质分子表面极性基团越厚,蛋白质分子与溶剂分子的亲和力越大,溶解也越大,而中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性,所以加入大量的中性盐后,夺走了水分子,破坏了水膜,暴露了疏水区域,同时又中和了电荷,破坏了亲和胶体,蛋白质分子即形成沉淀。

3、何为“Ks”分级盐析法、“β”分级盐析法？蛋白质沉淀的先后顺序？

什么是亲和沉淀？

①“Ks”分级盐析法:在一定pH值及温度下，改变盐浓度(即I)达到沉淀的目的

②“β”分级盐析法:在一定盐浓度下,改变溶液的pH值及温度达到沉淀的目的顺序:一般的初步分离用第①种方法，进一步纯化时用第②种方法。

亲和沉淀:利用蛋白质与特定的生物的或合成的分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术.该技术不是根据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度大小。

4、盐析法中常用无机盐是什么?为何选用它们?

无机盐的挑选原则：a较高的盐析效能;b高溶解度，能配臵高离子强度的盐溶液；c溶解度受温度的影响小;d盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离;

e不易引起蛋白质的变性;f格低廉.

最常用(NH4)2SO4. 优点:符合上述要求；缺点:水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。

次常用Na2SO4.缺点：在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。

盐析法影响因素:①无机盐的种类(不同种类的盐主要影响Ks;离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好)；②无机盐的添加方式(分批操作和连续操作)；

③溶液pH(pH影响Cohnx方程中的β值)；④温度(T亦影响β值,T↑β↓,T↓β↑) Cohnx经验公式: ;

式中, S为蛋白质的溶解度(g/L);I为离子强度;m为盐的摩尔浓度；

β值指盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关;Ks为盐析常数,与蛋白质和无机盐的种类有关,与温度、pH值无关. 第七章吸附

1、吸附的概念及类型

吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。

吸附的类型:①物理吸附：吸附剂和吸附物通过分子力（范德华力）产生的吸附;

②化学吸附：吸附剂和吸附物之间的电子转移,发生化学反应,形成库仑力而吸附;

③交换吸附：吸附剂与吸附物之间发生离子交换而吸附。

2、吸附过程的流程

吸附过程:待分离料液与吸附剂混合→吸附质被吸附到吸附剂表面→料液流出→吸附质解吸回收

3、大孔吸附树脂的吸附规律

大孔网状吸附树脂的种类:非极性吸附树脂;中等极性吸附树脂;极性吸附剂

遵循规律：①非极性吸附剂可从极性溶剂中吸附非极性溶质;②极性吸附剂可从非极性溶剂中吸附极性物质;③中等极性吸附剂兼有以上两种能力.

4、吸附等温线？

当固体吸附剂从溶液中吸附溶质到达平衡时,其吸附量与溶液组成和温度有关,当温度一定时，吸附量与浓度之间的函数关系称为吸附等温线。

5、亲和吸附的概念？亲和技术在生化分离中的应用综述？

亲和吸附分离是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用，从而实现分离。吸附剂由载体(载体通常是惰性的,须先活化然后与配基偶联)和配位体组成.

6、固定床、流化床、膨胀床吸附的特点及区别？

7、离子交换的定义？

离子交换是利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力（静电引力）吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，达到分离的目的。

8、离子交换树脂的结构组成？

①具有三维空间立体结构的网络骨架;

②联接在骨架上的活性基团

③活性基团所带的相反电荷的活性离子（可交换离子）

9、离子交换树脂的预处理方法、再生及洗脱？

离子交换操作方法:树脂预处理→离子交换吸附→洗脱

树脂预处理方法:①物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒；

②化学处理：用8-10倍树脂体积的盐酸或氢氧化钠溶液交替搅拌浸泡.阳离子树脂:酸—碱—酸;阴离子树脂:碱—酸—碱.最后以去离子水或缓冲液平衡

洗脱方式:①改变溶液pH值;②改变溶液离子强度

树脂再生是指使离子交换树脂重新具有交换能力的过程。酸性阳离子树脂:

酸-碱-酸-缓冲溶液淋洗;碱性阴离子树脂:碱-酸-碱-缓冲溶液淋洗。方式有顺流再生和逆流再生。

蛋白质离子交换分离的基本步骤:平衡,上样吸附,洗脱,再生

第八章色谱分离

1、色谱法的概念

色谱分离也称色谱层析、色谱、色层,是指样品中各组成依据其在固定相与流动相之间作用行为的差别进行多次分离的过程。

2据溶质分子与固定相相互作用的机理不同而分类的色谱技术主要有几种？

根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同可分为吸附层析法、分配层析法和凝胶过滤法三大类。其中吸附层析法又包含离子交换色层分离法、疏水作用色层分离法、金属螯合色层分离法和共价作用色层分离法四种。

3、各色谱技术的作用机理？

⑴柱色谱；①常用柱色谱介质分无机物色谱介质(氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙(凝胶型和晶型)、氧化钛和氢氧化锌凝胶等)和聚合物色谱介质

(如琼脂糖、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等)②洗脱方法:恒定洗脱法;逐次洗脱法;梯度洗脱法(最常用)

⑵纸层析法:是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析。介质:滤纸;固定相:水。操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹

⑶薄层色谱法:将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法

操作要点:铺板,点样,点样量展开,显色

⑷吸附色谱:指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。

⑸新的吸附色谱技术，如疏水作用色谱、金属螯合作用色谱和共价作用色谱等，所用吸附剂一般为有机基质并通过化学修饰后制成，它们都有比较明确的作用机理，即疏水作用、螯合作用和共价作用。

⑹亲和色谱(AFC):是将与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相从混合物中分离目的产物的过程。亲和作用是特殊的吸附作用。过程:载体活化、配基连接、吸附、洗脱

⑺分配色谱又称为液液色谱，其原理是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。要素：固定相、载体、流动相⑻凝胶色谱(见下第5题)

⑼气相色谱可分为气固色谱和气液色谱.是指用气体作为流动相的色谱法。系统

组成:气路系统;进样系统;分离系统;温控系统;检测记录系统

⑽高效液相色谱(HPLC)与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法. 4、柱色谱系统的组成？

一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成。

5、凝胶色谱的定义？

凝胶色谱:以一定孔径的凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，因而又称为分子筛色谱、空间排阻色谱。

凝胶色谱分为两大类：凝胶过滤色谱和凝胶渗透色谱。

6、阻滞因子(Rf)?

阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 Rf = 迁移距离

流动相在色谱系统中的溶质的迁移距离 第九章 电泳技术 电泳是指荷电的胶体粒子在电场中的移动.电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。

1、带电粒子在电场中的迁移方式主要依据哪些因素？

带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。

2、依据电泳原理，三种形式的电泳分离系统是什么？常用的是什么？

依据电泳原理，有三种形式的电泳分离系统：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳；其中区带电泳是目前常用的电泳系统。

区带电泳中的常用技术：①载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳； ②无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳

凝胶电泳的支持介质：聚丙烯酰胺凝胶；琼脂糖凝胶 影响丙烯酰胺聚合的主要因素:引发剂和增速剂的浓度;系统pH 值;温度;分子氧 聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应:凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状。凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力，

图中A ，B ，C 均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图 分子量大小依次为MA=MB>MC ，所带电荷量相同QA=QB=QC

A B C

＋ -

第十章离心技术

1、常用离心技术：一般包括差速离心法和密度梯度离心，密度梯度离心又分速率区带离心和等密度离心。

（一）差速离心法：采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法；

常用于从组织匀浆中分离细胞和病毒

（二）速率—区带离心：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。

可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分

（三）等密度梯度离心：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位臵上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离。

常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。

第十一章结晶

1、结晶：溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体，晶体的化学成分均一，具有各种对称的晶体，其特征为离子和分子在空间晶格的结点上呈规则的排列；结晶的实质是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程

2、结晶的步骤：①过饱和溶液的形成；②晶核的形成；③晶体生长

其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。

第十二章干燥

1、干燥的定义：用热能加热物料，使物料中水分蒸发而干燥或者用冷冻法使水分结冰后升华而除去的单元操作。通常是生物产品分离的最后一步

2、冷冻干燥：使被干燥的液体在极低的温度下，冷冻成固体；然后在低温低压下利用水的升华性能，使冰升华汽化而除去，以达到干燥的目的。