大肠杆菌高密度培养2014018093
大肠杆菌高密度培养
生物1401谢宇忱2014018093
１大肠杆菌高密度培养的影响因素
１．１菌种
不同的E.coli菌株由于自身代谢系统的不同，在培养条件、对外界环境耐受能力等方面都存在着较大的差异。例如E.coli K系列菌株和E.coli B系列菌株均为较常用的培养菌株，进行了乙酸代谢研究，发现前者的乙酸积累仅为后者的1/4，菌体密度也高出25％。
１．２接种量
接种量会影响菌体在发酵罐中的生长速度。较大的接种量可以缩短菌体生长达到最高值的时间，这是因为种子液中含有大量胞外水解酶类，有利菌体对基质的快速充分利用，缩短生长延迟期。但是接种量过大也会使菌体生长过快，菌体生长持续的时间缩短，自溶也较快，反而影响后期的生长。
１．３培养基
高密度培养的目的是尽可能多地获得菌体生物量和表达产物，这就需要提供数倍于生物量的营养物质，才能满足菌体大量生长繁殖及分泌表达产物的需要。但基质中营养物质的浓度也不能太高，否则就会产生抑制效应，不利于高密度培养。
１．３．１碳源
不同微生物对碳源的需求各不相同，碳源的种类和浓度对菌体的生长代谢也有不同的影响。葡萄糖E.coli发酵中最常用的碳源。但以葡萄糖作为碳源易产生代谢抑制物质———乙酸，研究表明以甘油代替葡萄糖作为E.coli生长的碳源可以减少乙酸的积累，更易达到高密度。在发酵过程中补加麦芽糖和甘油，菌体密度和产物量都提高了2.5倍。
１．３．２氮源
大量研究表明应对发酵过程中的氮源加以控制，氮源浓度过高对菌体的生长和产物的表达合成都可能产生负面影响。培养E.coli时常用氨水作为主要的氮源，在培养过程中以流加的方式加入培养液，既可用来充当氮源又可用来调节发酵液的ｐＨ值，但氨水加入过多会导致细胞的产率下降。
１．３．３微量元素
E.coli对钙、钴、铁、铝、锰、锡等微量元素的需求量虽然很小，但微量元素对微生物的生长及活性所起的作用不可忽视，在高密度培养时应在培养基中添加适量的微量元素。１．４培养条件
１．４．１温度
温度对E.coli的生长繁殖有很大的影响E.coli的最适生长温度为37℃，但在近期的一些研究中，经常以低于37℃的温度来培养E.coli，当培养温度从37℃下降至30℃左右时，可使细胞的营养物摄入率和比生长速率减小，减少有害抑制产物的积累和代谢热的产生。
１．４．２溶氧
氧是一种难溶气体，常温常压下氧在纯水中的溶解度仅为７ｍｇ·Ｌ^－１。因此溶氧很容易成为E.coli高密度培养的限制因素，尤其是在高密度培养的后期，发酵液中菌体密度很大，耗氧量极大。在高密度培养时，可以通过提高发酵通气量、搅拌速度、通入纯氧等方法来控制溶氧；还可以通过使用氧溶解度高的载体来提高溶氧。
１．４．３ｐＨ值
微生物一般能够在３～４个ｐＨ值单位的范围内生长，细菌最适生长ｐＨ值为６．５～７．５，在ｐＨ值５．０以下或８．５以上就不能生长。培养液中ｐＨ值的变化会影响细胞
内的ｐＨ值从而影响微生物的生长繁殖。另外菌体自身的生长代谢也会导致培养液中ｐＨ值的变化。发酵培养过程中通常利用稀氨水来调节发酵液的ｐＨ值，以便同时补充氮源。１．５有害副产物
E.coli利用葡萄糖产生的主要有害物质是乙酸，尤其是在较大的比生长速率或供养不足时；但当E.coli在葡萄糖过量的条件下生长时，即使氧充足也会产生乙酸。通过提高乙酸利用率，优化培养基、降温培养、透析培养等方法都可以有效地降低乙酸的积累。
２大肠杆菌高密度培养的方法
E.coli高密度培养的方法主要是补料分批培养。补料分批培养是在分批培养过程中间歇或连续地补加新鲜培养基，以达到延长菌体生长期和控制培养过程的目的。补料方法分为非反馈补料和反馈补料。
２．１非反馈补料
非反馈补料主要包括恒速补料、变速补料、指数补料等。
恒速补料是以恒定的速率流加限制性基质的碳源。随着发酵的进行，相对于培养液中的菌体来说，营养浓度是逐渐降低的，菌体的比生长速率也慢慢减小，但菌体能够得到持续的生长，培养液中菌体量在培养过程中是线性增加的。
变速补料是指在培养过程中，营养物质的补加速率以阶段性或线性等方式不断加快或减慢。当菌体浓度较高或菌体生长旺盛时，就加快补料速度，加入更多营养物促进细胞的生长繁殖从而实现高密度；反之，就减慢补料速度。
指数补料是一种简单而又有效的补料方式，它能使培养体系中营养物的浓度控制在较低的水平，可以有效地减少乙酸等有害代谢物的积累，使菌体密度以一定的比生长速率呈指数形式增加（比生长速率通常维持在０．１～０．３５ｈ^－１之间）。
２．２反馈补料
反馈补料分为恒溶氧法、恒ｐＨ值法、ＣＥＲ（ＣＯ2排放率）法等。
恒ｐＨ值法应用最广泛，它是基于ｐＨ值恒定的反馈控制策略：当培养液中碳源耗尽时，菌体产生的ＮＨ4+浓度会增大，导致ｐＨ值上升。因此，可将某一ｐＨ值作为补料控制的临界值，当ｐＨ值大于该设定值时，开始补料，将底物浓度控制在合适的范围内。
反馈补料能够根据反馈的信息及时调整补料的速率和策略，但具有一定的滞后性，不能完全避免糖浓度的波动和代谢副产物的积累；而非反馈补料也存在不能根据发酵环境的变化和菌体生长的具体情况作出反馈调节的缺点。因此，如何结合各补料方法的优点同时摒弃其缺点，找到一种新的、更有效的补料方法成为研究的热点和突破点。
3.参考文献
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(完整版)大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。 二、培养基制备 LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备 1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。 2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。 四、接种大肠杆菌 1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒
最新大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。 预防乙酸产生的措施： 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生： 比生长速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率。 2、透析培养： 在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。 3、控制葡萄糖的浓度： 葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上，以减少乙酸的产生。 常用的控制方法主要有： 恒pH法：大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸，使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标，该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果，容易造成补料体系出错。恒溶氧法：菌体代谢时会消耗氧，使溶氧下降，当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根据溶氧曲线补加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。 二、温度 大肠杆菌发酵最适温度是37 C，当温度最适菌体生长时，比增长速率将会增大。随温度上升细
大肠杆菌的培养
大肠杆菌种子液的制备 牛肉膏蛋白胨培养基的配方： 液体培养基 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 水 1000ml pH 固体培养基在液体培养基的基础上再加入％－％的琼脂1 试管斜面与平板的制备 （1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。 （2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后， 补充水到所需的总体积。将称量好的％琼脂放入已溶的药 品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。 （3）调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH, 边加边搅拌，并随时用PH试纸测基PH直到PH达到。反之 用1mol/L HCl进行调节。 （4）分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2加塞培 养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。
（5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名 称、配制日期。 （6）灭菌将上述培养基以,121℃,15min高压蒸气灭菌。 （7）倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。 （8）搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的 一半为宜。 2 接种大肠杆菌斜面种子 (1) 取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近， 用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。 (2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h。 3 制备平板种子 (1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌 生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度 稀释为1倍，10倍，100倍和1000倍，用移液枪分别吸 取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次 吸取溶液100ul)，然后在37℃培养箱中过夜。 （12）次日，挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃，170r/min 恒温振荡培养18h作种子培养液。
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】 实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 1．实验目的 （1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。 （2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。 2．实验原理 重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。 工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。 补料的流加方式直接影响着发酵的效果。分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。 高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。此外，还需要考虑通风速度和搅
大肠杆菌的培养
大肠杆菌的培养 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
大肠杆菌种子液的制备 牛肉膏蛋白胨培养基的配方： 液体培养基 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 水 1000ml pH 固体培养基在液体培养基的基础上再加入％－％的琼脂 1 试管斜面与平板的制备 （1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。 （2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后，补充水到所需的 总体积。将称量好的％琼脂放入已溶的药品中，再加热熔化，最后 补充所损失的水分。 （3）调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌， 并随时用PH试纸测基PH直到PH达到。反之用1mol/L HCl进行 调节。
（4）分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2加塞培养基分装完毕后， 在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。 （5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期。（6）灭菌将上述培养基以,121℃,15min高压蒸气灭菌。 （7）倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。 （8）搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 2 接种大肠杆菌斜面种子 (1) 取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近，用接种环在 已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。 (2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h。 3 制备平板种子 (1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌生理盐水将菌 种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度稀释为1倍，10倍，100 倍和1000倍，用移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度 涂布三个平板，每次吸取溶液100ul)，然后在37℃培养箱中过 夜。
大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，p H偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当
大肠杆菌一般培养方法
使用牛肉膏蛋白胨培养基? 组成成分：牛肉膏 3g,蛋白胨 10g,Nacl 5g,琼脂 15～20g,水1000mL,～。? 具体配置步骤：? 1.称药品?按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速.? 2.加热溶解?在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量.若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分.? 3. 调pH?检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围.若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节.pH 的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度.?
4.过滤?液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察.但是供一般使用的培养基,这步可省略.? 5.分装?按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分装量:固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝.? 6.加棉塞?试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞.棉塞的形状,大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落.有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞.? 7.包扎?加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试管中,则应以5支或7支在一起,再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好.然后用记号笔注明,培养基名称,组别,日期.?
大肠杆菌高密度发酵
课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：大肠杆菌的高密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：****** 学号：201006030051 专业班级：10生物工程（2）班 指导教师：*****
课程设计任务书设计题目大肠杆菌的高密度发酵 学生姓名所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班10生物工程 设计要求： 1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。 2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。 3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、设计标准要求规范、实用、切合实际。 5、设计应严格按有关设计规范进行。 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、明确设计标准适用的范围，给出产品以清晰明确的定义。 2、确定引用标准和技术要求，确定特定的理化指标及标准。 3、确定理化指标所采用的测定方法，一般首选国标或公认经典方法。新方法需经多试验或单一实 验法验证。 4、给出检验规则。 5、对产品的外观、流通保藏过程中操作给出规范。 参考文献阅读：[1] Fuchs C, Koste D, Wiebusch S, et al. Scale-up of dialysis fermentation for high cell densityCultivation of Escherichian coji[J]。Biotechnol, 2002, 93: B. 2002, 93: 243~251 [2] 刘子宇，李平兰，郑海涛等.微生物高密度培养的研究进展[J].中国乳业，2005，12:47~51 [3] Riesenberg D. High cell-density cultivation of Escherichian coli. Curr. Opin. Biotechnol.1991，2: 380~384 工作计划： 2013.5.27----2013.5.30 接受设计任务，查阅相关文献。 2013.5.30----2013.6.3 整理文献资料，进行产品标准的应用设计。 2013.6.3— 2013.6.9 整理设计内容，完成课程设计报告。 任务下达日期：2013年5月27日 任务完成日期：2013年6月9日 指导教师（签名）：学生（签名）：
大肠杆菌
大肠杆菌的培养和分离 ——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌 细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。 大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置 微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3．调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。
大肠杆菌的培养
大肠杆菌的培养 1、大肠杆菌 （1）特性： 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌 （2）用途： 基因工程技术中被广泛采用的工具 2、培养： LB液体培养基——扩大培养 LB固体培养基——分离 培养基的配制：基础培养基（LB培养基）:含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。 细菌培养基的特殊成分：蛋白胨、酵母提取液、氯化钠，酸碱度：中性偏碱 a.固体培养基 通常加琼脂，作为凝固剂 （凝固剂的要求：不被微生物利用，又可使培养基固化，且不影响培养基中的其他营养物被细菌吸收） 作用：分离（纯化）细菌、计数、保留菌种等 b.液体培养基 不加琼脂等凝固剂其它成分与固体培养基相同 作用：培养细菌 高压蒸气灭菌： 条件： 1kg/cm2压力、121℃、15min 可灭菌培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液管、三角刮刀、接种环、镊子、无菌水、培养基（高压蒸汽灭菌不会破坏培养基的营养成分） 分离细菌方法 一、划线分离法 1）灼烧接种环； 2）接种环冷却后，蘸取带菌培养物 3）在近火焰处，让带菌接种环在固体培养基上划线。 划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。 二、涂布分离法 1) 稀释菌液（10-5 ~ 10-7倍） 用无菌吸管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液。…… 3) 涂布 用无菌吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度
大肠杆菌的保存与培养
一．菌种的保存 重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。 通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌 1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。能够长期在研究上应用。 2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。 3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的 改变外，还不允许污染任何杂菌。此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。 4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。 5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点 i. 甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌. ii. 使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。 二、菌种的复苏 复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。
大肠杆菌检测方法
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法： 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
乳酸菌发酵剂高密度培养的研究
文章编号:1000-9973(2004)05-0017-05 乳酸菌发酵剂高密度培养的研究 熊晓辉,于修 ,熊强,陆利霞 (南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京 210009) 摘要:研究了乳酸菌生长繁殖的环境条件(温度、接种量、起始pH 等)和培养基组成(氮源、碳源、缓冲盐等),优化确定了乳酸菌发酵剂的适宜培养条件为:起始pH 值为6.5,培养温度为37 ,培养基配比为麦芽糖 乳糖(1 1)2%、牛肉膏1.0%、缓冲盐A0.5%、NaCl0.25%、M gSO 40.1%,接种量4%,进一步探索了半连续法进行高密度培养,结合优化的培养条件,可使乳酸菌的液体发酵活菌密度至1.1 1012CFU/mL 。 关键词:乳酸菌;发酵剂;高密度培养中图分类号:TS201.5 文献标识码:A High cell density culture of lactic acid bacteria starter XIONG Xiao hui,Y U Xiu jian,XIO NG Qiang,LU Li Xia (College of Life Science and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009,China) Abstract:This paper studied on the high cell density culture of L actobacillus sp p .,and discussed the effects of cultural condition (temperature,inoculation capacity and initial pH)and media composition.The optimal culturing conditions were developed ,follow ing:1%maltose,1%lactose,1.0%beef ex tract,0.5%buffer salt A,0.25%sodium chloride,0.1%m agnesium sulfate,pH6.5,4%inoculation capacity.T hen high cell density culture w as explored w ith one semi-continuous w ay and obtained the cells population over 1.1 1012CFU/mL for 16hours based on the optimal condition.Key words:Lactic acid bacteria;starter;hig h cell density culture 乳酸菌是生产发酵乳制品、泡菜、干酪、发酵香肠等传统发酵食品,赋予其特殊质地、风味和口感的重要微生物菌群,而这些传统食品的专用发酵剂的生产和研制将对实现其工业化生产、缩短产品成熟期、使产品特征标准化和安全化起重要作用,也是传统食品的发展方向[1,2]。浓缩发酵剂[1,3,4](特别是冻 干发酵剂)具有活力高、体积小、携带使用方便的特点,可直接用于发酵制品生产,省去扩大培养的复杂操作过程,从而简化产品生产工艺,有利于保持产品质量的稳定,防止菌种的退化和污染。 乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、高密度的培养[1,4]。高密 收稿日期:2004-02-25 基金项目:国家862自然科学基金资助项目(2002AA8041) 第5期2004年5月 中国调味品 CHINA CONDIMENT No.5M ay.2004
大肠杆菌的保存和培养
大肠杆菌的保存和培养 大肠杆菌, 培养, 保存 一．菌种的保存 重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。 通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌 1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。能够长期在研究上应用。 2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。 3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后vf fv 的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。 4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。 5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点 i. 甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌. ii. 使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。 二、菌种的复苏 复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。 切记：接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。 三、大肠杆菌培养 1.
布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化
56 2019, V ol.40, No.08食品科学※生物工程 布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化 刘开放，席志文，黄林娜，惠丰立* （南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳 473061） 摘?要：为实现布拉酵母高密度培养，对其高密度发酵培养基和发酵工艺进行优化。采用Plackett-Burman试验筛选培养基中的显著因素，并进行中心组合设计。通过人工神经网络（artificial neural network，ANN）和响应面试验建立菌体布拉酵母产量与培养基之间的关系模型，利用遗传算法（genetic algorithm，GA）进行全局寻优。结果表明，ANN模型有较好的数据拟合能力和预测能力，更适合处理复杂的非线性问题。GA优化获得最佳培养基组合：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米浆17.32 g/L、硝酸钾14 g/L、酵母营养盐1.5 g/L、磷酸二氢钾0.6 g/L、硫酸镁0.8 g/L。利用该培养基进行摇瓶培养，菌体布拉酵母产量可达到8.21 g/L，比优化前提高1.39 倍。在此基础上利用1 L发酵罐培养确定最佳发酵工艺：温度30 ℃、接种量10%、pH 5.0、溶氧40%。利用50 L发酵罐进行扩大培养，流加葡萄糖和蛋白胨控制发酵液中葡萄糖3 g/L、氨氮0.06 g/L，菌体布拉酵母产量达到51.21 g/L。 关键词：布拉酵母；神经网络；遗传算法；增殖培养基；高密度培养 Optimization of High Cell Density Fermentation of Saccharomyces boulardii for Enhanced Biomass Production LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, HUI Fengli* (College of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China) Abstract: For high cell density cultivation of Saccharomyces boulardii, we attempted to optimize medium composition and culture conditions. Plackett-Burman design was used to recognize the signi?cant medium components. Subsequently, response surface methodology and arti?cial neural network (ANN) based on central composite design (CCD) were applied to model the relationship between dry biomass production and medium composition. The optimization of medium composition was carried out using genetic algorithm (GA). The results showed that the ANN model, more suitable for complex and nonlinear modeling, had better goodness of ?t and prediction performance. The optimal medium composition was obtained as follows (g/L): glucose 40.52, peptone 36.8, corn steep liquor 17.32, KNO3 14, yeast nutrients 1.5, KH2PO4 0.6 and MgSO4 0.8 shake ?ask cultivation using the optimized medium gave a dry biomass yield of 8.21 g/L, which was 2.39 folds higher than that obtained from the original medium. Based on these results, we determined the optimal high cell density culture conditions for S. boulardii cultivated in a 1-L fermentor as follows: temperature 30 ℃, 10% inoculum, pH 5.0 and 40% dissolved oxygen. Furthermore, we scaled up the culture process in a 50-L fermentor with the addition of glucose and peptone to maintain the glucose concentration at 3 g/L and the ammonia nitrogen concentration at 0.06 g/L. The dry biomass yield of S. boulardii reached 51.21 g/L in the large scale experiment. Keywords: Saccharomyces boulardii; neural network; genetic algorithm; enrichment medium; high cell density fermentation DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323 中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2019）08-0056-07引文格式： 刘开放, 席志文, 黄林娜, 等. 布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化[J]. 食品科学, 2019, 40(8): 56-62. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323. https://www.360docs.net/doc/d813812318.html, LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, et al. Optimization of high cell density fermentation of Saccharomyces boulardii for enhanced biomass production[J]. Food Science, 2019, 40(8): 56-62. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-20180424-323. https://www.360docs.net/doc/d813812318.html, 收稿日期：2018-04-24 基金项目：国家自然科学基金面上项目（31570021） 第一作者简介：刘开放（1993—）（ORCID: 0000-0002-2575-893X），男，硕士，研究方向为发酵工程。 E-mail: liukaifang126@https://www.360docs.net/doc/d813812318.html, *通信作者简介：惠丰立（1965—）（ORCID: 0000-0001-6542-1525），男，教授，硕士，研究方向为食品微生物与发酵工程。 E-mail: hui?@https://www.360docs.net/doc/d813812318.html,