Westernblot基本操作步骤

Western b l o t 基本操作步骤

一、细胞蛋白的提取

弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液(含1mM PMSF(100 )，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250卩,1 60mnt< 15mm培养皿

300-400 Z),于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4Xloading buffer , 10Meducing ,再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后

再离心后准备上样。

二、BCA 法测蛋白浓度操作步骤

将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准( BSA),配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10卩l分装，-20 C冷冻保存。

完全溶解蛋白标准品，取10卩1用PBS稀释至100^1使终浓度为ml。

据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA 工作液室温24 小时内稳定。

将标准品按0, 1,2, 4, 8, 12, 16, 20 加到06孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20^1

加适当体积样品到96孔板的样品孔中(可以通过预实验摸索稀释倍数)，加PBS到20卩1 各孔加入100 0 l BCA工作液，37 C放置30分钟。

测定580nm 条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

三、Western blot基本操作步骤

1 、溶液配制：

①Runnig Buffer(1 关SDS Runnig Buffer (20x) 50mL，力口MiliQ 水至1L ;

②Transfer Buffer(1 ):^ransfer Buffer(10 )100mL,甲醇200mL( 20% ,v/v)，加MiliQ 水至1L ;

③TBST缓冲液

1M Tris HCI (): 60.5g Tris-base,加入约30ml 浓盐酸，调PH 至，力口MiliQ 水至500ml。

TBS 缓冲液(10 X : 1M Tris HCl 100ml+80g NaCl 力口MiliQ 水1L

TBST 缓冲液(1 X : TBS 缓冲液(10 X 100ml+ Tween-20 (%, v/v),力口MiliQ 水至1L。

④封闭液：5% BSA (5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解)

2、样品准备与加样

①用4XSDS loading buffer, 10 reXducing 与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。

②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1 X内槽加入抗氧化剂，小

心拔下梳子；

③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品(总蛋白量20 ^g以上)。向marker孔中加入卩marker (按照实验要求设定marker量)，向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同(或相近) 的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。

3、电泳

将电泳装置与电源连接。调节电压为100-200V，电泳50min，直至溴酚兰接近分离胶

的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线。

拆除电泳装置: 先倒掉电泳缓冲液，连同槽一起将凝胶夹层取出，小心的撬起凝胶外层塑料板，使凝胶暴露出来，切去浓缩胶以及无蛋白样品的凝胶部分 (将胶留在短的一面塑料板上)。

4、转膜(湿转)

①将转膜液(1 xTransfer Buffer)放于大饭盒内，泡4片海绵，剪4片滤纸、1片PVDF膜，PVDF膜于甲醇中活化30s,取出置于转膜液中；

②按照2层海绵+2 层滤纸+胶+膜+2层滤纸+5层海绵（填满）的顺序组装转膜装置，注意组装此装

置时一定要保证滤纸、膜、凝胶精确对齐并不留气泡；

③将组装好的装置放入电转槽，合上盖子，电转槽置于冰浴，接通电源，调节电压为15V , 时间为16~18h （或恒流300mA, 3h ）。显示红灯亮后，按下Start后，开始转膜。

转膜方向为蛋白从负极（黑色）转向正极（红色）。

5、免疫印迹反应及化学发光检测

转膜完毕后，根据目的蛋白分子量将膜剪成不同的条带，用封闭液（5% BSA ）室温封

闭2h。弃封闭液，加入用新的封闭液稀释的一抗（可回收），室温2h或4C过夜。用TBST 清洗 3 次，10min/ 次。

二抗（可回收）室温孵育 1 小时，室温1xTBST 洗涤3次，每次约10 min。

此步开始避光操作：将膜浸入化学发光底物工作液（A液：B液=1:1，终体积即可）中，

显色 2 分钟，放入BIO-RAD 凝胶成像系统中显影。

内参分子量：3-actin : 42 kDa

GAPDH ：36 kDa

Tubulin: 51kDa