参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定
参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定
蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的
软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。
每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。
（本实验以酵母为原料）
一、教学目的
通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、
过程和方法。
本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。
二、教学内容
实验设计：包括讲课，答疑，文献综述6学时
实验一酵母细胞破碎与蔗糖酶提取条件的选择8学时
实验二蔗糖酶的盐析曲线的制作与沉淀分离8学时
实验三蔗糖酶的有机溶剂沉淀曲线的制作与沉淀分离8学时
实验四蔗糖酶的DEAE-纤维素柱层析纯化8学时
实验五蔗糖酶的Sephadex G-150柱层析纯化8学时
实验六蔗糖酶溶液的冷冻干燥2学时
实验七蔗糖酶的纯度分析：聚丙烯酰胺凝胶电泳8学时
实验八蔗糖酶的理化性质研究8学时
三、实验设计与研究
1 器材与方法
1.1主要单元操作技术与设备
1.1.2单元操作技术
细胞组织破碎术、离心分离技术、双水相萃取技术、离子交换层析技术、凝胶层析技术、超滤技术、冷冻干燥技术、分光光度技术、电泳技术等生物分离与检测技术；
1.1.2主要设备
烘箱、恒温摇床、真空干燥箱、分析天平、电子台秤、超声波细胞破碎仪、粉碎机、超滤器（500ml～5000ml）、冷冻离心机（8000-10000 r/min，50ml×6；250ml×6）、普通离心机（5000 r/min，200ml×4）、台式离心机（16000 r/min,5ml×6）冷冻干燥机、-80度冰箱、制冰机、酸度计、电热恒温水浴锅、匀浆机、蛋白质色谱分离系统（核酸蛋白检测仪、部分收集器、蠕动泵、梯度混合器、φ10-25mm,h300-700mm层析柱）电泳仪及垂直板电泳槽、脱色摇床、紫外-可见光分光光度计、荧光分光光度计、高效液相色谱、气相色谱、凝胶成像系统、250ml和500ml旋转蒸发仪、微量凯氏定氮仪、常量凯氏定氮仪、500-1000W电炉、超声波清洗器、振动混合器、移夜枪（200-5000ul）、层析缸、电吹风等。
1. 2 实验材料与试剂
1.2.1酵母菌的扩大培养：采用采用实验室经过筛选诱变获得的酵母菌,
增殖培养基：葡萄糖5.0g/L、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L、七水硫酸镁0.1g/L 和磷酸二氢钾0.1g/L，调节pH 为5.0。
发酵培养基：葡萄糖12％～15％、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L，七水硫酸镁
0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L 和硫酸铵0.5g/L，调节pH为5.0。
1.2.2实验试剂
甲苯（使用前预冷到0℃以下）；95%乙醇；DEAE-纤维素；Sephadex G-150；0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.3 ；十二烷基硫酸钠(SDS);其余试剂均为国产分析纯。
1. 2 分析方法
1.2.1蛋白质浓度的测定：
采用Folin法（试剂方法参考生物化学原理和方法）。
1.2.2还原糖的测定：
采用DNS法（试剂方法参考生物化学原理和方法）。
1.2.3酶活性测定（参考：徐桦,陆珊华,孙爱民.酵母蔗糖酶Km值的测定[J ].南京医科大学学报,1999,17(4):329-330）
取适当稀释的酶液0.5mL,加入0.3 mLpH4.6、0.1mol/L的NaAc-HAc 缓冲液,0.2mL 0.1mol/L的蔗糖,37℃准确反应15min,后加0.125mL1mol/L的NaOH中止反应。用DNS法在540nm波长下测定形成的还原糖量。在测定条件下以每分钟内能水解蔗糖成还原糖,经DNS测定光吸收读数为1 mA 所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
1.2.4 蔗糖酶的纯度分析：
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（试剂方法参考生物化学原理和方法）
2酵母蔗糖酶的提取纯化工艺
酵母蔗糖酶的提取纯化工艺流程图
2.1粗酶制备（蔗糖酶的提取）
目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，常用方法有甲苯研磨（自溶）法、冻融研磨法、SDS 抽提法等。其中甲苯自溶法耗时长，效率低，目前很少使用。
2.1.1甲苯自溶法
称取酵母泥50g,加入20mL双蒸水使其溶解,加入5g NaAc和10m甲苯,摇床振荡
10min ,37℃恒温水浴48h。再加入10mL 4 mol/L的HAc和15mL双蒸水,调pH至4.5,于4℃、3000 r/min 离心30 min ,离心后将中层清液移出即为粗制酶液,4℃保存。
2.1.2甲苯研磨法
①取50酵母泥（准确称量），加10g石英砂，加蒸馏水20ml，研磨5min,，加20mL 甲苯，继续研磨10分钟左右，共3次，使其呈糊状。
②将研磨好的内容物转移到50mL离心管中，平衡后以10000rpm离心15分钟。
③用吸管小心将离心后的中间水层转移到干净的离心管中，勿带上层甲苯相，然后以10，000rpm离心15分钟。
④将3步离心后的上清夜取出，倒入量筒中记录其体积，留下1.5mL作为第一组分粗抽提液以备酶活力测定和蛋白浓度测定。
2.1.3冻融研磨法
称取酵母泥50g ,加入20mL双蒸水 ,置于预先冷却的研钵中,研磨25min ,冰箱中冷冻约15min(以研磨内液面上刚出现冻结为宜),取出再研磨25min ,重复以上步骤两次。后置于冰箱中冷冻3h取出,温浴融化,用1 mol/L的HAc调pH至5.0,40℃水浴30min,冷却后4℃、10000r/min 离心15min,取上清液即为粗制酶液,4℃保存。
2.1.4 SDS抽提法称取酵母泥50g,加入50mL0.3mmol/L的SDS溶解, 40℃水浴10 h后取出 ,4℃、10000 r/ min离心15 min ,取上清液即为粗制酶液,4℃保存。
2.1.5超声波细胞破碎
频率超过15～20kHz的超声波，在较高的输入功率下(100～250W)可破碎细胞。其工作原理是：超声波细胞破碎机由超声波发生器和换能器两个部分组成。超声波发生器(电源)，是将220V、50Hz的单相电通过变频器件变为20～25Hz、约600V的交变电能，并以适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械振动，振动波通过浸入在样品中
的钛合金变幅杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。
细胞破碎过程中，用于分析细胞破碎率的检测技术对于细胞破碎效果的评估、破碎
工艺的选择、工艺放大和工艺条件优化等起着非常重要的作用。最常用的检测细胞破碎
效果的方法是通过显微镜直接观察，如用革兰氏染色法，也可以通过测定核酸与蛋白质
的含量判断细胞破碎率。
正交试验法是研究与处理多因素试验的—种实验设计方法，它可以利用规格化的正交表通过整体设计、综合比较和统计分析，能在很多的试验条件中选出代表性强的少数条件，并能通过较少次数的试验找到较好的实验条件，即最优或较优的方案。在生产实践和科学研究中对于因素多、周期长、有误差的—类试验问题，正交试验法的效果尤其显著。关于正交实验法的书籍目前比版很多，这里不再叙述。本实验应用正交试验法选择酵母细胞超声破碎的最佳实验条件。
本实验要求考察的有三个因素即细胞浓度、超声能量和破碎时间，每个因素有四个位级（或称水平）。现综合成一张因素位级表如下：
如果每个因素各个位级的所有组合都做试验，要做43=64次。为了使试验次数减少而又能得到较好的结果，需要选用合适的正交表。
现有正交表L16（45），能安排5个4位级的因素，只需做16次试验。本实验中有3个4位级的因素，所以可以选用此表来安排试验。如果不考虑因素之间的交互作用，进行表头设计时，则把因素A、B、C分别放入正交表L16（45）的第5、2和1列上。
2.2沉淀分离
2.2.1 盐析沉淀
盐析曲线的制作：
a.取7支干净试管编号1～7，分别加入粗酶液5 ml；
b.分别向1～5号试管中加入饱和硫酸铵1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，然后再分别加入蒸馏水4 ml、3 ml、2 ml 、1 ml、0 ml；分别向6号、7号试管中加先入固体硫酸铵0.66g和1.37g，再加饱和硫酸铵5 ml，充分摇晃溶解完全后，每管各取5ml×2混匀的溶液装入7ml×2离心管中，对应编号1、1/～7、7/，静置1h以上，对称放入离心机中，10000 r/min ，离心10min，弃去上清液，收集沉淀。
c.向收集的沉淀加入5 ml 0.1mol/L（pH7.0）缓冲溶液溶解沉淀物；
d.采用Folin法测定各管中蛋白质的浓度，采用DNS测定还原糖。
e.以硫酸铵饱和度为横坐标，蛋白质浓度和酶活力的含量为纵坐标作图，得到蛋白质盐析曲线和酶活力盐析曲线。
盐析制备蔗糖酶
①根据盐析曲线选择硫酸铵饱和度(30～40%饱和度)去除杂质，选择硫酸铵饱和度(约60%饱和度)沉淀酶蛋白。并计算每升溶液达到30～40%饱和度和60%饱和度所需要的固体硫酸铵的量（g），根据酶蛋白粗提液的体积计算30～40%饱和度和60%饱和度时实际所需要的固体硫酸铵的量（g）。
②在酶蛋白粗提液中加入经研细的(NH
4)
2
SO
4
粉末 ,使其达到30～40%饱和度,充分溶
解后,4℃，10000r/min ,离心20 min ,除去沉淀。收集上清夜。
③继续向上清液中加入(NH
4)
2
SO
4
粉末，使其达到 60 %饱和度 ,充分溶解后，4℃，
10000 r/min ,离心 20 min ,弃去上清液，收集沉淀。
④-I将沉淀溶于少量缓冲溶液中 ,充分混均 ,4 ℃透析约12 h后,进一步纯化。（取5mL用于蛋白含量测定和纯度分析）
2.2.2乙醇沉淀
乙醇沉淀曲线的制备：方法同盐析曲线的制作
乙醇沉淀：在细胞破碎的粗制酶液中加入乙醇使其质量分数达 30%, 4℃放置过
夜,4℃，10000 r/ min 离心20min ,取上清液 ,再追加乙醇使其终质量分数达 50 %。4 ℃放置 1 h ,4℃、10000r/ min 离心 20 min ,弃上清液 ,沉淀用蒸水溶解,4℃保存，必要时透析。（pH值为7.0的0.05mol／L Tris-HCl缓冲液）。
2.3层析分离
2.3.1 DEAE-纤维素柱层析
DEAE-纤维素( DE 52) 经常规处理后,装柱( 100mm×10mm) , 用起始缓冲液
0.05MTris-HCl pH7.3缓冲液平衡, 调节流速为每2min 1mL,按照3-5%的床体积加样, 先用0.05MTris-HCl缓冲液洗脱,然后盐度梯度洗脱,由0.05MTris-HClpH7.3 缓冲液到
0.1MNaCl的0.05MTr is-HClpH7.3 缓冲液, 每管收集3mL, 约120min 流动相，在280nm处进行紫外检测，获得洗脱曲线，同时测定峰管的酶活力，将最高酶活力的若干管酶液集中，分装后低温保存，用于性质测定。留2 mL酶液测酶活和蛋白含量。
2.3.2 Sephadex G-150柱层析
选用φ15×600～800mm Sephadex G-150层析柱，加样量为 3～5mL （约含蛋白100mg）用 20mmol/L （pH为7.0 ）的缓冲液进行洗脱，洗脱速度可控制为 0.5～1.0mL/min，每管收集3ml，约25～30管，各管可用 A
的紫外线进行检测，获得洗脱曲线，同时测定峰
280
管酶活力。将最高酶活力的若干管酶液集中，分装后低温保存，用于性质测定。留2 mL酶液测酶活和蛋白含量。
2.4冷冻干燥
将经过DEAE-纤维素柱层析或Q Sepharose 柱层析或Sephadex G-150柱层析收集的酶溶液放入冻存管中，至于-80℃冰箱中预冻4h以上，再置于冷冻干燥机中冷冻干燥，直至成冻干粉。
3.结果与讨论
3.1细胞产量：湿细胞、干细胞
3.2酶活力、蛋白质浓度的测定
3.3盐析曲线、乙醇沉淀曲线、层析洗脱曲线
3.4酶提取纯化进程结果汇总表
3.5酶纯度分析：聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.6理化性质分析
参考文献：
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芦丁的提取分离及鉴定A4
2011届本科生毕业论文 题目芦丁的提取分离及鉴定作者单位陇东学院化学化工学院指导老师胡浩斌 作者姓名张娜娜 专业班级2007级化学本科(2)班提交时间二〇一一年四月
2011届本科生毕业论文 芦丁的提取分离及鉴定 张娜娜，胡浩斌 （陇东学院化学化工学院，甘肃庆阳745000）摘要：目的以芦丁为例学习黄酮类化合物的提取方法，掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮甙，甙元和糖的部分鉴定方法。方法采用水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法对芦丁进行提取分离，并对其进行定性分析及色谱鉴定。结果水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法，三种方法均可制的芦丁，且质量合格。结论从提高芦丁产率和纯度的角度出发，乙醇回流是较理想的提取方法。制得芦丁产率高，且测定方法简单、迅速、灵敏度高。 关键词：槐花米；芦丁；槲皮素；提取；分离；鉴定 Extraction, Seperation and Identification of Rutin Zhang Nana, Hu Haobin (College of Chemistry and Chemical Engineering, Longdong University, Qingyang 745000, Gansu) Abstraction: Objection Rutin as an example to learn the extraction of flavonoids square. Grasp the main properties and flavonoids ingredients flavonoids glucoside. Method W ith the water extraction method, buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) extraction to extraction and separation of rutin and chromatographic identification. Result With water formulation,Buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) method of extraction rutin backflow separation,three methods are made rutin and obtaining rutin quality qualified. Conclusion From improve yield and purity of rutin angle, ethanol refluxing was ideal extraction method. Preparation of rutin of high yield,high sensitivity. determination method is simple to rutin rapid. Key word: Sophora japonica; rutin; quercetin; extraction; separation; identification 引言 随着人们生活水平及质量的不断提高，心脑血管病的发病率也呈上升趋势，而且死亡率居各种疾病之首，因此，对治疗和预防心脑血管病的药品与保健品的开发研究就显得尤为重要， 1
啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定
浙江工业大学药学院生物化学实验论文 2013 年12 月13日
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文 摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD 540 计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD 660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。 关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳； 正文： 文献综述 蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会 1 蔗糖酶的提取及初步提纯 1.1实验原理 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。 1.2 试剂与器材 1.2.1试剂
槐花米中芦丁的提取、分离与鉴定
槐花米中芦丁的提取与鉴定 背景知识 芦丁（Rutin）又称芸香苷，广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica L 的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高(含量可达12-16%)，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水形成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有3分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10 000；沸水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液，酸化后又可析出，因此，本实验采用碱提取酸沉淀法提取芦丁。 芦丁具有维生素P样作用。能维持血管的正常通透性，减低血管的脆性，缩短流血时间，可作为高血压病的辅助治疗剂。亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。
一、实验目的 通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作；熟悉芦丁、槲皮素的结构性质和检识方法。 二、实验要求 独立完成实验，从槐花米中提取出芦丁并进行鉴定。 三、实验原理 芦丁属黄酮类化合物，分子中有较多酚羟基，具弱酸性，易溶于热碱中，酸化后又析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁，又利用芦丁在冷水和热水中溶解度相差较大的特性进行重结晶精制。 四、实验材料和器皿 【器皿】 烧杯（500ml）2个，试管2个，布氏漏斗1个，玻璃棒1根，抽滤瓶1个，滴管，移液管（10ml）1根，洗耳球1个，滤纸，pH试纸，电热炉，真空抽滤机。 【材料】 槐米花30 g，饱和石灰水，0.4%硼砂水溶液，镁粉，pH试纸，浓盐酸，95%乙醇，10% α萘酚乙醇溶液，浓硫酸，蒸馏水。 五、实验内容 操作步骤： 称取30g槐花米于研钵中研成粉状物，置于500mL烧杯中，加入饱和石灰水，加热至沸，并不断搅拌，煮沸30分钟后，趁热抽滤。然后用浓盐酸调节pH值为4~5。放置1-2h，使沉淀完全，抽滤，沉淀用水洗涤2~3次，得到芦丁的粗产物。 流程图：
第四章 酶的提取与分离纯化
第四章酶的提取与分离纯化 1、细胞破碎的目的、方法。 ?大多数酶都存在于细胞内部，为了获得细胞内的酶，首先要收集细胞并进行细胞破碎，使细胞的外层结构破坏，然后进行酶的提取与分离纯化。 ?机械法 ?物理法 ?化学法 ?酶促破碎法（酶解） 2 选择细胞破碎方法的依据。 ?（1）细胞的处理量：大规模用机械法，小规模用非机械法。 ?（2）细胞壁的强度与结构 ?（3）目标产物对破碎条件的影响。机械法考虑剪切力，酶法考虑对目标产物是否具有降解作用。 ?（4）破碎程度：高压匀浆法，细胞碎片细小，固液分离困难。 ?（5）提取分离的难易 3. 酶抽提的目标及方法。 提取目标： ? a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 ? b. 保持生物活性。 提取原则 ? a. 相似相溶。 ? b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。 4．三种离心方法（差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心）的特点。 （1）差速离心特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 （2）密度梯度离心特点：： ?区带内的液相介质密度小于样品物质 ?颗粒的密度。 ?适宜分离密度相近而大小不同的固相 ?物质。 （3）等密度梯度离心特点： ?介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。 ?适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。 5. 酶的分离纯化过程中常用沉淀法的种类及原理。 种类： ⑴中性盐沉淀（盐析法） 基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象： 1) 盐溶（salting in）： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out）： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。 ⑵有机溶剂沉淀 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。
芦丁的提取及鉴定
实验二芦丁的提取及鉴定 （一）概述 芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica 的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁具有维生素P样作用。有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。实验目的和要求 实验目的 ①通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 ②通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 ③了解UV及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。 要求 ①要拿到以下三个化合物：芦丁、槲皮素、芦丁的全乙酰化合物。 ②能够拿根据化学试验及UV、NMR数据初步推断出芦丁的结构。并对黄酮类化合物的结构测定有一般性的了解。 试验方法 芦丁的提取与分离（见下图） 芦丁的鉴定 ①芦丁的定性反应 取芦丁3~4mg，加乙醇5~6ml使其溶解，分成三份作下述试验： A. 取上述溶液1~2ml，加2滴浓盐酸，在酌加少许镁粉，注意观察颜色变化情况。 B. 取上述溶液1~2ml，然后滴加2%柠檬酸的甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，在继续向试管中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液，并详细记录颜色变化情况。 C. 取上述溶液1~2ml，然后再加入10%α-等体积的萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化。 ②芦丁的紫外光谱解析 取芦丁溶于色谱纯甲醇中，加入规定的试剂，测定其UV光谱，试解析光谱并初步判断其结构。
【免费下载】生物化学实验示范报告 蔗糖酶的提取与纯化正确
生物化学实验示范报告: 实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化 实验目的: 1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法； 2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理； 3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法； 4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。 实验原理： 蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。酶分离 提纯的原理与蛋白质的相同。但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。 有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉 淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶 蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。 蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质 的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。 蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。在本实验条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位；通过Folin法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活。单位质量的酶蛋白中所含酶的活力称为酶的比活。 主要实验器材： 1. 试管、血糖管； 2. 秒表； 3. 冰盐浴； 4. 恒温水浴； 5.离心机； 6. 721- 型分光光度计； 7. 柱层析装置； 8. 梯度洗脱装置； 9. 部分收集器；10. 电磁搅拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纤维素。
芦丁的提取分离和鉴定
综合化学实验: 芦丁的提取分离和鉴定 芦丁简介: 芦丁（Rutin）又名芸香苷化学式: C27H30O16·3H2O，是一种浅黄色针状结晶有机化合物，广泛存在于自然界植物中，是一种被人们广泛使用的有机天然产物。目前已发现含有芦丁的植物至少在70种以上，常见的如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均有不同含量。尤其以中药槐米（豆科、槐属，槐树Sophorajaponica的花蕾）和荞麦中含量最高，因此槐米可作为大量提取芦丁的天然植物原料。 中药槐米（炒碳）味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。西医研究其主要有效成分为有机化合物“芦丁”而中药槐米中芦丁的含量可高达12~16%，是主要的芦丁天然来源。槐米中还含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。研究文献证明芦丁具有VitP（维生素P）样作用（VitP具有生物类黄酮的功能，可防止维生素C被氧化而受到破坏，增强维生素功效；增加毛细血管壁强度，防止瘀伤。有助于牙龈出血的预防和治疗，有助于因内耳疾病引起的浮肿或头晕的治疗等）。而芦丁具有类似作用如可降低毛细血管脆性和调节通透性等，在医学临床上常将其用作毛细血管脆性引起的出血症以及防治高血压病等的辅助治疗药物。 芦丁是由槲皮素（quercetin）3位上的羟基与芸香糖（rutinose，一种由葡萄糖glucose与鼠李糖rhamnose组成的双糖）脱水合成的苷，是一种浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无结晶水时188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 补充知识:
酵母蔗糖酶提取方法的研究
酵母蔗糖酶提取方法的研究 生命科学学院 10级生物科学类李倩 10197022 指导老师：陶芳 摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30﹪乙醇分级、50﹪乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。 关键词：蔗糖酶提取自溶法 Research on the Extraction Method of Yeast Sucrose School of Life Sciences，Biological Sciences of grade 2, li Qian, 10197022 Abstract:The autolysis extract from yeast invertase,through extraction,30 ethanol fractionation and dialysis,simultaneous determination of each step of concertration of protein and enzyme avtivity,and then calculate the radio of live,recovery and purification. Key words:yeast；extraction；autolysis method 前言：蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。 按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵
酶的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。
蔗糖酶的提取分离
蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究 摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。 关键词：蔗糖酶、酶学性质 1前言 蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。 2材料与方法 2.1 材料与设备 2.1.1 实验材料 酵母、活性干酵母、壳聚糖 2.1.2 试剂及配制方法 葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na 2HPO 4 、KH 2 PO 4 、MgSO 4 、NaCl、NaOH、Na 2 CO 3 、盐 酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。 95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3) 葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml 0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液
实验四槐米中芸香苷的提取分离与鉴定
实验四槐米中芸香苷的提取分离与鉴定 芦丁(Rutin)亦称芸香甙(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。 槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L。)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达12%~16%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性。临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。 槐花米中主要化学成分的结构及性质： 1.芦丁(Rutin) 淡黄色细小针状结晶，℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。 溶解度： 水：1:100(冷)，1:200(热) 甲醇：1:100(冷)，1:9(热) 乙醇：1:650(冷)，1:60(热) 吡啶：1:(冷)，易溶(热) 不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。 2. 槲皮素(Quercetin) 即芸香甙甙元，为黄色结晶，mp.313℃~314℃(含2分子结晶水)，316℃(无水物)。溶解度： 乙醇：1:290(无水乙醇)，1:23(热) 可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、吡啶、冰醋酸。不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚等。 3. 皂甙 粗品为白色粉末，mp.210℃~220℃(分解)。易溶于水、吡啶，能溶于200倍的甲醇中。酸水解后得白桦脂醇、槐二醇二种皂甙元及葡萄糖，葡萄糖醛酸及葡萄糖醛酸内酯。 (1) 白桦脂醇(Betulin) 无色针晶，℃~252℃。能溶于醋酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、
参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定分析
参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定 蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的 软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。 （本实验以酵母为原料） 一、教学目的 通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、 过程和方法。 本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。 二、教学内容
实验槐米中芦丁的提取分离和鉴定
实验一槐米中芦丁的提取、分离和鉴定 一、概述 槐米系豆科植物槐树（Sophora japonica L.）的花蕾（槐米）。具有清热、凉血、止血的功效，用于治疗便血、痔血，尿血、血淋，崩漏，赤血痢下，风热目赤，痛疽疮毒，还可用于预防中风。近年来被用作治疗高血压的辅助药物。 药理实验证明，槐花米具有调节毛细血管的渗透作用，抗炎作用，解痉、抗渍疡作用，影响脂质代谢，抗菌等多种生物活性。槐花米中主要含有黄酮苷，皂苷、甾醇和鞣质等成分，其中芦丁(Rutin)含量最高，达12～20%。 主要化学成分的结构及理化性质： 芦丁（rutin）：C 27H 30 O 16 ·3H 2 O，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子 水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。 槲皮素（quercetin）：C 15H 10 O 7 ·2H 2 O，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结 晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。 二、实验部分 （一）实验目的 1、通过芦丁的制备，掌握黄酮类化合物提取分离的原理和操作。 2、掌握酸水解将芦丁生成槲皮素的方法。 3、掌握芦丁与槲皮素的鉴别方法，聚酰胺薄膜的操作方法，电子天平的使用方法。 （二）实验原理 1、芦丁的提取原理：芦丁中含有多个酚羟基，具有酸性，故用碱提酸沉法。 2、芦丁的分离原理：芦丁在沸水中溶解，在冷水中析出。 3、芦丁的鉴定原理：芦丁与槲皮素分别为黄酮类化合物的苷与苷元，用Molish反应可以进行鉴别，也可以利用聚酰胺的氢键吸附性质进行定性分析，Rf值也应不同。 （三）实验药材、仪器与试剂 1、药材：槐米50g(每组)。
酵母蔗糖酶的提取及性质测定
酵母蔗糖酶的提取及性质测定 引论及原理 酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 （一）实验目的 学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。 （二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器 1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱 2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯 3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂 1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存） ＋ H 2O 蔗糖酶 O H H O
蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究
论文 论文题目：蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究 作者姓名周柱林 指导教师钟莉 学科专业食品科学与工程1102 所在学院生物与环境工程学院 提交日期 2013年12月
蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究 周柱林 生物与环境工程学院食品科学与工程1102班 摘要：对啤酒酵母蔗糖酶的相关性质进行研究讨论，实验采用酵母自溶法初步得到粗蔗糖酶，离心除杂质法得到初提取液A，接着制备热提取液B，接着制备乙醇沉淀提取液C，接着采用Q Sepharose-柱层析法得到纯度较高的D液，然后用DNS法、标准曲线法和分光光度法测定蔗糖酶的活力，用Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量及计算比活力，用微量凯氏定氮法测定总蛋白含量，最后用SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究。实验测定结果A、B、C提取液的酶回收率（％）分别为100、128.5、56.6，蛋白回收率（％）分别为100、98.15、4.29，比活力分别为17.4、22.8、230.1，纯化倍数分别为1、1.31、13.22，SDS-PAGE测定酵母蔗糖酶相对分子质量为A:99150、45000；B：10140；C：92200、65660. 关键词：蔗糖酶、提取、纯化、酶活力、蛋白质含量、比活力、相对分子质量 1.前言（文献综述）： 啤酒酵母也叫营养酵母，可以从其中提取蔗糖酶，蔗糖酶又称为转化酶，属于水解酶类，蔗糖在蔗糖酶的催化下，水解为两种还原糖D一葡萄糖和D一果糖。蔗糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用，并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β -D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取。 目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多 , 有SDS抽提法，正交法等等，其中以甲苯自溶法最为常见。本实验采用此自溶法从啤酒酵母中提取蔗糖酶，利用有机溶剂将胞内蔗糖酶释放，经过初提取的离心去杂和等电位沉淀，制得的粗酶经醇沉后，采用Q Sepharose-柱层析法纯化，利用DNS法测定其酶活力，利用Folin-酚法测定蛋白质的含量及比活力，利用微量凯氏定氮法测总蛋白氮，以及用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究，也为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的技术开发提供了实验依据。
实验 槐米中芦丁的提取、分离与鉴别
实验一槐米中芦丁的提取、分离与鉴别 一、实验目的 （1）掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。 （2）掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。 二、实验原理 芦丁(Rutin)亦称芸香苷(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。 槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达23.5%，槐花开放后降至13.0%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性，临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。 芦丁(Rutin)为淡黄色细小针状结晶，mp.174℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。溶解度情况如下： 水：1:10000(冷)，1:200(热) 甲醇：1:100(冷)，1:9(热) 乙醇：1:300(冷)，1:30(热) 吡啶：1:11.7(冷)，易溶(热) 不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。 芦丁可溶于热水，难溶于冷水，其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱液中易溶解，而在酸性条件下，易析出沉淀，故本实验采用碱溶解酸沉淀的方法自槐米中提取芦丁。再利用其在冷热水中溶解度的差别采用沸水为结晶溶剂进行精制。利用芦丁可被稀酸水解，生成苷元和糖，通过颜色反应、薄层层析等方法进行检识和确认芦丁。 三、实验内容 （一）芦丁(芸香苷)的提取 1. 取1.5g石灰粉（CaO），置于干净的小研钵中，加入10mL水研成乳液备用。称取槐米20g，于1000m1烧杯中，加0.4%硼砂水溶液200mL，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH 8～9，加热至微沸，维持pH值20-30分钟，趁热抽滤，弃去滤渣，冷至60-70℃用浓盐酸调至pH4-5，放置过夜，减压过滤，得粗芦丁（滤
1蔗糖酶的提取
实验报告 课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师：杨劲树 同组学生姓名： 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1. 掌握蔗糖酶的提取纯化的操作方法。 2. 熟悉有关生化技术的基本操作。 二、实验内容和原理 1、酵母细胞破碎 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 2、蔗糖酶的初步分离纯化 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。 三、实验材料和主要仪器 1、实验材料： 市售干酵母粉 2、实验试剂： ⑴ 石英砂 ⑵ 95%乙醇(-20℃） ⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液 3、实验仪器 （1）电子天平（称量样品） （2）研砵（每组一套） （3）50ml 高速离心管（4支/组、离心管架1个/组） （4）托盘天平（离心管平衡用） （5）高速冷冻离心机 （6）恒温水浴箱（50℃） （7）制冰机 （8）1.5ml 离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架 （9）－20℃冰箱
实验名称：_ __________________姓名： 学号： 四、实验方法和步骤 1、酵母细胞破碎 称取市售干酵母粉10g ，约3g 石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积50ml 的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml 离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min 离心15分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I ）,另留1ml 上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE 分析。 2、热处理 将上一步抽提液（样品I ），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50ml 离心管中，平衡后， 4℃，15000r/min 离心15分钟，收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），另留1ml 上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE 分析。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀： 上清液（样品Ⅱ）加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，至少放置30分钟，然后转移至两支50ml 离心管中，两支离心管平衡后，4℃，12000r/min 离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰箱保存，以备用于下周实验。 五、实验数据记录和处理 V1=35.0ml V2=30.0ml 六、实验结果和分析 V1=35.0ml V2=30.0ml 七、实验讨论和心得 酶作为一种蛋白质，在发挥其生物功能需要保持适当的高级结构。如果提取工作在温度较高的环境中进行，那么过高的温度有可能会不可逆的改变、破坏这种高级结构，导致酶失活；其次，蛋白质在高温下易于降解，保持冰浴能够最大限度的降低蛋白降解的速率。所以酶液的提取要在冰浴中进行。 另外，实验操作过程中应小心注意，切勿打翻样品液。因为这个实验是之后一系列实验的基础，所以，提取的蔗糖酶的质量决定着后面实验的质量。 装 订 线 P.2
槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定
槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定 槐米为豆科植物槐（Sophora japonica L ．）的未开放花蕾。味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。槐米常炒炭应用。 槐米的主要化学成分为芦丁，其含量可达12～16％，其次含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。芦丁具有Vitp 样作用，可降低毛细血管脆性和调节通透性。临床上用作毛细血管脆性引起的出血症，常作为高血压症的辅助治疗药。 [目的要求] 1．通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 2．掌握槲皮素的制备原理及操作。 3．熟悉紫外光谱在黄酮结构鉴定中的应用 4．通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 [实验原理] 芦丁（rutin ）：C 27H 30O 16·3H 2O ，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。 槲皮素（quercetin ）：C 15H 10O 7·2H 2O ，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。 芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶热水、热乙醇， 较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择
槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定
实验二槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定 槐米为豆科植物槐（Sophora japonica L．）的未开放花蕾。味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。槐米常炒炭应用。 槐米的主要化学成分为芦丁，其含量可达12～16％，其次含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。芦丁具有Vitp样作用，可降低毛细血管脆性和调节通透性。临床上用作毛细血管脆性引起的出血症，常作为高血压症的辅助治疗药。 [目的要求] 1．通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 2．掌握槲皮素的制备原理及操作。 3．熟悉紫外光谱在黄酮结构鉴定中的应用 4．通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。[实验原理] 芦丁（rutin）：C27H30O16·3H2O，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。 槲皮素（quercetin）：C15H10O7·2H2O，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。
芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。芦丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此进行制备槲皮素。通过纸色谱及紫外光谱进行黄酮及糖的鉴定。 [实验内容] 一、芦丁的提取分离及精制 方法⑴ 500ml 饱和石灰水，加热，并维持pH8～9 滤液 药渣 10分钟，维持pH8～9 pH 至4 ～5 沉淀 低温（80℃）干燥，称重。按1：200的比例加水， 加热使溶解，趁热滤过 滤液 静置，抽滤，减压干燥，计算收率 芦丁精制品