双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究
化学与生物工程
2006,Vol.23No.10
Chemistry &Bioengineering
7
收稿日期:2006-04-17
作者简介:郑楠(1982-),女,陕西人,硕士研究生,主要从事生化制药方面的研究。E 2mail :zhengnan1982@https://www.360docs.net/doc/d519074403.html, 。
双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究
郑 楠,刘 杰
(南昌大学环境科学与工程学院,江西南昌330029)
摘 要:阐述了双水相萃取原理,详细分析了影响双水相萃取分离纯化蛋白质的各种因素,探讨了双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用并对其前景进行了展望。
关键词:双水相;蛋白质;分离纯化;影响因素
中图分类号:TQ 02818 Q 512+11 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2006)10-0007-03
液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一,在生物化工中也有广泛的应用。然而,大部分生物物质是有生物活性的,需要在低温或室温条件下进行分离纯化,而采用传统萃取技术无法完成。双水相萃取就是考虑到这种现状,基于液-液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液-液萃取分离技术。
与传统的液-液分离方法相比,双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势:体系含水量高,可达80%以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力远远低于
水-有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递;分相时间短,一般只需5～15min ;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和,生物相容性高;聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等。正是由于双水相萃取技术的诸多优势,现已被广泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。
1 双水相萃取原理
双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。高聚物-高聚物-水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物-盐-水体系一般认为是盐析作用的结果。
双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,不同之处在于萃取体系的性质差异。当生物物质进入双水相体系后,由
于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离
子键等)的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K 等于两相中生物物质的浓度比,由于蛋白质的K 值不相同(大致在011～10之间),因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。
2 双水相萃取中影响蛋白质分配的因素
211 聚合物的分子量
同一类聚合物的疏水性随分子量的增大而增强[1],当聚合物的分子量减小时,蛋白质易分配于富含该聚合物的相。如在PEG 2Dext ran 系统中,PEG 的分子量减小或Dextran 的分子量增大都会使分配系数变大,相反PEG 的分子量增大或Dext ran 的分子量减小会使分配系数变小。这是由于PEG 分子量增大时,它的疏水性显著增强,使蛋白质在上相的表面张力增大,从而易于向下相分配。同理,Dext ran 的疏水性随其分子量的增大而增强,使蛋白质在下相的表面张力增大,从而不断向上相分配。212 聚合物的浓度
在双水相系统中,界面张力很低并且随结线长度呈指数规律的增大。当系统组成处于临界点时,系线长度为零,上下相组成相同,蛋白质均匀地分配在两相中,分配系数K =1。当成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增加时,系统远离临界点,系线长度增大,两相性质的差别也增大,同时蛋白质在两相中的界面张力差别增大,使其趋于向一侧分配,即K 值或增大超过1,或减小低于1。
213 添加剂
21311 中性盐
盐的种类对分配系数的影响主要反映在对相间电位的影响上[2]。中性盐的种类不同,其正负离子分配系数也不同,当它在双水相中电离时,为保持两相的电中性,产生了不同的相间电位,从而影响蛋白质的分配。如在PEG2Dext ran体系中加入NaClO4或KI,可增加上相对带正电的蛋白质的亲和效应,并迫使带负电的蛋白质进入下相;若加入Li3PO4情况则相反[1]。故只要改变界面电势就可控制荷电蛋白质转入所需要的相中。
盐的浓度对分配系数的影响主要反映在对蛋白质疏水性的影响上[2]。如Uf uk Gunduz和 K o nca K orkmaz用PEG33502Dextran35000体系分配BSA 时,保持体系NaCl浓度不等(0106mol?L-1、011mol?L-1、012mol?L-1、013mol?L-1、0134mol?L-1),发现在任一p H值下,随着NaCl浓度的增加,分配系数先减小后增大,且在012mol?L-1处达到最小。这是由于BSA在上下相的相对疏水性随NaCl浓度的变化呈先大后小的趋势,当NaCl 浓度为012mol?L-1时达最大,分配在下相的BSA也就最多,因而分配系数最小[3]。
21312 有机溶剂
在双水相体系中添加少量有机共溶剂,使得体系中的一部分水被有机共溶剂所取代,导致两相界面处的疏水性能差异发生变化,同时界面张力以及电位差也随之改变,从而影响了蛋白质的分配[4]。通常认为,有机共溶剂对被分配物质分配行为的影响更主要是有机溶剂和成相高聚物相互作用的结果[5]。如在PEG40002Dextran40000体系中分别加入相同量(2%)的乙醇、异丙醇、丙酮,均使BSA的分配系数显著降低,且加入乙醇后分配系数达到最小。这一现象完全符合以上理论:由于乙醇有较大的水化能,体系中的水较多地被乙醇所取代,使两相界面处的疏水性能差异、界面张力以及电位差较其它有机溶剂大,因此蛋白质分配系数的变化较大;再者乙醇与PEG相相互作用较强,使得蛋白质受排斥而易于向Dext ran相富集。21313 表面活性剂
Bodhankar和Gaikar等研究了四类表面活性剂,即阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性表面活性剂在PEG2Dext ran体系中对物质分配的影响。实验表明,添加表面活性剂可以改变界面张力、上下相组成等两相特性,从而对物质的分配行为进行调节[6]。214 pH值
体系p H值会影响蛋白质分子可离解基团的离解度,从而改变蛋白质的表面电荷数来影响分配。同时p H值还会影响缓冲离子如HPO2-4、PO3-4等的分配,以改变相间电位来达到改变分配系数的目的。另外在研究分配系数与p H值的关系时,若加入不同种类的中性盐,由于电位差的不同,其相应关系也不同[1]。215 温度
温度的变化影响相物理性质的变化,例如粘度和密度等,从而影响蛋白质的分配[7]。但总的来说,温度对分配系数的影响是通过对相图的影响来间接达到的。在临界点附近,温度对相图的影响最显著,对分配系数的影响最强。当远离临界点时,温度对相图的影响较小,分配系数对温度的变化也不敏感。这是由于远离临界点时,成相聚合物的浓度增大,对蛋白质的稳定作用增强。
216 荷电PEG作为成相聚合物
在聚合物上引入电荷可以增大两相间的电位差,故可在PEG或葡聚糖上引入带电基团来改变蛋白质的分配。因相间电位差与电荷数成反比,而每个葡聚糖分子上可引入的带电基团较多,故效果较差。相反,每个PEG分子只含两个羟基,只需引入两个荷电基团,电场增大的效果就较好。Johansson等已制得以下四种荷电PEG:带正电的三甲胺基2PEG(TMA2 PEG)、氨基2PEG(PEG2N H2)和带负电的PEG2磺酸盐(S2PEG)、羧基2PEG(PEG2COO H)[8]。因此可以根据蛋白质的带电情况来选择荷电PEG,以达到改变蛋白质分配的目的。如红血球蛋白在p H值较小时带正电(等电点为7),若将PEG接上三甲胺基基团后,由于上相带正电,红血球蛋白就不断向下相富集;同理,当p H值较大时,由于受上相正电TMA2PEG的影响,带负电荷的红血球蛋白则开始向上相富集。
217 疏水基团
在聚合物上接枝疏水基团后,疏水性成为影响蛋白质分配的主要因素。这种疏水性的影响由连接在高聚物上疏水基的大小和蛋白质分子疏水区域的数量以及疏水区的粘结强度所决定。Shanbhag和Axelsson 认为,通过比较蛋白质在PEG2Dext ran体系和存在部分P2PEG(Palmitoyl2PEG)的PEG2Dextran体系中的分配系数,可以衡量蛋白质的疏水性。实验表明,在P2PEG浓度很低的情况下,血清白蛋白和乳球蛋白因易于同非极性的P2PEG结合,所以不断向上相富集[8]。
218 亲和配基
在聚合物上接上一定的亲和配基,不仅能提高萃取分配的专一性,而且能增大处理量。例如:NAD H2 PEG衍生物引入PEG2Dext ran体系后使乙醇脱氢酶的分配系数与其分子上结合位点数密切相关;另Ciba2 cronblue2PEG衍生物引入PEG2Dext ran体系后使磷酸果糖激酶的分配系数成千倍地提高。也可同时使用以上两种配基,从而增加系统的选择性,完成多种酶的分离和回收[7]。
3 双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用和展望
双水相萃取技术已成功地用于分离和提纯蛋白质、提取抗生素和分离生物粒子、电泳分离氨基酸等方面。双水相萃取分离技术还有很多可开拓的领域:
(1)新型双水相体系的开发。新型双水相体系主要有两类:廉价高聚物/高聚物体系及新型功能双水相体系。廉价双水相体系的开发目前主要集中在寻找一些廉价的高聚物取代现用昂贵的高聚物。例如:牌号PP T的变性淀粉和牌号为Reppa/PES的淀粉衍生物以及牌号为Pulluan的微生物多糖等[9]。研究发现由这些聚合物形成的双水相体系的相图与PEG2
形成的双水相体系相图非常相似,其稳定性也比PEG2盐双水相体系更好,并且具有蛋白质溶解度大、粘度小等优点[10]。另外,特别要提到只有一种成相聚合物的新的双水相体系,上相几乎100%是水,聚合物绝大部分集中在下相,该体系不仅操作成本低、萃取效果好,还为蛋白质等生物物质提供了更温和的环境[11]。
(2)后续色谱纯化工艺研究。高聚物/高聚物双水相萃取同离子交换层析技术结合可以解决双水相萃取技术在蛋白质粗分离纯化中的工业化问题。PEG2盐体系具有价廉和分相容易的优点,而疏水色谱可在高盐浓度下操作,故PEG2盐体系与疏水色谱的结合有很大的发展空间。如Schutte已成功利用疏水色谱从盐相中分离纯化蛋白质。
(3)金属亲和双水相萃取技术。金属亲和双水相萃取和普通亲和双水相萃取相比,具有亲和配基价廉且再生容易、可用于PEG2盐体系的优点。Arnold提出了金属离子亲和双水相萃取技术,利用金属离子和蛋白质中精氨酸、组氨酸的亲和作用,以达到分离纯化蛋白质的目的。目前金属离子亲和双水相萃取已应用于多种酶的分离纯化。
影响双水相萃取的因素比较复杂,主要包括静电作用、疏水作用及界面张力等。通过对各个因素的调节,可以极大地提高蛋白质的选择性,达到向一相富集的目的。
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ZHENG N an,L IU Jie
(College of Envi ronmental S cience and Engi neeri ng,N anchan g U ni versit y,N anchang330029,Chi na) Abstract:The f undamental ext raction mechanism of aqueous two2p hase system is explained.And t he fac2 tors which influence partition and p urification of p rotein are researched in detail.In t he end,The application and expectation of aqueo us two2p hase technology in protein partition and p urification are discussed.
K eyw ords:aqueous two2p hase system;p rotein;partition and p urification;influencing factor