选修3专题1基因工程

专题1 基因工程

课题1 DNA重组技术的基本工具

1 基因工程

1.1 基因工程的概念

（见必修2第6章）基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫作DNA重组技术或基因拼接技术。

1.2 基因工程的原理

基因工程是利用DNA重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸(基因)进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物。

小结：基因工程的原理是基因重组，其操作水平是DNA分子水平，结果是定向改造生物的遗传特性，获得人类所需的生物类型或基因产物。

2 DNA重组技术的基本工具

2.1 限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

2.1.1 来源

又称限制酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。

[思考]推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？（提示：原核生物容易受到外源DNA的入侵，例如S型肺炎双球菌的DNA能够进入R型细菌中了，并将自身整合到R型细菌的DNA中；又如，噬菌体侵染细菌时会将自身的DNA注入细菌细胞，然后整合到细菌DNA上进行复制和表达。）

原核生物容易受到外源DAN的入侵，限制酶是原核生物的一种防御工具，可以对外源DNA进行切割，从而起到防御作用。但是原核生物自身的DNA分子中没有限制酶所能识别的特定的碱基序列，或是碱基序列被修饰（如加上甲基），使限制酶不会切割自身的DNA。

2.1.2 限制酶的功能及种类

能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。

（基于上述限制酶作用的特点，可知限制酶具有特异性。）

常见限制酶及其识别序列：EcoRⅠ（填限制酶名称）,识别序列为-GAATTC-,切割位点在G（鸟嘌呤脱氧核苷酸）和A（腺嘌呤脱氧核苷酸）之间。SmaⅠ，识别序列为-CCCGGG-。此外，在题目中还经常见到BamHⅠ、HindⅢ等限制酶。

2.1.3 作用结果

限制酶切割后，DNA产生黏性末端和平末端

①黏性末端：限制酶在识别序列的中轴线的两侧将DNA的两条链分别切开时形成的。

②平末端：限制酶在识别序列的中心轴线处切开时形成的。

[思考]如果要把一个目的基因从完整的DNA分子上剪切下来，需要用限制酶切割几处？切割2处。产生几个黏性末端（或平末端）？2个切口，4个黏性末端。目的基因上有几个黏性末端（或平末端）？2个，每端1个。

2.2 DNA连接酶——“分子缝合针”

2.2.1 DNA连接酶的作用

恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。

[思考]DNA连接酶与DNA聚合酶起作用的异同点是什么？

DNA连接酶是将DNA片段进行连接，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到DNA片段上。DNA聚合酶需要与模板结合，而DNA连接酶没有模板。

相同之处是，二者都是催化形成磷酸二酯键。

2.2.2 DNA连接酶的种类

种类来源功能

E·coliDNA连接

酶

大肠杆菌将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来。

T4 DNA连接酶T4噬菌体既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端。（但连接平末端之间的效率比较低）

2.2.3与DNA有关的酶的比较

种类作用作用部位参与的生理过程

或应用

DNA酶能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸磷酸二酯键DNA水解解旋酶能够将DNA或DNA的某一片段解旋成两条单链氢键DNA复制

DNA聚合酶能将游离的脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA

链

磷酸二酯键DNA复制

限制酶能够识别和切割DNA分子内一小段特定的核苷酸序

列

磷酸二酯键基因工程

DNA连接酶通过磷酸二酯键将互补的黏性末端或平末端连接起来磷酸二酯键基因工程

2.3基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

2.3.1 常用载体的种类

①质粒

最常用的载体，质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。

[思考]天然质粒为什么需要进行人工改造？

天然质粒不一定满足做为载体所需要的各种条件，因此需要改造。

②λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

2.3.2 载体作用

将外源基因送入细胞中

2.3.3 载体应具备的条件

①必须有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中;

②可以自我复制，或能整合到染色体DNA上进行同步复制；

③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择；

④对受体细胞无害。

专题1 基因工程

课题2 基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：

①获取目的基因

②基因表达载体的构建

③将目的基因导入受体细胞__________________________

④目的基因的检测与鉴定________________

1 获取目的基因

1.1 目的基因概念及其来源

目的基因主要是指编码蛋白质_____________的基因，也可以是一些具有调控____________作用的因子。目的基因的来源有两方面，一是可以从自然界中已有的物种中分离出来，二是可以进行人工合成。

1.2 获取目的基因的方法

1.2.1 从基因文库中获取目的基因

1.2.1.1 基因文库的的概念、分类

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存。各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，受体菌群体就构成一个基因文库。

基因文库分为基因组文库和部分基因文库。基因组文库中包含一种生物的所有基因，部分基因文库只包含了一种生物的部分基因，如cDNA文库。

文库类型cDNA文库基因组文库

文库大小小大

基因中启动子无有

基因中内含子无有

基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因

物种间的基因交流可以部分基因可以

补充1：启动子、终止子

比较项目启动子、终止子起始密码子、终止密码子

所在位置DNA mRNA

起作用过程转录翻译

识别工具RNA聚合酶核糖体

其他启动子位于基因首端，是

RNA聚合酶识别和结合的

部位。终止子位于基因尾

端，具有特殊结构，是转

录结束的部位。

起始密码子和终止密码子

由核糖体读取后开始或结

束肽链的合成。终止密码

子不决定氨基酸

补充2（理解即可）：内含子、外显子

生物的DNA，分为有遗传效应的基因片段和不具有遗传效应的非基因片段。真核生物的基因包含内含子和外显子，其中内含子是不编码氨基酸的序列，外显子是可以编码氨基酸的序列。

真核生物基因的转录时，首先以整个基因序列为模板进行转录，然后对得到的mRNA前体进行加工，将内含子所对应的mRNA序列剪切掉，得到成熟的mRNA，故mRNA序列比它所对应的DNA序列要短。加上并非所有的mRNA序列都能决定氨基酸，所以在转录和翻译过程中存在着遗传信息的损失。

[思考]（考试不会直接考）理解为什么cDNA文库的基因中没有启动子和内含子。

1.2.1.2基因文库的构建

基因文库的构建过程用到了基因工程的部分技术：限制酶切割DNA、构建重组DNA、重组DNA导入受体菌等，cDNA文库的构建还用到了反转录。

基因组文库的构建：a.提取某生物全部DNA，选用适当的限制酶将DNA切成一定范围大小的DNA片段；b.将获得的DNA片段分别与载体连接；c.将携带不同DNA片段的载体导入受体菌群体中。

cDNA文库的构建：a.用某种生物的某个发育时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA片段（即cDNA）；b.将获得的cDNA片段分别与载体连接；c.将携带不同DNA片段的载体导入一个受体菌群体中。

[思考]构建基因组文库和构建cDNA文库的主要差别是什么？

1.2.1.3从基因文库中获取目的基因

要从基因文库中获取目的基因，首先要有目的基因的有关信息，如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等。

1.2.2 利用PCR技术扩增目的基因

PCR技术的名称是多聚酶链式反应_____________________，其原理是DNA双链复制__________________，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。进行PCR的前提条件是：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。

PCR过程及结果等内容见《选修1》专题5课题2。

补充（只需了解）：关于PCR反应体系中所加原料的理解。在《选修1》中，我们在PCR的反应体系中加入4种游离的脱氧核苷酸做为原料。在实际操作种，往往加入dATP、dTTP、dCTP、dGTP（题目中有时写作dNTP），它们是和ATP结构相似的高能磷酸化合物，在PCR反应过程中高能磷酸键断裂为核苷酸链的延伸提供能量，dNTP失去两个磷酸基团后成为脱氧核苷酸，做为合成子链的原料。

1.2.3 人工合成

如果基因比较小，核苷酸序列已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

2 基因表达载体的构建（基因工程的核心）

2.1构建基因表达载体的目的

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

2.2基因表达载体的组成

为达到以上目的，成功构建的表达载体至少需要5部分组成：启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点等。这与做为基因工程的载体必须具备的几个条件相一致：

a.要能够自我复制（复制原点）；

b.具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择（标记基因可以用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来）；

c.具有一个至多个限制酶切割位点（目的基因应插入启动子下游、终止子上游）；

d.对受体细胞无害。

2.3构建过程

如图所示，可简单概括为两步：①用限制酶分别切割目的基因和载体，使二者具有相同的黏性末端（平末端）；

②用DNA连接酶将目的基因和载体进行连接

[思考]（考试不会直接这么问，加强理解）①用同一种限制酶切割目的基因和载体，用DNA连接酶处理后可以获得哪些DNA分子？

②同时使用两种限制酶来切割目的基因和载体，用DNA连接酶处理后可以获得哪些DNA分子？

3将目的基因导入受体细胞

3.1 转化

转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

其概念中包含３个层次：①目的基因能够进入受体细胞中，将目的基因导入受体细胞后，通过培养可获得转基因生物；②目的基因要能够插入到受体细胞的DNA中，这样才能够稳定维持；③目的基因要能够在受体细胞中进行表达，一般地，表达产物为蛋白质（多肽链），在少数情况下，转录产物（如tRNA等）也可以看作基因表达产物。

联系：肺炎双球菌的转化。S型细菌的DNA与R型活细菌一起培养，获得S型活细菌，这一转化过程与本节所述转化概念相同，即S型细菌的DNA侵入到R型细菌中，整合到R型细菌的染色体DNA上并进行表达，使得R型细菌能够形成多糖荚膜，从而转化成为S型活细菌。

3.2将目的基因导入植物细胞

将目的基因导入植物细胞，使用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。

3.2.1 农杆菌转化法

3.2.1.1原理

农杆菌在自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染力。植物体受到损伤时，伤口处细胞分泌酚类化合物，吸引农杆菌。农杆菌中Ti质粒上的T-DNA（可转移DNA）可以转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。

3.2.1.2农杆菌转化法操作过程

a.构建表达载体。将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上

b.转入农杆菌。将重组Ti质粒转入农杆菌

c.导入植物细胞。利用T-DNA的特性，将插入了目的基因的T-DNA导入植物细胞，目的基因整合到植物细胞染色体DNA上，目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。

d.上述植物细胞（受体细胞）经过培养再生成植株，可表现出新性状。

3.2.2 基因枪法与花粉管通道法

①基因枪法。又称微弹轰击法，将包裹在金属颗粒（0.6~4μm的钨粉粒子或金粉粒子）表面的的表达载体DNA 打入受体细胞，并进行整合和表达。成本较高，常用于单子叶植物。

②花粉管通道法

我国科学家独创，十分简便经济，我国转基因抗虫棉就是用此种方法获得的。其具体操作做了解：植物受粉后，花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后滴加含目的基因的DNA，使目的基因进入受体细胞。

3.3 将目的基因导入动物细胞

常用方法是显微注射技术，常用受体细胞是受精卵（可在体内或体外受精）。其操作程序如下：

a.提纯。将基因表达载体提纯，使DNA浓度保持在1~3μg/ml

b.注射。取卵（受精卵）进行显微注射

c.培养。注射了目的基因的受精卵移植到雌性动物的输卵管或子宫内发育成为具有新性状动物。

3.4 将目的基因导入微生物细胞

3.4.1 原核生物的特点

繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。最常用的是大肠杆菌。

3.4.2 转化过程

a.Ca2+处理细胞，获得感受态细胞（能吸收周围环境中DNA分子的生理状态）

b.表达载体与感受态细胞混合，感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。这个过程需要在一定的温度下进行。

4 目的基因的检测与鉴定

目的基因的检测与鉴定，是为了判断目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性。

（为什么要进行第四步，简单理解即可：在表达载体的构建过程中，获得的重组DNA不一定是我们所需要的，且导入过程中并非所有受体细胞中都能成功导入。目的基因导入受体细胞后，可能不具备稳定维持的状态，比如随细胞分裂而丢失。目的基因在受体细胞中不一定能够进行完整表达，比如不能转录，或者能转录不能翻译等。）

4.1 分子水平的检测

4.1.1检测目的基因

检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。

检测对象：目的基因（DNA）。检测方法：DNA分子杂交技术。

检测过程：a.获取待测细胞的基因组DNA；b.制备DNA探针——在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此为探针；c.分子杂交——将探针与基因组DNA杂交，如果显示杂交带，表明目的基因已插入染色体的DNA中。

4.1.2检测转录产物mRNA（表达的第一步）

检测对象：转录产物mRNA。检测方法：分子杂交技术。

提取转基因细胞中的mRNA（总RNA），用带有放射性同位素标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。

4.1.3检测翻译产物蛋白质（表达第二步）

检测对象：目的基因表达产物蛋白质。检测方法：抗原-抗体杂交。

从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。

4.2 个体生物学水平鉴定

（了解课本所列的例子）

①做抗虫或者抗病的接种实验

一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。

②有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。

专题1 基因工程

1.3 基因工程的应用

1 植物基因工程的应用

列表总结植物基因工程中使用的各种目的基因，并简单理解

应用外源基因类型及举例成果举例特别提醒

抗虫转基因植

物

Bt毒蛋白基因

蛋白酶抑制剂基因，淀粉酶抑

制剂基因

植物凝集素基因等

抗虫棉、抗虫水

稻等

①抗虫但不抗________________

__________等;

②优点：减少环境污染、降低生

产成本;

③不同的抗虫基因作用机理不同

抗病转基因植

物

抗病转基因植物采用最多的是

病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶

基因；

几丁质酶基因、抗毒素合成基

因是抗_______转基因植物中可使

用的。

抗病毒烟草、抗病

毒小麦等

病原微生物三大类：病毒、细菌、

真菌

抗逆转基因植

物①调节细胞渗透压的基因;

②抗冻蛋白基因(从鱼体内获取);

③抗除草剂基因

抗干旱及抗盐碱

烟草;抗寒番茄;抗

除草剂大豆、玉米

抗逆种的“逆”指的是不利的环

境条件

改良植物品质

①含必需氨基酸较多的蛋白质编

码基因;

②控制番茄果实成熟的基因;

③与植物花青素代谢有关的基因

富含赖氨酸的玉

米、延熟番茄、转

基因矮牵牛

赖氨酸、亮氨酸等都属于必需氨

基酸

[思考]1.根据课本P18“生物技术资料卡”简单概括Bt毒蛋白基因起作用的过程、蛋白酶抑制剂起作用的两种方式、淀粉酶抑制剂基因作用原理、植物凝集素起作用的原理。

①

②

③

④

[思考]2.相比于传统的杂交育种培育抗病植株，利用基因工程育种来培育抗病转基因植物的优势是什么？

[思考]3.结合基因对生物性状控制的两条途径，改良植物品质所使用的目的基因可概括为哪两类？

2 动物基因工程的应用

应用操作方法

提高动物生长速度所用目的基因：外源______________基因

改善畜产品的品质

所用目的基因：__________________。

目的基因导入奶牛基因组,获得的转基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大降低,但其他营养成分不受影响。

生产药物

所用目的基因：________________

①获得转基因动物。目的基因与乳腺蛋白基因的__________等_______组件重组在一起,通过______________法,导入哺乳动物的受精卵中,然后,将受精卵送

入母体内,使其生长发育成转基因动物。

②获取所需药品。转基因动物进入______________后,可以被通过分泌的乳汁来生产所需要的药品,因而被称为____________________________。

作为器官移植供体

方法①：将器官供体基因组导入某种______________,以抑制______________基因的表达；

方法②：设法_______抗原决定基因，再结合克隆技术,培育出没有_______反应的转基因克隆猪器官

3 基因工程在医学、药学上的应用

3.1基因工程药物

工程菌：指用基因工程的方法,使外源基因得到______________的菌类细胞株系。常见用作工程菌的有______________、酵母菌等。

利用工程菌生产的药物包括细胞因子、_______、_______、激素等。（注解：多为蛋白类产品。细胞因子如干扰素、白细胞介素（一种淋巴因子）等，主要由淋巴细胞产生。

3.2基因治疗

3.2.1 概念

把_______基因导入病人体内,使该基因的______________发挥功能,从而达到治疗疾病的目的,这是治疗遗传病的最有效的手段,包括体外基因治疗和体内基因治疗两种方式。

3.2.2 两种途径的比较

比较项目体外基因治疗体内基因治疗

不同点方法

①从病人体内获得某种细胞，进行

培养

②在_______完成基因转移

③筛选成功转移的细胞，进行

_______培养（增加细胞的数量）

④将转基因细胞输入患者体内

直接向人体组织细胞中转移基因特点操作复杂，但______________ 方法简单，但效果难以控制

相同的二者都是将外源正常基因导入受体细胞，使其表达。目前都处于初期临床试验阶段。

3.2.3 用于基因治疗的基因种类

①功能正常的基因。可取代病变基因，或依靠其表达产物，弥补病变基因带来的生理缺陷。

②反义基因。反义基因转录产生的mRNA可以与病变基因产生的mRNA互补，从而阻断____________蛋白质的合成。

③自杀基因，即编码可杀死癌变细胞的_______的基因。