《发酵工程实验》

实验一淀粉酶生产菌的筛选

一、实验目的

学习淀粉酶产生菌的筛选方法。

二、实验原理

淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域有广泛用途。淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。

三、实验用品

1．样品

淀粉含量丰富的土样。

2．培养基

肉汤培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加水至1000ml，pH7.0。121℃灭菌20min。

初筛平板培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂18g，加水至1000ml，pH7.4。121℃灭菌20min。

Lugol碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水即可。

3．器材

高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，电子天平，电炉，恒温振荡器，恒温培养箱；烧杯，量筒，三角瓶，培养皿，移液管，洗耳球，试管，试管架，接种针，涂布棒。

四、实验方法

1．培养基制备：

配制肉汤培养基45ml，分装于250ml三角瓶中，纱布封口，灭菌。配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。

2．倒平板：

将融化的初筛平板培养基冷却至50～60℃，以无菌操作法倒至已灭菌的培养

皿中，至盖满底部。冷却凝固待用。

3．样品预处理：

取5g土样接入45ml肉汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。另取4支试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每支试管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液，加入到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-3试管中，依此类推直至10-5试管。

4．平板涂布分离：

分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24～48h。

5．菌株检测：

待初筛平板长出菌落后，根据菌落不同挑取菌落进行保存并编号。同时，将检测试剂（Lugol碘液）加入到平板中，涂布均匀，菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株，记住其编号，以便进行下一步实验。

6．保存菌种：

将得到的菌株转接至斜面培养基上，30℃培养48～72h，待菌苔长好后，4℃保存。

五、思考题

微生物菌种的分离筛选通常包括哪几个部分？

实验二淀粉酶酶活测定

一、实验目的

1．掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法

2．从初筛所获得的菌株中筛选出淀粉酶活力高的菌株

二、实验原理

淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括α-淀粉酶、淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。α-淀粉酶可以从淀粉分子内部切断淀粉的α-1，4糖苷键，形成麦芽糖、含6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。

淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可以用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。

三、实验用品

1．粗酶液

实验一保存的菌种进行摇瓶发酵，发酵液离心后可作为粗酶液。

2．试剂

碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，贮于棕色瓶中；

比色用稀释碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500ml，贮于棕色瓶中；

2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100ml，需当天配制；

pH6.0的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100ml；

0.5mol/L乙酸溶液。

3．器材

离心机，分光光度计，恒温水浴锅，试管架，秒表；试管，移液管，烧杯，离心管。

四、实验方法

1．标准曲线的绘制：

表2－1标准曲线的制作

试剂

管号

1 2 3 4 5 6

淀粉稀释液浓度/% 0 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0

淀粉稀释液/ml 2 2 2 2 2 2 缓冲液/ml 1 1 1 1 1 1

40℃水浴中保温5min

蒸馏水/ml 1 1 1 1 1 1 40℃水浴中保温30min，加入0.5mol/L乙酸10ml，混匀后吸取反应

液1ml

稀碘液/ml 10 10 10 10 10 10

A660

将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀释液；

吸取淀粉稀释液2.0ml加至试管中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0ml，40℃水浴保温15min；

加蒸馏水1ml，40℃保温30min后加入0.5mol/L乙酸10ml；

吸取反应液1ml，加入稀碘液10ml，混匀，在660nm下测吸光值A；

以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。

2．酶液的制备

将发酵液离心（5000r/min，10min），取上清液作为粗酶液，以pH6.0缓冲液稀释至适当浓度，作为待测酶液。

3．淀粉酶活力测定

按下列程序操作：

试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）

↓↓

加2%淀粉稀释液2.00ml 加2%淀粉稀释液2.00ml

↓↓

加缓冲液1.00ml（摇匀）加缓冲液1.00ml（摇匀）

↓40±0.2℃，5min ↓40±0.2℃，5min

加蒸馏水1.00ml（摇匀）加粗酶液1.00ml（摇匀）

↓40±0.2℃，30min ↓40±0.2℃，30min

加乙酸10.0ml 加乙酸10.0ml

↓混匀↓混匀

取反应液1.00ml 取反应液1.00ml

↓↓

加稀碘液10.00ml 加稀碘液10.00ml

↓混匀↓混匀

测定A660测定A660

五、注意事项

1．淀粉一定要用少量冷水调匀，再倒入热水中溶解，若直接加到热水中，会溶解不均匀，甚至结块。淀粉液应当天配制，配好的淀粉液应是透明澄清的，不能有颗粒状物质存在。

2．酶液应该进行适当稀释。

六、作业

1．绘制标准曲线。

2．记录各样品的A660，并计算其酶活力，计算方法参见附录。

七、思考题

1．测定酶活力时，在具体操作上应注意哪些问题？

2．为什么测定酶活力的试剂要在40℃水浴锅中预热？

附：

酶活力单位的定义：1ml酶液在40℃、pH 6.0的条件下，每小时分解的淀粉的毫克数。表示为u/ml。

实验三淀粉酶生产菌发酵条件的优化

一、实验目的

掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。

二、实验原理

发酵条件对产物的形成有着非常重要的影响，其中培养基pH、培养温度和通气状况是三类最主要的发酵条件。培养基pH一般指灭菌前的pH，可以酸碱溶液调节控制，因发酵过程中pH会不断改变，所以最好用缓冲溶液来调节；通气状况可用培养基装量和摇床转速来衡量，封口纱布的厚度也会影响氧气的传递，一般以6～8层为好。

发酵培养基是指大生产时所用的培养基，一般碳源含量较高。工业发酵培养基与菌种筛选时所用培养基不同，以经济节约为主，一般选用廉价的农副产品为原料。由于天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，因此发酵前必须进行培养基的优化试验。

本实验将对菌株的培养基配方进行优化。

三、实验用品

1．菌种:实验一筛选得到的淀粉酶生产菌。

2．器材:摇床，高压灭菌锅；三角瓶，烧杯，移液管，试管。

四、实验方法

1．培养基制备：

以黄豆粉、玉米粉、可溶性淀粉、酵母膏作为培养基的主要影响因素，每一因素设定3个水平，按表3-1配制培养基（W/V），另加入Na2HPO4 0.8%，(NH4)2SO4 0.4%，NH4Cl 0.15%，分装于250ml三角瓶，每瓶50ml，6层纱布封口，灭菌。取5ml蒸馏水加入试管中，灭菌。

2．接种：

挑取斜面菌苔5环接入5ml无菌水中，摇匀后用无菌移液管吸取0.5ml菌悬液，接到每一组培养基中。30℃，150r/min摇床培养36h左右。

3．结果测定：

参照实验三方法测定菌株在各培养基中培养的淀粉酶活力。

表3-1 发酵培养基优化正交试验表

五、作业

将酶活力测定结果填入表3-1，通过正交分析，确定三个因素对酶活力影响的主次顺序，并确定最适培养基配方。

六、思考题

正交试验原理。

实验四淀粉酶的提取

一、实验目的

掌握盐析法的基本原理，学会用盐析法提取蛋白质。

二、实验原理

盐析法是加入中性盐到蛋白质溶液中，蛋白质的溶解度开始增大，但随着继续加入盐，蛋白质的溶解度却逐步减小，并形成沉淀，不同蛋白质在不同中性盐浓度下析出，利用此原理，可对溶液中的杂蛋白质及目的蛋白进行分级沉淀以达到提取分离的目的。

三、实验用品

1．粗酶液

实验一保存的菌种进行摇瓶发酵，发酵液离心后可作为粗酶液。

2．器材

烧杯，布氏漏斗，真空泵。

四、实验方法

1．盐析：

取120ml发酵液倒入烧杯中，调pH至 6.7-7.8，加硫酸铵使其浓度达到40%-42%，加完后静止数小时（3小时以上），即可抽滤或离心，收集滤饼。2．加入硫酸铵量的计算方法：

硫酸铵的溶解度在0-30℃变化很少，在水中饱和溶液浓度密度约为1.235g/ml。在20℃饱和溶液为533g/L，但加入硫酸铵体积会变大，1L水中加硫酸铵至饱和需加硫酸铵761g。

考虑到溶液硫酸铵体积要增大，则于20℃时使1LM1摩尔浓度硫酸铵溶液增至M2摩尔浓度，所需的硫酸铵量为G

G=533（M2-M1）/(4.05-0.3M2)

上式如以饱和度表示，则以S1%增至S2%，需加入量为

G=533（S2-S1）/(100-0.3S2)

本实验所需硫酸铵浓度为40%-42%

当硫酸铵浓度为40%时，G=533(40-0)/(100-0.3×40)=242.3g/L

本实验所需发酵液为120ml

即G=242.3×0.12=29g

同理，当硫酸铵浓度为42%时

G=533(42-0)/(100-0.3×42)=256.1g/L

本实验所需发酵液为120ml

即G=256.1×0.12=30.7g

本实验所需硫酸铵为29-30.7g，统一定为加入30g。

五、思考题

淀粉酶提取纯化还可以用什么方法？