抗氧化

5 汉麻叶多糖抗氧化活性测定方法

5.1 羟基自由基的清除能力测定

羟基自由基清除能力的测定方法采用颜军等方法并略有改动。基本操作步骤为：先配置10 mg/mL 的样品溶液，在10 mL 的比色管中加入不同体积的被测溶液后，加入5 mol/L 的过氧化氢2 mL ，5 mmol/L FeSO 4 2mL 后，迅速加入5 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液2 mL 后用去离子水定容到10 mL ，放入37°C 的水浴锅中反应45 min 后，在波长510 nm 处，用紫外分光光度计测量各待测液的吸光度。因为样品本身也具有一定的吸光度，如果忽略就会造成误差，所以用4 mL 去离子水代替FeSO 4和水杨酸-乙醇溶液。同时以2 mL 去离子水代替待测样品溶液，测定在没有抗氧化剂的条件下，水杨酸络合物的吸光度。使用Vc 作为阳性对照按上述方法测定羟基自由基的清除率。羟基自由基清除率公式为式(5-1)：

100×+=0

210A A A A -(%)清除率式(5-1) 式(5-1)中，A 0为空白对照液的吸光度，A 1为加入样品后的吸光度，A 2为不加过氧化氢的样品溶液的本底吸光度。

HLPs 、HLP-A 和HLP-B 对羟基自由基的清除能力测定结果如图3-20所示。由图3-20可知，汉麻叶多糖对羟基自由基具有较强的清除能力，且随着汉麻叶多糖浓度的增加，其清除能力也逐渐增加，当多糖浓度达到1 mg/mL 时，HLPs 、HLP-A 和HLP-B 均达到最大值，分别为89.92%、81.51%和92.84%；HLPs 、HLP-A 和HLP-B 的IC 50值分别为0.449、0.563和0.331mg/mL ，说明HLP-B 的清除效果最好，清除能力强弱比较得：HLP-B>HLPs>HLP-A 。

图5-1 HLPs,HLP-A 和HLP-B 对羟基自由基的清除率

5.2 DPPH 自由基清除能力测定

DPPH 自由基清除能力测定方法采用Yao 等方法并略有改动。基本操作步骤为：精确量取适量提取液1 mL ，加入0.6 mmol/L DPPH 乙醇溶液1.0 mL ，混合均匀，定容到10 mL ，室温下避光反应30 min 。然后在波长517 nm 处，测定样

羟基自由基清除率(%)样品浓度(mg/mL)

品的吸光度(A 1)；对照组以等体积去离子水代替提取液，测定相应的吸光度(A 0)；样品本底的吸光度(A 2)以等体积的无水乙醇代替DPPH 乙醇溶液。使用Vc 作为阳性对照按上述方法测定DPPH 自由基清除率。DPPH 清除率的公式为式(5-2)：

100×+=0

210A A A A -(%)清除率式(5-2) 式(5-2)中，A 0是对照试验的吸光度(即以水代替样品)，A 1是样品试验的吸光度，A 2是样品自身干扰试验的吸光度(即以60%乙醇替代DPPH 溶液)。

HLPs 、HLP-A 和HLP-B 对DPPH 自由基的清除能力测定结果如图5-2所示。由图5-2可知，汉麻叶多糖对DPPH 具有一定的清除能力，且随着汉麻叶多糖浓度的增加，其清除能力也逐渐增加。当多糖浓度达到1 mg/mL 时，HLPs 、HLP-A 和HLP-B 均达到最大值，分别为28.86%、24.14%和36.49%，IC 50值分别为3.28、14.94和1.81 mg/mL ，说明HLP-B 的清除效果最好，清除能力强弱比较得：HLP-B>HLPs>HLP-A 。

图5-2 HLPs,HLP-A 和HLP-B 对DPPH 自由基清除率

5.3还原力测定

还原力测定方法采用Deng 等[82]方法并略有改动。基本操作步骤为：取2.5 mL 样品溶液于试管中，然后加入2.5 mL 0.2 mol/L 的PBS(pH 6.6)和2.5 mL 1% K 3[Fe(CN)6]，混匀，在50°C 水浴中反应20 min 后，取出冷却至室温，并加2.5 mL 10%(w/v)的三氯乙酸，混匀后取2.5 mL 上清液和0.5 mL 0.3% (w/v)FeCl 3混匀，再加2.5 mL 去离子水摇匀后在室温下反应15 min ，在波长700 nm 处，测定样品的吸光度(A 1)，以2.5 ml 去离子代替K 3[Fe(CN)6]溶液，测其吸光度(A 2)，去离子水调零。使用Vc 作为阳性对照。吸光度越高，证明其所具有的还原力越强。

还原力=A 1-A 2 式(5-3)

式(5-3)中，A 1是样品试验的吸光度，A 2是去离子代替K 3[Fe(CN)6]溶液的吸光度。

D P P H 自由基清除率(%) 样品浓度(mg/mL)

图5-3 HLPs ，HLP-A 和HLP-B 的还原力

HLPs 、HLP-A 和HLP-B 还原力的测定结果如图5-3所示。由图5-3可知，汉麻

叶多糖具有较好的二价铁还原能力，多糖浓度越高，其还原力越强。当多糖浓度达到1 mg/mL 时，HLPs 、HLP-A 和HLP-B 的吸光度均达到最大值，分别为0.941、0.444和1.653。其中阳性对照Vc 的还原力最好，三种多糖中HLP-B 的还原力要高于HLP-A 和HLPs 。这个试验结果与Jia 等从老鹰茶中提取得到的多糖单品HMP-1和HMP-2的还原能力测定结果相似。

1.5 多糖的抗氧化活性评价方法

自由基是一类具有高度活性的物质，含有未配对电子的物质[38]，能致细胞膜

过氧化损伤，进一步导致细胞膜功能丧失，是产生疾病的主要原因[39]。已有大量的研究表明，一大部分从天然产物中分离得到的多糖类化合物具有清除自由基、抑制脂质过氧化作用、抑制亚油酸氧化等抗氧化作用[40-42]。评价化合物的抗氧化活性的方法包括体内抗氧化活性评价方法和体外抗氧化活性评价方法，常用的体外抗氧化活性评价方法有以下几种：

1.5.1DPPH 自由基清除率

DPPH(化学名为：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)是一种在有机溶剂(如乙醇)中很

稳定的自由基，含有孤对电子，其乙醇溶液呈现为深紫色。因为生物体内的自由基维持时间太短，所以使用DPPH 来产生自由基代替普通的生物体内的自由基，DPPH 在波长517nm 处有强的吸收。当待测样品中有抗氧化的物质存在时，该物质能与DPPH 中的孤对电子配对，从而使DPPH 自由基的含量减少，且浓度降低，使溶液的颜色变浅，结果是其在517nm 处的吸光值减弱，通过测定其吸光度的变化程度来评价样品抗氧化能力的大小。

1.5.2?OH 的自由基清除率

羟基自由基(?OH )是一种能诱导引发脂质发生过氧化反应的强氧化剂，其含

吸光度样品浓度(mg/mL)

量可通过邻二氮菲法间接测量，该法的基本原理是：双氧水H2O2和Fe2+发生氧化还原反应，生成羟基自由基，羟基自由基具有很高的反应活性，但是存在的时间较短，如果在反应体系中加入水杨酸，则水杨酸能够有效的捕捉羟基自由基，并生成有色络合物，该络合物在波长510 nm下具有一定的强吸收。当向溶液中加入含有抗氧化活性的样品后，样品中具有抗氧化活性的物质将会与水杨酸竞争与羟基自由基反应，从而使溶液中形成的有色络合物的含量发生改变，其吸光度也会相应随之发生改变，通过测定其吸光度的变化程度来评价样品抗氧化能力的大小。

1.5.3邻苯三酚自氧化法

该法测定的是对清除超氧阴离子的能力。邻苯三酚在弱碱性的环境下会发生自氧化反应，并连续释放出来超氧阴离子自由基。反应物的浓度随时间的增长呈正相关，该现象发生是在邻苯三酚发生自氧化反应一段时间以后，且在较短时间内该线性关系可以基本维持不变，因此通过计算溶液吸光度的变化率，间接测定抗氧化剂清除超氧阴离子的能力。

1.5.4还原力的测定

还原力的测定常用普鲁士蓝法。该法的测定原理为：铁氰化钾[K3Fe(CN)6]能够与抗氧化剂发生氧化还原反应，进而被还原成了亚铁氰化钾，Fe3+又可以与亚铁氰化钾发生反用，产生物质普鲁士蓝，该蓝色物质在波长700nm处有强的吸光度，根据其吸光度的大小可以检测出普鲁士蓝的产量，抗氧化剂的抗氧化能力与还原力成一定比例，产物普鲁士蓝的吸光度值越大，说明该抗氧化剂的还原力越强。

有关研究表明，汉麻叶经乙酸乙酯提取所得提取物对紫外和红外均有很高的吸收率，汉麻叶的水提物对羟基自由基有较好的清除效果，汉麻叶的95%乙醇提取物对羟基自由基的清除效果较好，且随着提取物浓度的增大，清除率也相应增大；汉麻叶的水提物和醇提物对DPPH的清除率也较高[7]。赵鹏通过对款冬花多糖对超氧阴离子、亚硝基、羟基自由基、DPPH自由基的清除试验研究，发现款冬花多糖对常见的自由基均有一定的清除作用，且随着对多糖的不断纯化，其清除率也不断提高[43]。严奉伟等通过对菜籽多糖进行还原力实验，证明菜籽多糖具有一定的还原能力，且随菜籽多糖浓度增加，A700的值也相应的增大[44]。

此外，体内评价化合物抗氧化活性的方法主要是建立在生物技术的原理上，在细胞水平选用健康的动物(一般选小白鼠)进行动物实验。

2.6 抗氧化活性检测

2.6.1羟基自由基的清除能力测定：

铁-邻二氮菲法：此法是利用Fenton反应产生·OH，在体系中加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质。溶液的褪色程度可用来衡量·OH的清除量。

各试管中加入不同浓度的样液 2 mL ，8.8mol/L 的过氧化氢 2 mL ，9mmol/LFeSO 4 2mL ，最后加入9mmol/L 水杨酸-乙醇2 mL 和2 mL 去离子水启动反应，37℃反应45 min 。以去离子水调零，在510nm 下测量各待测液的吸光度，考虑到样品本身的吸光值，同样条件用去离子水代替过氧化氢为本底吸收，计算清除率[43]。清除率的公式为：

(2-2)

公式中，A 0为空白对照液的吸光度，A 1为加入多糖后的吸光度，A 2为不加过氧化氢的多糖溶液本底吸光度。

2.6.2DPPH 清除能力的测定：

取1 mL 不同浓度的多糖溶液，加入1 mL 的0.6mol/L 的DPPH 溶液(用乙醇溶解)和1 mL 的水，然后用蒸馏水定容至10mL ，在常温下避光反应30min 后，用分光光度计测定5l7nm 处的吸光度值，使用Vc 作为阳性对照按上述方法测定DPPH 清除活性。DPPH 的清除活性利用公式进行计算[43]。清除率的公式为：

120A -A 1-%A ??? ???清除率(%)=100(2-3)

其中，A 0是对照实验的吸光度值(即以水代替样品)，A 1是样品实验的吸光度值，A 2是样品自身干扰实验的吸光度值(即以水替代DPPH 溶液)。

2.6.3 超氧阴离子清除能力的测定

本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。参考张明的方法并略作改变，首先要配置50 mmol/L （pH8.2）Tris-HCl 缓冲液和用l0mmol/L 的HCl 配制45mmol/L 的邻苯三酚[47]。

邻苯三酚自氧化：取Tris-HCl 缓冲液4.5 mL 和5.2 mL 去离子水，混匀后置于25°C 水浴20min ，然后加入预先在25°C 保温过的邻苯三酚溶液0.3mL ，在325nm 处，每隔30s ，测定吸光度，计算其吸光度的变化率F 0[47]。

做5种不同浓度的抗氧化剂的实验：取Tris-HCl 缓冲液4.5mL ，先加入l mL 抗氧化剂和4.2 mL 去离子水，混匀后置于25°C 水浴20min ，再加入邻苯三酚溶液0.3 mL ，在325nm 处，每隔30s ，测定吸光度，计算其吸光度的变化率F 1。空白调零：去离子水

清除率(%)=(F 0一F 1)/F 0×100%(2-4)

2.6.4 还原力的测定 参考严奉伟等菜籽多糖还原能力测定方法，并略作改动。基本操作步骤为：取%100)()%(0210?--=A A A A 清除率

2.5 mL样品溶液于试管中，然后加入2.5 mL 0.2 mol/L的PBS(pH 6.6)和2.5 mL1% K3[Fe(CN)6]，混匀，在50℃水浴中反应20 min后，取出冷却至室温，并加2.5 mL 10%的三氯乙酸，混匀后取2.5 mL上清液和0.5 mL 0.3%FeCl3混匀，再加2.5 mL 去离子水摇匀后测定A700，用去离子水调零[44]。用去离子水作为无还原能力对照。吸光值越高，证明其所具有的还原力越强。