梅毒常见实验室诊断方法及其进展

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梅毒常见实验室诊断方法及其进展

文字表述：关键词：　梅毒　血清学诊断　合成抗原　

摘要　近年来梅毒的发病率有逐年增加的趋势、研究新的快速、价廉、简便、敏感且特异的诊断方法是当前主要研究热点，而设计新试剂盒的关键在于，对现有试剂盒优、缺点的认识和改良，利用人工合成梅毒螺旋体原设计出新的检测方法。对梅毒螺旋体抗原的分析及人工合成，国外早在１９８９年就已开始进行，几年来发展迅速，目前已有各种针对不同需要的试剂盒。

目前虽然各国之间梅毒流行的情况送别很大，但它依旧是十分重要的社会和医学问题［１］。近年来，大多数欧洲国家梅毒发病率显著下降，已小于２／１０万。但在前苏联国家中，梅毒的发病率却显著上升，如俄罗斯梅毒的发病率大于３２／１０万［２］。即使在美国，在特定的种族人群中梅毒的发病率依然很高［３］。在我国，梅毒的发病率逐年增多，所以研究新的快速、价廉、简便、敏感且特异的诊断方法，对该病的防治有着重要的意义。现对目前已有诊断方法的优缺点，以及最新诊断方法作一综述。

梅毒常用诊断方法

（一）检查梅毒螺旋体：可用病损处的渗出液进行暗视野、涂片银染色、免疫荧光染色、家兔感

染试验（ＲＩＴ）或ＰＣＲ法检测，以及用酶免疫法（ＥＩＡ）理论设计的，利用单克隆抗体检验梅毒螺旋体的方法，如Ｖｉｓｕｗｅｌｌ试验［４］。①暗视野显微镜检查由于对取材、检查技术要求较高；并且在口腔及肛门部位有口腔螺旋体、大齿密螺旋体、小齿密螺旋体及生殖器螺旋体等其他条件致病螺旋体存在，暗视野检查时不易与它们区分；此外梅毒螺旋体本身很脆弱，容易受外界条件如服用过抗生素、病损处外用一些化学药物等的影响，该方法敏感性较低，所以暗视野检查阳性也不能排除梅毒的可能性。但由于它特异性很高，经过训练的检验人员在暗视野显微镜下看到形态典型的梅毒螺旋体，结合临床症状即可作出早期诊断。②镀银染色法检查螺旋体，适用于缺乏暗神显微镜的基层单位。③免疫荧光染色是用抗梅毒螺旋体抗血清或单克隆抗体，加非致病性螺旋体培养物进行吸收，再与异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）相结合，用此方法来染梅毒螺旋体，在荧光显微镜下读结果，阳性者可见绿色荧光螺旋体，其优点是可区分梅毒螺旋体与其他条件致病性螺旋体，对口腔、肛门等部位的损害有鉴别价值，且敏感性亦有所提高。④ＲＩＴ是利用家兔对梅毒螺旋体的易感性，把梅毒螺旋体注射于成年新西兰白兔睾丸内，观察有无感染亦象。ＲＩＴ是经典的梅毒诊断方法，由于其费用高、检查时间长等弊病目前仅用于科学研究。⑤ＰＣＲ法是较新的方法，它能对生殖器溃疡早期鉴别诊断，区分梅毒、生殖器疱疹及软下疳［５］。它可分为ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ，ＰＣＲ的设计主要针对编码梅毒螺旋本特异性抗原和ＴｐＮ４７（Ｔｐｐ４７）的ＤＮＡ开放编码区，常见的引物设计见附表。

由于在ＰＣＲ中会偶然出现非特异的ＰＣＲ产物而干扰结果，这就必须用特异性的ＤＮＡ探针进行ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交来提高ＰＣＲ的特异性及敏感性。此外用ＴｐＮ４７设计的ＰＣＲ，由于ＴｐＮ４７的保守性，雅司螺旋体可产生类似的ＰＣＲ产物，所以这种设计的ＰＣＲ不能区分梅毒和雅司；但可以区分梅毒螺旋体和引博氏疏螺旋体，这就可以解决梅毒与莱姆病之间血清诊断中的免疫交叉问题［６］。另一种是ＲＴ－ＰＣＲ，常见的设计是针对梅毒螺旋体的１６ｓ　ｒＲＮＡ　３６６ｂｐ片段［７］，这种方法污染少，特异性敏感性高，但价格稍高。ＰＣＲ在梅毒持续感染中的诊断价值目前尚无一致意见，理论上ＰＣＲ可查出死亡的ＴＰ，所以治疗后ＰＣＲ阳性并不意味着治疗失败，但死亡的ＴＰ从机体内清除较快（１５～３０天），而存活的ＴＰ从机体内清除至少需１２０

天，所以治疗数周后ＰＣＲ阳性意味着持续感染的可能［８］。　

附表：针对编码梅毒螺旋４７－ｋＤ抗原基因设计的常用引物起莱姆病的

引物名　引物序列　产物　

ＫＯ３Ａ　５＆ａｃｕｔｅ；－ＧＡＡＧＴＴＴＧＴＣＣＣＡＧＴＴＧＣＧＧＴＴ（５３７－５５９）　２６１ｂｐ　

ＫＯ４　５＆ａｃｕｔｅ；－ＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＴＴＴＣＡ（７９７－７７６）

４７－１　５＆ａｃｕｔｅ；－ＧＡＣＡＡＴＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＡＴＡＧＴ（６４８－６６９）　６５８ｂｐ　

４７－２　３＆ａｃｕｔｅ；－ＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧＡＴＴＣＣＴＴＧ（１２８４－１３０５）

４７－３　５＆ａｃｕｔｅ；－ＴＴＧＴＧＧＴＡＧＡＣＡＣＧＧＴＧＧＧＴＡＣ　４９６ｂｐ　

４７－４　３＆ａｃｕｔｅ；－ＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＴ（１１８７－１２０８）

（二）梅毒血清试验：梅毒螺旋体感染机体后可产生两种抗体，一种是抗心磷脂抗体，即非特异性抗体，亦称反应素，主要方法有性病研究实验室试验（ＶＤＲＩ）、血清不需加热的反应素试验（ＵＳＲ）和快速血浆反应素环状卡片试验（ＲＰＲ）以及Ｃａｐｔｕｒｅ－Ｓ试验——一种非螺旋体抗体因相红细胞吸附试验［９］。这种抗体滴度与梅毒活动有关，临床上主要用于观察疗效，复发及再感染。另一种是抗梅螺旋体抗体，即特异性抗体，主要有ＩｇＭ和ＩｇＧ检测方法有荧光螺旋抗体吸收试验（ＦＴＡ－ＡＢＳ）及梅毒螺旋体血凝试验（ＴＰＨＡ），以及利用螺旋体天然抗体原依照ＥＩＡ原理设计的Ｃａｐｔｉａ　ｓｅｌｅｃｔ　Ｓｙｐｈ－Ｇ试验［１０］，和新近出现的利用梅毒螺旋体合成抗原（ＴｐＨ１５、ＴｐＮ１７、ＴｐＮ４７）设计的ＩＣＥ　ｓｙｐｈｉｌｉｓ　ＥＩＡ试验和Ｓｙｐｈｉｌｉｓ　Ｆａｓｔ试验［１２］。这些方法一般用于梅毒的确认试验，由于检测的是抗梅毒螺旋体ＩｇＧ抗体，所以即使患者经足够的抗梅毒治疗，血清反应仍保持阳性。而近年来发展的检测抗梅毒螺旋

体ＩｇＭ抗体，却能早期诊断及判断疗效。主要方法有：①１９Ｓ－ＩｇＭ－荧光抗体吸收试验

（１９Ｓ－ＩｇＭ－ＦＴＡ－ＡＢＳ）：先用高压液相色谱或其他方法分离标本中的ＩｇＭ，然后再做ＦＴＡ－ＡＢＳ，其特异性与敏感性均很高，但价格昂贵不易推广。②ＩｇＭ固相血凝试验（ＩｇＭ－ＳＰＨＡ）和梅毒螺旋体特异性ＩｇＭ血凝试验（ＴＰ－ＩｇＭ－ＨＡ）均是对现有方法的改良，要求事先分离ＩｇＭ抗体。③梅毒特异性ＩｇＭ抗体捕

捉ＥＬＩＳＡ试验（ＩｇＭ－ＣＡＰ－ＥＬＩＳＡ）［１３］：此方法是利用间接ＥＬＩＳＡ的原理，扰抗人ＩｇＭ单抗包被在微量滴定板或其它固相载体上，加入待检血清以捕捉其中的ＩｇＭ，再先后加入超声粉碎或基因重组获得的梅毒螺旋体抗原、生物素标记的抗梅毒螺旋体单抗、辣根过氧化物酶标记的链亲和素及底物，最后通过显色判定结果。④ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及免疫印迹法：把梅毒螺旋体溶解后的悬液或Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ－１１４提取液，点于ＳＤＳ－多聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳后转移至硝酸纤维膜上，分别加入等检血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗人ＩｇＭ或ＩｇＧ抗体、底物４－氯萘酚，当出现７２、４７、４５、４２、３７、１７、１５ｋＤ中的一条或多条显色带即判定为阳性［１４］。由于梅毒感染后血循环中首先产生的是ＩｇＭ抗体，并且ＩｇＭ抗体不能通过胎盘，而且梅毒患者抗ＴＰＩｇＭ抗体的出现与梅毒的复发再感染或活动性有关，所以ＩｇＭ抗体检测试验是早期梅毒、胎传梅毒诊断和疗效观察的十分敏感和特异的方法，通过检测抗ＴＰ　ｉｇＭ抗体可提示是梅毒活动还是静止以及是否需要治疗等。

既往设计的酶联免疫试剂盒采用的是梅毒螺旋体Ｎｉｃｈｏｌ株的天然提纯抗原，如Ｓｅｌｅｃｔ　ｓｙｐｈ－Ｃ。这种试验的缺点在于天然提纯抗原成分复杂，并且不能非常快速地得到结果，所以用分子克隆技术，人工合成梅毒螺旋体抗原是设计新试剂盒的关键，因为它能克服制备天然抗原时不可避免的兔蛋白污染，并且成分清晰固定，而且可以利用ＥＬＩＳＡ的全自动化、金标纸片法的快速化设计成各种试剂盒。

ＴＰ抗原的人工合成

早在１９８９年，Ｉｓｓａｃｓ等［１５］就提出了人工合成梅毒螺旋体抗原进行梅毒血清学诊断的设想。同年Ｉｊｅｓｓｅｌｍｕｉｄｅｎ等［１６］就合成了ＴｐＮ４４．５（ＴｍｐＡ）用于酶联免疫法检测梅毒，他们检验了９３８供血者血标本，１４８例未经治疗的梅毒患者，１６７例已经治疗的梅毒患者，１９０例性病门诊非梅毒患者，发现该方法特异性为９９．６％，对一期梅毒的敏感性为７６％、二期梅毒１００％、早期潜伏梅毒９８％。１９９５年Ｚｒｅｉｎ

等［１７］合成了ＴｐＮ１５和ＴｐＮ４７用于酶免疫法检测梅毒，他们对１８２２例标本进行检测，发现该方法特异性达９９．８％，敏感性接近１００％。１９９６年Ｇｅｒｂｅｒ等［１８］对梅毒螺旋体抗原进行了较为全面的研究，他们

用ＰＣＲ法扩增了编码梅毒螺旋体抗原的ＤＮＡ，并插入大肠杆菌中使其表达，产生了ＴｐＮ１７、ＴｐＮ２９－３５（ＴｐＤ）、ＴｐＮ４４．５（ＴｍｐＡ）ＴｐＮ４７、ＴｐＮ３５以及ＴｐＮ３９梅毒螺旋体抗原，并应用酶联免疫吸附试验对合成的抗原进行检测，结果发现ＴｐＮ１７、ＴｐＮ４７和ＴｐＮ４４．５的抗体滴度最高，而且这３种抗原联合起来的敏感性要比单一任何一种抗原的敏感性要高，并且与莱姆病螺旋体无交叉反应。１９９７年Ｆｕｊｉｍｕｒａ等［１９］也合成了分子量为１７ｋＤ、１５ｋＤ、４７ｋＤ、４２ｋＤ的梅毒螺旋体抗原，并用Ｍ代表成熟抗原、Ｓ代表含有目的序列的抗原、Ｇ代表谷胱甘肽－Ｓ转移酶融合抗原。他们发现Ｍ４７、Ｓ４２的表达水平较高，而Ｍ１５、Ｍ１７的表达水平很低，但Ｇ１５、Ｇ１７的表达水平很高，这使得用层析提纯法能获得大于９５％的提纯抗原，他们用ＥＬＩＳＡ法以１∶１０００稀释的血清检测这些提纯的抗原（Ｇ１７、Ｇ１５、Ｍ４７、Ｓ４２）发现Ｇ１７抗原的敏感性最高。同年Ｃｅｎｔｕｒｉｏｎ等［２０］对梅毒１５ｋＤ抗原的研究发现，ＴｐＮ１５的保守性很强，在梅毒螺旋体各株中，如Ｎｉｃｈｏｌ株、Ｂａｌ－３株、Ｇａｕｔｈｉｅｒ株、Ｂｏｓｎｉａ株以及Ｃｕｎｉｃｕｌｉ　ａ、Ｈ、Ｋ株，编码１５ｋＤ抗原的ＤＮＡ序列没有明显变异，并且各株梅毒螺旋体增色表达该抗原，这说明１５ｋＤ抗原的变异很少。综合以上对梅毒螺旋体抗原的研究，发现ＴｐＮ１５、ＴｐＮ１７、ＴｐＮ４４．５、ＴｐＮ４７的抗原性最强，并且综合抗原的敏感性和特异性比单一抗原更优越。

１９９８年Ｙｏｕｎｇ合成了ＴｐＮ１５、ＴｐＮ１７和ＴｐＮ４７，并设计了快速诊断试剂盒Ｓｙｐｈｉｌｉｓ　ｆａｓｔ［１３］和自动化程度很高的ＩＣＥ　Ｓｙｐｈｉｌｉｓ［１２］试剂盒。Ｓｙｐｈｉｌｉｓ　ｆａｓｔ是将３种合成抗原包被在乳胶颗粒上，当与含

有梅毒抗体的血清混合后，可在３分钟内产生肉眼可见的凝集，如果血清中没有抗体，乳胶颗粒将保持均质状。如果血清产生凝集则需要做重复试验，重复试验中血清首先与含有合成抗原（与包被抗原一样）的试剂预孵育１分钟，然后加入抗原包被的乳胶颗粒，混合后静置３分钟，如果没有凝集则说明血清中有梅毒抗体存在，而凝集现象被预孵育中的合成抗原抑制了；如果产生凝集则说明血清中没有梅毒抗体，第一次试验中的凝集现象不是由梅毒抗体产生的。这种试验简单、快速并且敏感性、特异性均很高，用Ｓｙｐｈｉｌｉｓ　ｆａｓｔ、Ｓｅｌｅｃｔ　Ｓｙｐｈ－Ｇ、ＶＤＲＬ、ＴＰＨＡ和ＦＴＡ－ＡＢＳ，以平行配对法检测１６１７例血清标本，结果发现Ｓｙｐｈｉｌｉｓ　ｆａｓｔ的特异性达９９．９％，与Ｓｅｌｅｃｔ　Ｓｙｐｈ－Ｇ的特异性９９．５％和ＶＤＲＬ的特异性９９．４％相比有统计学差异（Ｐ＜０．０２），而Ｓｙｐｈｉｌｉｓ　ｆａｓｔ　９５．６％的敏感性与ＴＰＨＡ和ＦＴＡ－ＡＢＳ相比统计学差异。Ｓｙｐｈｉｌｉｓ　Ｆａｓｔ和Ｓｅｌｅｃｔ　ｓｙｐｈ－Ｇ对未治疗的梅毒感染的敏感性均很高为９６．８％，ＶＤＲＬ对未治疗的早期梅毒感染的敏感性也达９２．３％，但对未治疗的晚期梅毒感染的敏感性仅为３０．８％，而Ｓｙｐｈｉｌｉｓｆａｓｔ和Ｓｅｌｃｅｔ　Ｓｙｐｈ－Ｇ对检测已治疗的梅毒，包括晚期梅毒的敏感性也高达９５．７％。所以该方法可替代ＲＰＲ、ＶＤＲＬ进行梅毒的初筛，并能克服心磷脂试验中的前带现象。

ＩＣＥ　Ｓｙｐｈｉｌｉｓ是基于ＥＩＡ原理设计的试验，由于ＥＩＡ试验自动化程度高、结果客观、能够减少主观操作失误，所以适用于大量标本的筛查。ＩＣＥ　ｓｙｐｈｉｌｉｓ的原理是用合成的３种梅毒抗原包被于微孔板上，同时包被在微孔板中的还有抗人ＩｇＧ、ＩｇＭ抗体，并用过氧化物酶标记的合成抗原（ＴｐＮ１５、ＴｐＮ１７、ＴｐＮ４７）检测被捕捉的抗梅毒螺旋体抗体。该方法总的敏感性拉近１００％，而Ｓｅｌｅｃｔ　ｓｙｐｈ－Ｇ的敏感性为９２．４％、ＴＰＨＡ　９７．１％、ＦＴＡ－ＡＳＢ　９２．４％、ＶＤＲＬ仅为３７．５％，此外由于梅毒合并ＨＩＶ感染的出现，可以使血清中的梅毒抗体水平很低，而ＩＣＥ　ｓｙｐｈｉｌｉｓ的抗体指数（血清吸光值／ｃｕｔ　ｏｆｆ值）比Ｓｅｌｅｃｔ

Ｓｙｐｈ－Ｇ的高（Ｐ＜０．００１），这意味着ＩＣＥ　ｓｙｐｈｉｌｉｓ更敏感，所以虽然原理一样，但ＩＣＥ　Ｓｙｐｈｉｌｉｓ用合成抗原要比Ｓｅｌｅｃｔ　ｓｙｐｈ－Ｇ用天然抗原更具优越性，而且９９．８％的特异性、对已治疗患者和晚期梅毒患者的高度敏感性，使该方法适用于各种医疗机构。

目前梅毒检测方法的发展突飞猛进，有针对基层医疗单位的快速、简便的试剂盒，也有针对专门医疗机构，如血站、性病防治机构等每天需要检测大量标本的自动化程度很高的试剂盒。而国外进口的试剂价格昂贵，为了适应中国国情，必须加强试剂的国产化，以期降低成本。这方面有许多工作要做，而低成本合成梅毒螺旋体抗原是关键。

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２０　Ｃｅｎｔｕｒｉｏｎ－Ｌａｒａ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ，１９９７；６５（４）：１４４０－１４４４

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