【CN109988846A】一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910178865.X

(22)申请日 2019.03.11

(71)申请人浙江省淡水水产研究所

地址 313001 浙江省湖州市杭长桥南路999

号

(72)发明人郑建波　贾永义　顾志敏　程顺　

李飞　迟美丽　刘士力　蒋文枰　

(74)专利代理机构北京国翰知识产权代理事务

所(普通合伙) 11696

代理人卫翠婷

(51)Int.Cl.

C12Q 1/6888(2018.01)

C12Q 1/6811(2018.01)

C12Q 1/6841(2018.01)

C12N 15/11(2006.01)

C12N 15/10(2006.01) (54)发明名称

一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片

原位杂交的方法

(57)摘要

本发明提供一种适于红螯螯虾性腺组织

mRNA石蜡切片原位杂交的方法，属于原位杂交技

术领域，包括性腺组织包埋、

石蜡切片、原位杂交和拍照记录，其中原位杂交采用探针序列为如

SEQ ID NO.3所示。本发明探针对dsx基因的的组

织定位有明确的特异性，实现了对dsx基因mRNA

水平的显示作用；本发明在红螯螯虾中建立了石

蜡切片mRNA原位杂交的方法来研究相关基因在

性腺中的表达模式，能够清晰地描述红螯螯虾性

别相关基因在性腺中的表达定位；本发明方法在

石蜡切片脱蜡效果佳的同时避免组织收缩和细

胞变形，使得组织仍保持在原位，组织形态保持

完整，还能提高酶解效果，使得细胞着色好，核质

分明，

最终提高原位杂交的准确性。权利要求书2页说明书5页序列表1页附图1页CN 109988846 A 2019.07.09

C N 109988846

权　利　要　求　书1/2页CN 109988846 A

1.一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针的方法，其特征在于，按照如下步骤：

S1步骤：以逆转录得到的红螯螯虾性腺组织cDNA为模板，利用引物通过PCR反应扩增得到dsx基因的部分ORF序列，该序列作为dsx基因mRNA特异的探针序列；

S2步骤：构建dsx基因mRNA原位杂交的探针质粒，将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；

S3步骤：制备dsx基因mRNA原位杂交探针。

2.根据权利要求1所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针的方法，其特征在于：所述dsx基因在精巢中表达，而在卵巢中不表达。

3.根据权利要求1所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针的方法，其特征在于：所述引物的

正向引物为：5’-GAATTCTAATACGACTCACTATAGGGA-3’；

反向引物为：5’-CCTATAGTGAGTCGTATTAAAGCTT-3’。

4.一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针，其特征在于：采用权利要求1或2或3所述的方法制得。

5.根据权利要求4所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交用探针，其特征在于：所述探针序列为如SEQ ID NO.3所示。

6.一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法，包括性腺组织包埋、石蜡切片、原位杂交和拍照记录，其特征在于：所述原位杂交采用权利要求4所述的探针。

7.根据权利要求6所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法，其特征在于：所述的原位杂交包括如下步骤：

1)石蜡切片脱蜡：将切片依次用二甲苯、无水乙醇、85％酒精、75％酒精、DEPC水洗进行脱蜡；

2)消化：将水洗后切片于修复液中煮沸，自然冷却后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K消化，冲洗；

3)预杂交：将消化后切片上滴加预杂交液，孵育；

4)杂交：倾去预杂交液，滴加含探针杂交液，杂交过夜后洗涤；

3)封闭：滴加封闭血清BSA，倾去封闭液，然后滴加anti-DIG-HRP，孵育；

4)DAB显色：切片稍甩干后，在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，纯水冲洗切片终止显色；

5)复染细胞核：用苏木素染液复染，水洗后经1％盐酸酒精分化，水洗，氨水返蓝，冲洗；

6)封片：中性树胶封片。

8.根据权利要求7所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法，其特征在于：所述二甲苯中含有0.03-0.06％三氯乙醛和2.8-3.0％苯芴醇。

9.根据权利要求7所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法，其特征在于：所述探针杂交液的浓度为50ng/ul。

10.根据权利要求6所述的一种适于红螯螯虾性腺组织mRNA石蜡切片原位杂交的方法，其特征在于：所述性腺组织包埋包括如下步骤：

将组织取出洗净后立即放入固定液中固定2-12h，固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，

石蜡切片制作标准程序

动物病理组织学石蜡切片制作标准操作程序（SOP）一、\器材和试剂准备（一）载玻片和盖玻片的清洁 1.载玻片和盖玻片清洗方法 (1)锅内倒入适量清洗液（100 mL水+30 m L洗洁精+30 mL 84消毒液）； (2)将玻片逐片放入锅中, 加热至沸腾10 min, 停止加热, 自然冷却; (3)捞出玻片流水冲洗10min,彻底冲净泡沫（弹簧夹上后，单片过水）; (4)将玻片从水中取出, 用蒸馏水冲洗三遍（最好单片过水）; (5)将玻片放入 95%乙醇（分析纯）中浸泡；（6）取出玻片，码在切片盒，自然干燥（或无风适度高温干燥）备用；注意：由于盖玻片很薄，不能同载玻片放在一起处理；盖玻片从95%乙醇溶液中取出后要放在吸水纸上摊开，干燥后，放在小盒子中备用。 2.粘片剂（蛋白甘油）的制作及载玻片的预处理（1）蛋白甘油的制作取新鲜鸡蛋，先将其尖端用眼科剪或拨针挑破一小孔，再将蛋的另一端挑破一小孔并稍加扩大，大孔端朝下，使蛋白流入100~200毫升的烧杯中（不要蛋黄），以玻棒打拌蛋白完全变为雪花状泡沫，然后倒入垫有几层纱布的漏斗中过滤而得到透明、清凉的的蛋白液，再加入等量甘油，振摇使之充分混合，加入1%麝香草酚或樟脑防腐。一般将其盛入滴瓶或树胶瓶中备用，不用时盖好防尘。或1个鸡蛋的蛋清+500mL双蒸馏水，混匀，加10mL浓氨水。（2）将蛋白甘油倒在小烧杯中，载玻片用弹簧夹夹上后侵入蛋白甘油中，贴壁刮干，放在切片盒内晾干备用。二、石蜡组织切片的制作（一）取材注意事项： 1.材料质量：材料必须新鲜，应争取在死后半小时内处理完毕。 2.取材体积：组织块力求小而薄（厚度不要超过5mm，以2mm最佳） 3.取材力度：取材器具锋利。勿使组织块受挤压，切割时不可来回挫动。夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 4.固定形状：固定尽量保持组织的原有形态新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能雅持原形。对神经、肌肉、皮肤组织等，则可将其两端用线扎在木片上或硬纸片上固定。 5.切向选择：选好组织块的切面应熟悉器官组织的结构并据此决定其切面的走向。纵切或横

HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤

HE染色 1．取材切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。注意事项：（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液）镊子触质粒由硬变韧性为准。（美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。 3. 洗涤材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。（20，30，30，60）（美）：流水冲洗约4小时 4. 脱水材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水，各30min 注意事项：（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。（3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象（美）：80％的酒精×2小时 95％的酒精×2小时 100％的酒精×2小时×2 100％的酒精×1小时或者更长时间 5．透明（环保透明脱蜡液）中杉金桥纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明为止）。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

石蜡切片技术实验(内附组织染色后的照片)

石蜡切片技术实验实验目的掌握动植物材料石蜡切片的方法及要求。实验材料小白鼠各种器官组织实验方法 ? 石蜡切片技术（一）取材与固定 ? 石蜡切片技术（二）渗透与包埋 ? 石蜡切片技术（三）切片 ? 石蜡切片技术（四）染色 ? 石蜡切片技术（五）观察总结一、取材与固定 1 准备工作：工具、药品、计划等 2 动物的麻醉：氯仿麻醉 3 解剖取材 4 材料分割：保持样品的完整性与代表性，考虑切片方向，实心组织大小5*5*2mm,空心细长组织10mm长。 5 固定：布温氏固定液固定24h。 6 漂洗：70%乙醇换洗3次，每次20~60min。 7 保存：70%乙醇0~4 ℃。二、脱水、渗透与包埋 1 脱水：85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇，每步30min~60min 2透明：1/2乙醇＋1/2二甲苯→二甲苯→二甲苯，每步30min~60min 3 渗透： 1/2二甲苯＋ ?石蜡→石蜡→石蜡，每步20min~60min，温度62℃

4 包埋：将材料放入盛有石蜡的纸盒中，摆好位置（要考虑下一步的修快与切片方向），在水中冷却5～10min. 三、切片 1 修块用单面刀片在玻璃板上修快使达到以下要求：（1）一个蜡块含一个材料，蜡块呈正方形或长方形，材料位于蜡块正中央。（2）材料边缘与蜡块边缘平行，各面要平直，材料边缘与蜡块边缘的距离约3mm。 2 固着将修好块的蜡块用烧热的解剖刀固着在样品台上。 3 切片按以下顺序进行（1）将样品台固定在切片机样品臂上，使切面竖直；（2）调切片厚度5～10um；（3）将切片刀用纱布蘸少许二甲苯擦净后装到切片机上，调刀角15～20，将刀固定好；（4）调刀距使样品与刀口尽可能靠近；（5）切片顺时针摇动切片机速度40-60r/min；（6）将切好的蜡带光面向下用毛笔放到台纸上 4 贴片 (1)清洗载波片； (2)加粘片剂，要求薄、匀； (3)放切片，光面向下； (4)加水于切片下面； (5)展片将载波片放于50℃的温台上至切片完全展平； (6)烤干吸掉多余水，继续放于温台上至水完全干燥； 5 贴标签临时标签，用铅笔写明组号、姓名。四、染色 1 脱蜡二甲苯(2)→二甲苯(1)，每步510min；

石蜡切片的制作

说明石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。文档来自于网络搜索取材应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。文档来自于网络搜索固定用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa 液（配方见有关技术书籍）。因此，应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。文档来自于网络搜索洗涤与脱水固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相

石蜡切片详细步骤

石蜡切片 1.仪器石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡：将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋：先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。

7．粘片将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照

石蜡切片技术实验报告

题目：石蜡切片技术实验报告学院：农学院，专业：植物学，姓名：张永丰，学号：2011202010目的掌握石蜡切片技术，为以后的科研中切出合格的实验装片做准备。并观察植物叶的横切面内部结构。材料：已经固定好的女贞叶方法与操作步骤一、脱水：依次使用下列浓度的乙醇脱水 50%乙醇一70%乙醇一85%乙醇一95%乙醇一100%乙醇一100%乙醇每步两个小时。二、透明：依次通过下列试剂进行透明 1、1/2无水乙醇1/2二甲苯（加少许番红粉末，对材料进行附染）两个小时 2、二甲苯两个小时 3、二甲苯一个小时三、浸蜡：浸蜡步骤如下 1、将材料瓶中的二甲苯取出1/2,加入剩余二甲苯的体积3/2倍的石蜡液于36C 温箱中处理35小时 2、换用纯石蜡液于60 T温箱中处理2小时，再换一次纯石蜡液处理2小时四、包埋与切片 1、在提前准备好的纸盒中放入少量蜡液。 2、片刻后放入材料，避免形成断层还要注意材料摆放的位置和方向。 3、及时将蜡块冷却，防治形成结晶。 4、修块与粘连：将多余的石蜡切除，使蜡块成为梯形；将蜡块一正确的方向粘连在枕木上。 5、切片：利用切片机将蜡块切成薄片。切片厚度为8?10卩m,以每分钟40? 50转为宜。 6、粘片与展片：在载玻片上滴一滴黏贴剂和一滴蒸馏水用牙签涂匀，将蜡带光面朝下固定于载玻片上，放到展片台上经加温使其充分展开。 7、干燥：将展好的片放于36 E温箱中干燥16小时五、脱蜡：切片分别经过下列步骤进行脱蜡二甲苯30min 1/2二甲苯1/2无水乙醇5min无水乙醇5min 95%乙醇5min 85%乙醇5min 70%乙醇5min 六、染色：染色分为番红染色和固绿染色两步 1、番红染色：将载玻片放入盛有番红染液（1%番红，70%乙醇）的染缸中染色 22小时 2、固绿复染：载玻片依次经过一下处理 70% 1min 85% 1min 95% 1min 固绿染液（0.1%固绿，95%L醇）20 秒 3、脱水：95% 1min 100% 1min 100%1min 4、透明：1/2二甲苯1/2无水乙醇1min二甲苯1min二甲苯七、封片中性树胶封片，干燥八、镜检

组织切片石蜡切片过程

石蜡切片过程一、石蜡包埋: 1.脱水：组织水洗后便可酒精脱水，70% →80% →90% →95%→ 100%酒精（无水乙醇）→100%酒精，各级酒精脱水时间30-45 min。（注意：80%酒精内组织可留之较久，当天如果来不及做完就可以暂时保存一晚上，次日再继续做下去。70%的酒精可作为更久的保存剂。） 2.透蜡：脱水后组织：50%酒精+50%二甲苯30 - 45min. 二甲苯（组织透明即可停止) 15min. 50%二甲苯+50%石蜡20-30min. 纯石蜡1 45min. 纯石蜡2 45min.（透腊之前做好准备工作：准备腊杯，烘箱温度保持55—60℃左右，使石腊熔化，温度不宜过高，以免使组织发脆。） 3.包埋： a.折好纸盒，准备小镊子、酒精灯、解剖针、冷水等。 b.用温热吸管吸取石蜡注入纸盒。等待底稍微凝固，温镊子夹住样品放入盒子中央，面朝底(可以将蜡一次倒入纸盒，然后待蜡表面起膜后，用温镊子夹住样品放入蜡中，待冷却即可，整个操作过程中，切勿让蜡中起气泡)。 c.两手拿着两端，入冷水一半，吹气，使表面石蜡形成移较厚腊层，然后急速全部进入冷水中3分钟。 d.修正蜡块（上下两个面一定要平行并且光滑） e.固着蜡块

二、切片 1.切片（切片时，可以在刀片以及刀片周围涂上一点甘油） 2.贴片烤片（甘油蛋白=1/2甘油+1/2鸡蛋清）（在贴片时，用细吸管取一点点甘油蛋白（越少越好）于载玻片上，然后用手抹匀，手一定要干净。将切片放在载玻片（光亮面朝向下），然后滴几滴冷水使切片悬于水上。接着将载玻片放在37℃上烘烤。常见问题分析： 1.切片分离不能形成蜡带：?室温过低，蜡过硬。 2.蜡带弯曲：?蜡块口下面不平行，或蜡块不与刀刃平行所致。 3.切片厚薄不一:?切片刀或蜡块未固定紧。 4.切成片后，组织与蜡块脱离：?脱水不干净等。 5.蜡片易粘在切片上或蜡片萎缩：?室温太高或蜡太软或刀的角度太小。 6.切片破裂：?浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在脱水剂、透明剂中时间过长，引起组织发脆或有杂质，材料脱钙不完全，此种无法补救。 7.蜡片上卷，切过刀口即破裂：?刀口太钝或沾有石蜡或刀的角度过大或蜡太硬。 *：包埋时，时间长会使标本变质，过短则石蜡不能透进标本。石蜡包埋过程中，注意控制温度保持在58-60℃，石蜡不能融化。

石蜡切片步骤

石蜡切片制作大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇）固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片

肌纤维石蜡组织切片的制作

肌肉组织学常用测量指标及方法一、肌纤维直径和面积测量（H.E染色）：（方法见附件一）各样品测100条肌纤维，在5个不同的切面视野上，随机取样。方法1――在10X 40倍显微镜下，用直线测微尺随机测量，由于肌纤维横断面常为不规则椭圆形或多边形，所以无法精确测量其直径。参考椭圆形长短轴的测量方法求其直径。先通过中点量出肌纤维横断面上最长两点间的距离为长径—反之为短径，然后长短径的几何平均数为每条肌纤维的直径，计算出面积。方法2――以日本产MICRO-SCALE定每个样品的肌纤维长径和短径，每个样品测定200根肌纤维的值，肌纤维的选取尽量以肌束为单位，完整测量各肌束内所有肌纤维，以减小取样误差。肌纤维的面积以“长径X短径X 0.7 ”的经验公式求得。取所测定的100根肌纤维的平均值作为每个样品的值用于以后的研究。二、肌束内肌纤维根数的测量（H.E染色）：（方法见附件一）在10X40倍显微镜下，随机选择视野，记录每个样本20束肌束内肌纤维根数, 求其平均值和标准误。三、肌纤维间距、肌束间距，肌大束间距的测量（H.E染色）：（方法见附件一）在10X40倍显微镜下，直线形目微尺测量，各样品测100个间距，在5个不同的切面式视野上随机取样。四、肌纤维密度（H.E染色）：（方法见附件一）在目镜中加入网格目测微尺，在10X 40倍显微镜下，用网格形目测微尺测量5个视野内的肌纤维根数，换算成每平方毫米面积内肌纤维的根数。在选择视野时避开较大的肌束膜。五、肌纤维、结缔组织、脂肪组织的面积比和体积比（H.E染色）：（方法见附件一）方法1――取染色的切片，用显微投影仪放大技术放大于白纸上，对3种组织绘出或打印，剪下分别称重并换算出其3种组织面积比。方法2――采用测量单位参照面上肌纤维与结缔组织的面积分数来反映其体积分数。在15X40倍显微镜下，每个样本取5个不同视野进行显微摄影，再将照片洗出（彩色5寸或更大）。将所得照片按肌纤维与结缔组织分别剪下，用1/ 10000电子分析天平称重，分别得出肌纤维与结缔组织的重量。由于相纸密度相同，所以此重量比能反映其面积和体积比。六、肌节长度：方法1——于新鲜肉样中心部位取3cm1左右的一小块与20ml的0.08mol/L KCl 溶液混合,于高速组织捣碎机中均质30s,制压片一张,用相差显微镜10X 100 倍显微测量肌节长度，每个样本随机测定20根肌原纤维的肌节，其平均值代表该肌肉样本的肌节长度。方法2——电子显微镜超微结构观察：新鲜取样约1 cm X 1.5cm,置于2.5%戊二醛溶液中预固定，用眼科剪刀剪切成 1 cm3大小，放在戊二醛溶液中继续固定，经PBS冲洗后用1%的锇酸固定2.5小时，梯度丙酮脱水（50%, 70%, 85%, 90%, 100%）, Epon-812树脂包埋。超簿切片机切成50nm超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜（1-4万倍）观察、拍照、冲洗印相，用游标卡尺测量肌节长度、肌原纤维直径，I带及A带长度，并观察肌纤维超微结构的特征，肌纤维间线粒体、肌糖元、脂肪滴的含量。（我校为70-80元/张，只需要采样后交给电镜室即

石蜡切片的制作过程(精)

石蜡切片的制作目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法

石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片

植物学实验报告

植物学实验实验一、植物学实验的基本研究方法 1、简述光学显微镜的使用方法 1）取镜放置准备：a、取时右手握镜臂，左手托镜座。小心轻放，放置实验台中部略偏左位置，距桌3-4cm。 b、插电源 c、旋转物镜转换器，低倍镜就位 e、使虹彩光圈调到最大，聚光器转到最高 2）放装片，准备观察：a、放载玻片 b、从左侧观察，调至最中心 c、用双手调节粗准焦螺旋 d、调节目镜 3）观察：a、调节粗准焦螺旋，下降载物台至最低，使其清晰，上调 b、调节细准焦螺旋 c、用推进器使物体于视野中央 d、左眼观察，右眼画图 4）高倍镜观察：a、侧面转动转换器（不换油镜） b、调节光源亮度 c、调节细准焦螺旋使像清晰 d、画图 5）换载玻片：a、载物台放至最低 b、调节至最低物镜 c、换新片 d、用低倍镜观察 6）结束整理：a、关闭电源 b、载物台放至最低 c、取下载玻片 d、4倍，10倍物镜内呈八字形放置 e、电源线缠绕2圈半（至镜筒上） 2、常用的植物制片技术有哪几种共5种——临时水封片、徒手切片法、压片法、石蜡切片法、离析法 3、详细说明生物绘图的具体步骤与要求 a、观察：细心观察，对各部分的位置、比例、特征等有完整的认识 b、起稿：勾画轮廓，用软铅笔（HB）勾勒观察对象的轮廓和结构 c、定稿：用硬铅笔（2H或3H）将全图绘出。用线条表示结构，线条要均匀，光滑，用圆点表示各部分的对比度，点要圆。 d、标注名称：一般为直接标注，标出指示部位的名称，最好在右侧 e、核实全图：核实绘图内容，保持图画整洁，并在下方写图名称

实验二、植物细胞的基本结构 1、根据观察简述植物细胞的基本结构，你都观察到了那些细胞器植物细胞：细胞壁——纹孔和胞间连丝原生质体——细胞质——细胞器和胞机制后含物细胞核细胞膜观察到的细胞器有：质体（叶绿体、白色体、有色体）液泡 2、植物细胞中后含物包括哪些，通常位于细胞的什么细胞器内 1）淀粉——以淀粉粒的形式在造粉体内形成并贮藏 2）蛋白质——通常位于细胞的核糖体、高尔基体、内质网中 3）脂肪和油——存在于白色体 4）晶体——液泡实验三、植物分生组织和细胞分裂 1、从根尖分生组织的类型、位置和细胞特点等方面说明分生组织的特点根尖分生组织的类型：1）原生分生组织：位于根和茎的最前端，是从胚胎中保留下来的，具有永久分裂能力的细胞群，由原始细胞组成，细胞分化少 2）初生分生组织：由原生分生组织刚衍生的细胞组成的，位于原生组织后方，细胞已出现初步分化，其又可划分成三部分即原表皮、基本分生组织和原形成层，随后依次发育成表皮，维管柱，皮层分生组织细胞的特点：细胞小，壁薄，原生质丰富，细胞核大并位于细胞中央，没有液泡或会有分散的小液泡，细胞排列紧密 2、做好根尖压片的关键是什么 1）固定液要迅速杀死正在分裂的细胞使其保持分裂状态 2）解离时注意解离时间 3）染色时间充分 4）轻压盖玻片使细胞分散实验四、植物组织观察 1、比较导管和筛管在结构和功能上有何异同结构：同：都由长管状细胞上下连接而成，均无细胞核异：导管：以端壁形成的穿孔相互连接，上下贯通：由有花纹的死细胞构成，有五种类型筛管：细胞连接处稍微膨大，连接端壁即筛板上有许多筛孔；由活细胞构成功能：同：都有运输功能异：导管运输水和无机盐筛管运输有机物

石蜡切片的制片方法

石蜡切片制作基本技术实验器材：转动切片机、镊子、解剖刀、解剖针、玻璃缸或小塑料盆、小烧杯（50ml）、酒精灯、打火机、染色缸、吸管、温台、温箱、毛笔、纱布、双面刀片。试剂：95%的乙醇、无水乙醇、二甲苯、甲醛、石碳酸、甘油、新鲜鸡蛋清、加拿大树胶、番红、铬绿、熔点48~50℃和56~58℃的石蜡。其它：无水CaCl2 、铁帆、苏木精、重铬酸钾、浓硫酸石蜡切片制作基本技术：石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1.取材应根据要求选取材料来源及部位。采下的标本要注意保湿，冲洗干净后截取大小合适的样品迅速投入固定液中。（注意材料切割形状以便于包埋，尤其植物叶片横纵切面） 2.固定卡诺氏固定液（无水乙醇：冰醋酸=3：1）固定24h，70%酒精保存。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。 3.洗涤与脱水从50％开始→70％→85％→95％→无水乙醇（30min）（此步骤需两遍），每次时间为1～2h；如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存。脱水乙醇的用量为材料体积的3~5倍。无水乙醇中要加入不含结晶水的CaCl2 ；用95%的乙醇配制各级脱水乙醇（原浓度95%,要配浓度y%,则取yml95%乙醇加上95-y=？ml蒸馏水即可）。 4.透明经1/2无水乙醇+1/2二甲苯（氯仿）至纯二甲苯（氯仿）两级透明，每级停留2h。在1/2无水乙醇+1/2二甲苯时加入少量番红干粉。 5.浸蜡在浸入有植物材料的透明剂中投入切成小块的低熔点石蜡，加入石蜡的量溶入透明剂的用石蜡溶液=透明剂体积为原则。用浮石蜡（石蜡放入容器中，水浴熔融，取出石蜡，冷却时不断用玻璃棒搅拌，空气进入，冷却后即为浮石蜡）。加蜡后放有材料的有盖容器放入35℃的温箱中6h或更长时间。之后调高温度至56℃，打开盖子让透明剂蒸发，2h后将石蜡溶液倾去。将植物材料移入高熔点的熔融纯石蜡小烧杯中，2~4h再换一次熔融纯石蜡，2~4h即可进行包埋。 6.包埋、切片和粘片（1）折包埋纸盒；（2）材料包埋：熔融的石蜡到入纸盒中，用在酒精灯上烧热的镊子或解剖针将材料排好（快速，避免石蜡结晶），然后将包埋纸盒放入冷水中冷却凝固。（3）修蜡：每块拉一个材料，双面刀片切开。（4）粘蜡快：2*2*2.5~3cm的长方形木块，长轴一端刻出网格；木块具网格一端浸入已溶化的废石蜡中，蜡块修成下宽上窄的台体，用烧热的解剖针一面贴

石蜡切片技术

植物进化生态研究组技术体系之—— 石蜡切片技术固定 1.切实验材料（在满足实验要求的条件下，尽可能小），置于FAA溶液中（如果材料过大，最好抽气固定至材料沉底）；材料小固定24 h即可，材料大可适当延长时间。FAA固定的材料可放置数月。脱水 2.用配置FAA时同等浓度的酒精来清洗材料（材料小的话，每次20 min，材料大的话可延长至1—2 h，如刺玫瑰花苞的上位腺体与花药每次均清洗1.5h。以下脱水，透明与透蜡每一步的时间都与此相似）； 3.70%，80%，90%%酒精各清洗1次，每次20min； 4.100%酒精清洗两次，每次30min；透明 5.25%二甲苯+75%酒精，50%二甲苯+50%酒精，75%二甲苯+25%酒精各30min， 100%二甲苯30 min，两次；透蜡 6.在纯二甲苯加入约1/4体积的蜡块，2h后放入37度恒温箱中，过夜（此时，把载玻片清洗干净，用蒸馏水泡过后，放在烘箱中至烤干） 7.再加入1/4体积的蜡块，把恒温箱调到42度； 8. 2 h后去掉一半的混合液，再加入1/2蜡块，把恒温箱调到48度； 9. 2 h后更换纯石蜡，恒温箱58度； 10.2 h后更换纯石蜡（可先把包埋模预热）； 11.2 h后再更换纯石蜡，过夜（可把蜡液连同实验材料倒在预热的包埋模内）（此时，把烤干的载玻片用粘片剂处理，可用多聚赖氨酸，用配好的多聚赖氨酸溶液，用移液器滴50 μL左右在一个载玻片一端，然后取另一个载玻片与之轻轻合在一起，使液滴在两个载玻片之间均匀分布，所有玻片都处理后，把一对一对的载玻片放在白瓷盘里，放在烘箱里烤干）；包埋 12.用包埋模包埋（若是倒好的包埋模，用白瓷盘放入约1—2 cm深的凉水或冰

石蜡切片制作过程

（一）材料与用具 1．材料：鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。 2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。（二）实验内容与步骤 1．取材及固定取动物体上的小块组织成为组织块。组织块的大小以不超过 0.5立方厘米为宜。切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。组织块取下后，先用 0.85％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。不同的组织应选用适当的固定液。固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2．冲洗

固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。AFA固定液则不需要水洗。 3．脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30％—→50％—→70％—→80％—→90％—→95％—→100％(Ⅰ)—→100％(Ⅱ)组织块在各级较低浓酒精（小于70％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过 0.5立方厘米的组织块脱水时间为6～12小时，在高浓度酒精中（大于70％）脱水时间为3小时左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15～30分钟左右。在脱水瓶中酒精的量与组织块之比约为50：1。简化步骤如下： 70%（一夜）——80%（1小时）——90%（30分）——95%（30分）——100%（15分）——酒精+二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+二甲苯（30分）——石蜡（80分） 4．透明

石蜡切片步骤

石蜡切片基本步骤（一）取材和固定根据实验目的选择材料。将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。取材大小：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin氏液，10%甲醛等。固定时间：4oC固定24小时。注意事项：取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 2.选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。 3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。 4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。 2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。真空泵抽气或者用空针管抽气。昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。 3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。 4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。 5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。

（二）洗涤 2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10min Bouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。否则会影响以后的染色效果。（三）脱水与透明漂洗后即入酒精脱水，经50%，70%，80%，90%，95%，100%酒精脱水，其中95%，100%酒精需重复两次。每级10min。脱水后，入1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯，每次约10min，至组织透明为止。注意： 1. 一般经水洗的材料脱水可从35%开始，柔弱的材料从15%开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50%或70%酒精中继续脱水。 2. 每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。动物组织每级10~30min。 3. 脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。（四）透蜡透明后，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍3小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍6小时左右，直至用石蜡完全置换了组织块中的二甲苯，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右（60°C）的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。便于今后的包理与切片。

石蜡切片的制作

石蜡切片的制作一：试验目的掌握石蜡切片的制作二：器材和试剂实验动物、手术刀、手术剪、镊子、托盘、标本缸、石蜡切片机、恒温箱、水浴锅、温度计、烧杯、电磁炉、石蜡、包埋纸盒、毛笔、载玻片、盖玻片、中性树胶、染色架、鸡蛋清、甘油、甲醛、各级浓度的酒精(50%、70%、80%、85% 、90%、95%、100%)、二甲苯、苏木精、伊红、盐酸、蒸馏水、30%三氯化铁液。三：试剂配制苏木精染液：甲液：苏木精1g、无水酒精100ml;乙液：30%三氯化铁液4ml、蒸馏水 100ml、盐酸1ml。使用时将甲液、乙液等量混合。伊红染液：伊红1g、95%酒精100ml、冰醋酸1-2滴。 1%盐酸酒精：盐酸1ml、70%酒精99ml。福尔马林：甲醛10ml、蒸馏水90ml。蛋白甘油1:1配制四：实验步骤 1.取材和固定处死实验动物，迅速取出所需的组织，清洗干净放入福尔马林中固定，12h后换福尔马林。注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。（3）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的标本缸里，同时在容器外上标签。标签上注明固定液、材料来源、日期等。 ⑷如需清洗的材料可用生理盐水轻轻擦洗。 2.清洗材料固定后，用清水清洗4小时 2.脱水： 50%酒精12h,在依次经70%、85%、95%、100%各级酒精溶液脱水1-2h。注意事项： (1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分和酒精挥发。 (2)在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。

石蜡切片技术

石蜡切片制备技术活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。石蜡切片法是将组织经过一系列药品处理，使石蜡渗入组织，包埋成蜡块，再把组织蜡块切成极薄的片子，根据不同的需要用不同的染色方法以显示不同细胞和组织的形态，以及细胞和组织中某些化学或特殊（如抗原）成份含量的变化。一、所需器材及试剂 1，器材切片刀，切片机，恒温箱，熔蜡炉，蜡杯，酒精灯，蜡铲，铺片台，冷冻台，解剖刀，镊子，台木，毛笔，染色缸，盖玻片，载玻片，中性树胶，显微镜。 2，试剂各种浓度的酒精（70%、80%、90%、95%、100%）、二甲苯、石蜡、苏木精染液，0.5%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液等。二、石蜡切片制备过程 1，取材采集病料要及时，以防组织变质发生自溶。病理组织材料要采取病变典型突出的部分，最好选病变与健康组织的交界处，以识别和探讨病变的发生和发展。 2，固定采集样品在滤纸上吸干后迅速放入4％甲醛溶液中固定七天以上，使组织细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞原来的形态结构。 3，洗涤切取约1cm×1cm×0.3mm固定好的组织，放入带盖的网槽中用自来水冲洗过夜，调节流量使水从底部缓慢流出。 4，脱水透明组织经固定和水洗后含多量水分，水与透明剂、石蜡不能溶合，因此，在透明、浸蜡前必须进行脱水，把组织中的水份彻底驱除。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行。为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，而达到石蜡浸入组织块的目的。常用透明剂：二甲苯。具体流程如下：

植物组织石蜡切片制作

植物组织石蜡切片的制作一、实验目的 1．熟练掌握石蜡切片的方法。 2．掌握永久制片的制作过程，为研究植物的内部结构奠定基础。 3．学会植物内部结构的比较研究方法。二、实验器具与试剂 1．器具石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2．试剂 10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。三、实验材料幼嫩植物各部分，根据季节选择材料。四、实验内容与方法石蜡切片法是显微技术上最重要、最常用的一种方法。它是把材料封埋在石蜡里面，用旋转切片机切片，可以切出很薄的切片。凡是精细的工结构，大都用石蜡切片。全都过程如下：1．固定 2．洗涤 3．脱水与硬化 4．脱酒精 2．封埋 6．切片 7．粘片 8．脱蜡 9．染色 10．脱水 11. 透明 12．胶封（一）固定 1．固定的意义：固定就是用药品把细胞杀死，使细胞的原生质凝固，死后不发生变化，尽可能保持原来的结构以供我们观察。良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。 2．固定液的种类：固定液的种类很多，根据配制成分可划分为： (1) 简单固定液：以一种化学药品配制的固定液。常用的简单固定液有： A．酒精即乙醇，用作固定液，常用纯酒精或95％酒精。酒精穿透力强，固定时间常在1小时以内。高浓度酒精有使材料收缩的作用。70％的酒精可作保存液。配制低度酒精必需要用普通酒精即95％的酒精，绝不可用纯酒精。酒精为还原剂，不能与铬酸、锇酸、重铬酸钾等氧化剂配合。酒精可使核酸，蛋白质及肝醣等发生沉淀，但能溶解脂肪及拟脂。 B．福尔马林即甲醛，具强烈刺激性的气味，纯净的甲醛，为无色透明液体。固定用的浓度为4-10％甲醛也是强还原剂。不能与铬酸、锇酸等氧化剂配合。经固定后，材料变硬，通常不引起皱缩，但随后经过他种药剂处理时，就每每出现皱缩。所以甲醛一般不单独作固定，而与其他液体混合使用。 C．醋酸：为无色透明的液体，刺激性极强，冷则凝结成冰，故又叫冰醋酸。醋酸以与水和酒精配成各种比例的溶液，所用浓度为0.2～5％，也常与其他固定剂配合使用。醋酸穿透性很强，单独使用，有使原生质膨胀的作用，故常与酒精，甲醛等合用，醋酸为固定染色体的优良固定液，因此固定染色体的固定液中，几乎都含有醋酸。 (2) 混合固定液：由几种药剂，适量配制而成。常用的有下列几种： A、F.A.A固定液(又称万能固定液)： [用途]这个固定液在植物研究上，应用最多，为植物组织最常用的固定液。固定时间，不受